Hier präsentieren wir ein Protokoll mit RNA-Seq, um mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der hypoxischen Antwort von S. Cerevisiae Zellen zu überwachen. Diese Methode kann zu analysieren, gen-Expression in eine zelluläre Reaktion angepasst werden.
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Methodenartikel
Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Komplexe Änderungen in der Genexpression zu vermitteln in der Regel einen Großteil eine zelluläre Reaktion. Jedes Gen kann Ausdruck mit einzigartigen Kinetik ändern, da das Gen durch den bestimmten Zeitpunkt einer der vielen Reize, Signalisierung, Wege oder Nebenwirkungen geregelt ist. Um das gesamte gen einzufangen war Ausdruck Reaktion auf Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiae, RNA-Seq-Analyse verwendet, um die mRNA-Niveaus aller Gene zu bestimmten Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber Hypoxie zu überwachen. Hypoxie entstand durch wachsenden Zellen in ~ 100 % N2 Gas. Wichtig ist, wurden im Gegensatz zu anderen hypoxischen Studien, Ergosterin und ungesättigten Fettsäuren nicht zu den Medien hinzugefügt, da dieser Metaboliten Genexpression beeinflussen. Zeitpunkten wurden im Bereich von 0 - 4 h nach Hypoxie ausgewählt, weil damals die wichtigsten Änderungen in der Genexpression erfasst. Zu jedem Zeitpunkt Mitte Log hypoxische Zellen waren schnell gefiltert und eingefroren, Begrenzung der Exposition gegenüber O2 und damit einhergehende Veränderungen der Genexpression. Gesamt-RNS war aus Zellen extrahiert und verwendet, um bereichern für mRNA, die dann in cDNA umgewandelt wurde. Aus diesem cDNA Multiplex-Bibliotheken erstellt wurden und mindestens acht Proben wurden in einer Spur von einer nächsten Generation Sequenzer sequenziert. Eine Post-Sequenzierung Pipeline wird beschrieben, worunter Qualität Basis trimmen, Kartierung und Bestimmung der Anzahl der Lesevorgänge pro gen zu lesen. DESeq2 innerhalb der statistischen R-Umgebung wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die an einem hypoxischen Zeitpunkten wesentlich verändern. Analyse von drei biologische Wiederholungen zeigte hohen Reproduzierbarkeit, Gene der unterschiedlichen Kinetik und eine große Anzahl von erwartet O2-Gene reguliert. Diese Methoden können zur Untersuchung, wie die Zellen der verschiedenen Organismen auf Hypoxie im Laufe der Zeit reagieren und angepasst, um gen-Expression in anderen zellulären Reaktionen zu studieren.
Einleitung
Viele Organismen reagieren auf Hypoxie oder niedrigen O2, durch die Veränderung der gen-Expression- 1,-2,-3. Diese Antwort hilft Zellen, die mit dem Mangel an ein Substrat für die aerobe Atmung und für mehrere biosynthetischen Reaktionen von entscheidender Bedeutung, sondern auch mit einem wechselnden Redox-Zustand 4zu bewältigen. Mehrere Studien in S. Cerevisiae Microarray zeigen, dass die mRNA-Niveaus von Hunderten von Genen in Erwiderung auf Hypoxie 5,6,
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Protokoll
1. Induktion Hypoxie
- Einen Tag oder mehr vor der Hypoxie zeitlicher Verlauf: bereiten Sie den Brutkasten, Zell-Filter System, Vakuum, Gas-Tank, Fläschchen, Stopper, Glasröhren und Schlauch, wie in der Materialtabelle.
- Ort der N2 Tank, Inkubator, Vakuum und Filtersystem in unmittelbarer Nähe, schnelle Bearbeitung von Zellen aktivieren.
- Bereiten Sie sterile Flüssigmedien YPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glukose) durch Mischen der Komponenten in einer Glasflasche und Autoklavieren.
- Grundriss der Flaschen in den Inkubator.
Hinweis: Aus dem N-2 -Tank, der erste Kolben werden einen Wasser....
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Ergebnisse
Die Hypoxie zeitlichen Verlauf und RNA-Seq-Analyse wurden unabhängig dreimal durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der drei Wiederholungen zu untersuchen, wurde Genexpressionsdaten für alle Gene mit Principal Komponente Analysis (PCA) analysiert. Abbildung 2 zeigt, wie die Proben über die ersten beiden Hauptkomponenten verändern die 58,9 % der Variabilität darstellen. Diese Analyse ergab, dass jeder zeitlichen Verlauf ähnliche Veränderungen zeigt (wie durch.......
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Diskussion
In dieser Studie wurde die mRNA-Niveaus für alle Gene während Hypoxie in der Hefe S. Cerevisiaegemessen. Ziel war es, wie die globalen Veränderungen der Genexpression durch Wachstum in einer kontrollierten Umgebung in der Nähe von anoxischen analysieren. Mehrere Maßnahmen wurden ergriffen, um sicherzustellen, dass die hier beschriebene Methode sorgfältig kontrolliert und reproduzierbar war. Erstens Zellen einer genau definierten hypoxischen Umgebung ausgesetzt waren: 99,999 % N2 in rich-Media (YPD). A.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken der Lewis-Sigler-Institut für Integrative Genomics Sequenzierung Core Facility an der Princeton University für technische Beratung und RNA Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Rowan University und NIH NIGMS R15GM113187, M.J.H.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Geschlossener Trockeninkubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Auf 30 °C eingestellt. Passen Sie die Tür so an, dass ein Tygon-Rohr eindringen kann. Alternativ können Sie den New Brunswick G25 Inkubator verwenden, der einen Schlauchanschluss enthält. Verwenden Sie keinen Wasserschüttler unter freiem Himmel, da sich in den Röhrchen zwischen den Kolben Kondenswasser ansammelt und möglicherweise Kulturen kreuzkontaminiert. |
| Mikroanalyse-Filterhalter | Millipore | XX1002530 | 25 mm Durchmesser, Halterung aus Edelstahl, Nr. 5 perforierte Silikonstopfenhalterungen in Standard-125-ml-Filterkolben |
| Starkes Vakuum | Edwards | E-LAB 2 | Die " Haus" Das Vakuum kann zu schwach sein. Alternativ können Sie eine elektrisch betriebene tragbare Vakuumpumpe wie die hier aufgeführte verwenden. |
| 1.000-ml-Kolben | Als Vakuumfalle fungierend. | ||
| ~ 2 Fuß Längen dickwandiger Vakuumschlauch, Innendurchmesser 3/8 Zoll, Außendurchmesser 7/8 Zoll | Tygon | 38TT | Zwei Teile: Das erste verbindet das Vakuum mit der Falle und das zweite verbindet die Falle mit dem Filtersystem. |
| N2 | einer Reinheit von 99,999 %, >1.000 psi, mit einem Regler und einem Gasdurchflussregler | ||
| Autoklavierter 500-ml-Kolbenöffnung | mit Aluminiumfolie bedeckt. Einen für jeden Hefestamm. | ||
| Autoklavierte 250-ml-Kolben | Öffnungen, die mit Aluminiumfolie bedeckt sind. Einen für jeden Zeitpunkt plus zwei für Wasserfallen. | ||
| Kolbenstopfen (Größe 6, zwei Löcher mit 5 mm Durchmesser) | Sterilisiert mit 70% Ethanol. Eine für jeden Kolben. | ||
| Glasröhre, Länge 9 cm oder 17 cm, Innendurchmesser 2 mm, Außendurchmesser 5 mm | Sterilisiert mit 70% Ethanol. Zwei Röhrchen für jeden Kolben. In die Löcher jedes Stopfens stecken. Siehe Abbildung 1 für die Platzierung von 9- und 17-cm-Rohren. | ||
| ~25 cm Länge Kunststoffschlauch, Innendurchmesser 5 mm | Tygon | E-3603 | Ein Stück pro Kolben. Sterilisiert mit 70% Ethanol. |
| Sterile Filterscheiben | Millipore | HAWP02500 | 25 mm Durchmesser, 0,45 & Mikro; m Porengröße, eine für jeden Zeitpunkt |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL Küvetten | Zur Messung von OD600 (d. h. Zellkonzentration) | ||
| 50 mL sterile Zentrifugenröhrchen | Eine für jeden | ||
| Saubere und sterile Pinzette | |||
| Flüssiger Stickstoff | Zum Einfrieren von Zellen | ||
| säuregewaschene Kügelchen | Sigma | G8772 | Bei 4 &° halten; C für lysierende Zellen |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Für die Aufreinigung von RNA-Säulen |
| Qiagen RLT-Puffer Vorbereiten | durch Zugabe von 10 &; Mikro; L β-Mercaptoethanol pro 1 ml RLT-Puffer, bei 4 μC halten. | ||
| 2 ml-Entnahmeröhrchen | Qiagen | im Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | im Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | im Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I Lager- und Arbeitslösungen | Qiagen | 79254 | Das DNase I-Enzym wird als lyophilisiertes Pulver in einem Glasfläschchen geliefert. Injizieren Sie mit einer sterilen Nadel und Spritze 550 & micro; L RNase-freies Wasser (im Qiagen-Kit enthalten) in die Durchstechflasche. Mischen Sie, indem Sie die Flasche vorsichtig umdrehen. Um eine Denaturierung des Enzyms zu vermeiden, nicht wirbeln. Nehmen Sie diese Stammlösung mit einer Pipette aus der Durchstechflasche und lagern Sie sie im Gefrierschrank (-20 °; C) in Einmal-Aliquoten (80 & Mikro; L jeweils). Die Stammlösung sollte nicht aufgetaut und wieder eingefroren werden. |
| Puffer RDD | Qiagen | im Qiagen DNase Kit enthalten | |
| Eiskalte 2-ml-Röhrchen | Zum Lyse von Zellen während der RNA-Extraktion | ||
| Mixmühlen-Homogenisator | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Im Kühlraum aufbewahren |
| Bacto Pepton | BD | DF0118 | für flüssige YPD-Medien |
| Bacto Hefeextrakt | BD | DF0886 | für flüssige Medien YPD-Medium |
| Glukose Fisher | D16 | für flüssige YPD-Medien | |
| Qubit-Assay-Röhrchen | Thermo Fisher | Q32856 | zur Messung der Nukleinsäurekonzentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | zur Messung der Nukleinsäurekonzentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | zur Messung der Nukleinsäurekonzentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | zur Messung der Nukleinsäurekonzentration |
| Kommerzielles Elektrophoresesystem | Agilent | Bioanalyzer 2100 | zur Messung der Nukleinsäurequalität |
| Sequenzer der nächsten Generation | Illumina | HiSeq 2500 | für Sequenzierungsbibliotheken |
| automatisiertes Liquid-Handling-System | Wafergen | Apollo 324 | zur Erstellung Sequenzierungsbibliotheken |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | zur Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA |
| PrepX RNA SEQ für Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | zur Erstellung strangspezifischer Sequenzierungsbibliotheken aus Gesamt-RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, das den gzip-Befehl | enthält http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installiert vor TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (vor R Studio installiert) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (kostenlose Version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referenzen
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
