Technik der minimal-invasiven quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen für Induktion der linken Ventricular Hypertrophie

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, Schritt für Schritt beschreiben die Technik der minimal-invasiven quer Aortenstenose Verengung (TAC) bei Mäusen. Durch Beseitigung der Intubation und Belüftung sind obligatorisch für häufig verwendete Standardverfahren, minimal-invasive TAC das operative Vorgehen vereinfacht und reduziert die Belastung auf das Tier setzen.

Zusammenfassung

Transversale Aortenstenose Verengung (TAC) bei Mäusen ist eines der am häufigsten verwendeten chirurgischen Techniken für die experimentelle Untersuchung von Druck Überlast-induzierte Herzinsuffizienz linksventrikulären Hypertrophie (LVH) und seine Weiterentwicklung überlassen. In der Mehrzahl der gemeldeten Untersuchungen ist dieser Vorgang mit Intubation und Beatmung des Tieres das macht es anspruchsvoll und zeitraubend und fügt die chirurgische Belastung für das Tier. Das Ziel dieses Protokolls ist eine vereinfachte Technik der minimal-invasiven TAC ohne Intubation und Beatmung von Mäusen zu beschreiben. Wichtige Schritte der Technik werden betont, um geringe Mortalität und hohe Effizienz bei der Induktion von LVH zu erreichen.

Männlichen C57BL/6 Mäusen (10 Wochen alten, 25-30 g, n = 60) wurden mit einer einzigen intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin und Xylazin betäubt. Spontan atmen Tier nach einer 3-4 mm oberen teilweise Sternotomie, ein Segment von 6/0 Seide Naht durch das Auge einer Ligatur Beihilfe eingefädelt war unter den Aortenbogen übergeben und über einen abgestumpften 27-Gauge-Nadel gebunden. Sham-betrieben Tiere unterzog die gleiche OP-Vorbereitung, aber ohne Aortenstenose Verengung. Die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Induktion von LVH ist durch eine signifikante Zunahme der Herz/Körper-Gewichts-Verhältnis bescheinigt. Dieses Verhältnis erhält man bei 3, 7, 14 und 28 Tage nach der Operation (n = 6-10 in jeder Gruppe und jedem Zeitpunkt). Mit unserer Technik wird LVH TAC im Vergleich zum Schein Tiere von Tag 7 bis Tag 28 beobachtet. Operative und späten (über 28 Tage) Todesfälle sind beide mit 1,7 % sehr gering.

Zusammenfassend unsere kostengünstige Technik der minimal-invasiven TAC bei Mäusen führt sehr geringe operative und postoperative Sterblichkeit und ist hoch effizient bei der Induktion von LVH. Das operative Vorgehen vereinfacht und reduziert die Belastung auf das Tier setzen. Es kann einfach durchgeführt werden, indem Sie kritische Schritte in diesem Protokoll beschrieben.

Einleitung

In den letzten Jahren wurde die Studie an Herzversagen im durchgeführt lebensfähig Tiermodelle¹. Im Vergleich zu großen Tiermodellen der Herzinsuffizienz, haben kleiner Tiermodelle zahlreiche potenzielle Vorteile. Neben niedrigeren Kosten für Gehäuse und Wartung sind kleiner Tiermodelle für mehr Forscher aufgrund der weniger komplexen Einrichtungen benötigt²zugänglich.

Herzinsuffizienz Mausmodellen bieten viele der gleichen Vorteile wie die Ratte-Modelle. Zusätzlich zu reduzierten Gehäuse kostet³, Maus-Modelle profitieren von der Verfügbarkeit der relevanten transgenen und Knockout (KO)-Stämme. Die Möglichkeit der Zelle typspezifische, induzierbaren KO oder transgene Strategien machen der Maus ein unschätzbares Werkzeug, die Pathogenese der Herzinsuffizienz zu studieren und zu versuchen, neue therapeutische Schemata³identifizieren.

Unter der Maus Modelle der Herzinsuffizienz verwendet derzeit⁴, quer Aortenstenose Verengung (TAC), erstmals von Rockman^{5 beschrieben wurde,} ist das bevorzugte Modell erzeugen Druck Überlast-induzierte linken ventricular Hypertrophie (LVH)^{1 , 3}. der größte Vorteil dieses Modells ist die Möglichkeit, die Schichtung der LVH², obwohl ventrikuläre links Umbau in Reaktion auf TAC ist variabel zwischen verschiedenen Mausstämme. Insbesondere entwickeln C57BL/6 Mäusen schnelle LV-Dilatation nach TAC, die nicht mit anderen Stämmen^4,6,7auftreten können.

Das plötzliche Auftreten von Bluthochdruck mit TAC Ursachen erreicht eine ca. 50 % Zunahme der LV Masse innerhalb von 2 Wochen, damit die Aktivität der pharmakologischen oder molekulare Interventionen mit dem Ziel modulieren die Entwicklung des LVH⁴rasch prüfen. Die akute Induktion von schwerer Hypertonie durch TAC ist nicht genau reproduzieren der progressiven linken ventricular Hypertrophie und Umbau in der klinischen Einstellung der Aortenstenose oder arterielle Hypertonie beobachtet. Dennoch ist dieses Modell von vielen Forschern verwendet, um zu identifizieren und neue therapeutische Targets in Herzinsuffizienz⁴ändern.

TAC in Mäusen die Durchführung erfordert größere chirurgische Kompetenz als erforderlich für andere Techniken verwendet, um LVH und anschließende Herzinsuffizienz²induzieren. Die meisten Autoren führen Sie diesen Vorgang durch Sondenschaft und Belüften der tierischen^2,8, die macht dieses Verfahren mehr anspruchsvoll und zeitraubend und fügt die chirurgische Belastung für das Tier. Nur wenige Forscher haben in ihrer Studie mit kurzen Verweis auf den chirurgischen Eingriff^9,10,11minimalinvasive TAC verwendet.

Ziel dieses Protokolls ist es, Schritt für Schritt beschreiben eine vereinfachte und benutzerfreundliche Technik der minimal-invasiven quer Aortenstenose Verengung in den Mäusen, Hervorhebung der kritischen Phasen des Verfahrens. Anhand dieser wichtigen Schritte kann man diese Technik leicht durchführen.

Protokoll

männliche C57BL/6J Mäuse (10 Wochen, 25-30g, n = 60) werden in diesem Protokoll verwendet. Tiere erhalten humane Pflege im Einklang mit den Leitlinien formuliert durch das französische Ministerium der Landwirtschaft und der Hochschulbildung und Forschung, und alle Eingriffe gemäß Richtlinie des 24. November 1986 der Europäischen Gemeinschaft () 86/609/EWG) und die französischen Gesetze. Das Protokoll wurde genehmigt durch das " regionalen Ethik-Kommission für Tier-Experimente-CREMEAS " (#2016092816207606).

1. Vorbereitung für die Operation

1. pflegen die Mäuse für eine Woche nach Ankunft in der Tierstation auf einem 12h / 12h hell/dunkel-Zyklus Standardkäfige mit Lebensmitteln (für Details siehe Tabelle der Materialien) und Wasser zur Verfügung Anzeige Libitum.
2. Am Tag der Operation, legen Sie die Mäuse in einzelnen Käfigen ein paar Minuten vor der Induktion der Anästhesie, um keinen zusätzlichen Stress für das Tier zu vermeiden. Alle chirurgischen Instrumente am Tag vor der Operation sterilisieren.
3. Intra peritoneally eine einzelne Dosis von einer Mischung von Ketamin (51,4 mg/kg) und Xylazin (3,3 mg/kg) in Kochsalzlösung verdünnt zu injizieren (0,9 % NaCl).
4. Stellen Sie sicher, die Tiefe der Narkose durch das Fehlen der Reflex-Zeh-Retreat.
5. Hals und Brust des Tieres mit einem handelsüblichen Rasiermesser rasieren und desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit 70 % Alkohol.
6. Legen Sie das Tier Rückenlage auf einer sauberen Korken arbeiten und die Pfoten mit Klebeband fixieren.

2. Operation

1. Sterile OP-Technik ist im gesamten Verfahren verwendet. In einer spontan atmenden Tier, führen einen longitudinale Mittellinie zervikalen Einschnitt über 10 mm mit einem 11-Klinge-Messer von supra sternalen Kerbe in der Mitte Brust um aussetzen des Brustbeins ( Abbildung 1).
2. Die Schilddrüse durch die Übergabe einer 4/0 Monofile Polypropylen Aufenthalt Naht mit einem Crile-Wood Nadelhalter einfahren und kleben Sie es auf das Pad arbeiten.
3. Trennen unverblümt die Pre trachealen Muskeln durch Mikro-chirurgische Pinzetten, die Luftröhre aufzudecken.
4. Folie sanft die glatte Spitze gebogen mikrochirurgischen Pinzetten mit den geschlossenen Backen über die Luftröhre und hinter dem Brustbein.
5. Durch vorsichtig öffnen und schließen die Backen der glatten Spitze gekrümmte mikrochirurgische Zange durchführen eine stumpfe Dissektion unter die Pre trachealen Muskeln und hinter dem Brustbein der Pleura wegziehen.
6. Rechts supra clavicular Muskeln mit der glatt-Kreissägeblätter direkt Mikro-chirurgische Zange fassen und sanft die Brust des Tieres hochziehen.
7. Schieben Sie den minderwertigen Kiefer Knochen Nipper unter dem Brustbein und führen eine 3-4 mm oberen teilweise Sternotomie ( Abbildung 2). Den unteren Teil des Mini-Sternotomie leicht nach links lenken.
8. 7/0 Monofile Polypropylen Aufenthalt Naht von innerhalb, außerhalb durchlaufen die zweite Intercostalneuralgie Platz auf jeder Seite des Mini-Sternotomie, Mikro-chirurgische Nadel Halterung befestigen. Übernachten in der Nähe von Costo sternale Winkel zur Vermeidung von Verletzungen, Intercostalneuralgie und interne thorakalen Gefäße oder Rippenfell.
9. Der sternalen Kanten mit 7/0 Monofile Polypropylen Aufenthalt Nähte auf jeder Seite zu verbreiten und mit Klebeband an die Arbeit-Pad befestigen.
10. Sanft beiseite bewegen Pre trachealen Muskeln, mediastinale Fett und Thymus mit glatten Spitze gebogen mikrochirurgische Zange um den Aortenbogen unter Niedrigstrom-Vergrößerung (2-3x) zu visualisieren ( Abbildung 3). Seien Sie besonders vorsichtig, nicht zu berühren oder beschädigen der parietalen Pleura um Pneumothorax Entwicklung zu verhindern.
11. Setzen die Weichteile unter den Aortenbogen durch Zange ( Abb. 4 A) binden und sanft seinen Rachen zu verbreiten. Bereiten Sie einen Tunnel in das weiche Gewebe unter der Aortenbogen mit zweiten binden Zange durch sanft öffnen und Schließen der Kiefer in den Weichteilen.
12. Pass ein Segment von 6/0 Seide Ligatur durch das Auge einer Ligatur Beihilfe ( Abbildung 4 B) hielt in der linken Hand unter dem Aortenbogen eingefädelt und durch binden Zange hielt in der rechten Hand zwischen dem Ursprung der abrufen die linken und rechts innominate gemeinsame Halsschlagadern ( Abbildung 5).
13. 27-Gauge-Nadel auf eine Länge von 5 mm geschnitten und stumpf beidseitig durch Drücken sie mit einem Crile Nadelhalter. Die abgestumpften 27-Gauge-Nadel neben dem Aortenbogen ( Abbildung 6) mit glatt-Kreissägeblätter direkt Mikro-chirurgische Pinzetten und binden Sie die Naht eng um die Nadel und der Aorta zwischen links und rechts innominate gemeinsame Halsschlagader Arterien mit zwei binden Pinzette ( Abbildung 7). Um die Naht fest zu binden, führen Sie eine erste Doppelknoten, gefolgt von vier zusätzliche Knoten. Stellen Sie sicher, dass alle Knoten flach sind.
14. Nach Unterbindung, schnell aber vorsichtig zu entfernen, die Nadel um eine 0,4 mm Durchmesser Verengung zu erreichen und eine reproduzierbare quer 65-70 % Aortenstenose Verengung.
15. Suchen Sie nach Blutstillung des Weichgewebes rund um den Aortenbogen, der sternalen Kanten und Pre-trachealen Muskeln. Platzieren Sie resorbierbare blutstillende Gaze Nässen Blut beobachtet wird. 7/0 Monofile Polypropylen bleiben Nahtmaterial verwendet für die Verbreitung der sternalen Kanten entfernen.
16. Pass eine einfache 6/0 Monofile Polypropylen Naht mit einem Mikro-chirurgische Nadelhalter von außerhalb, innerhalb der linken zweiten Intercostalneuralgie Raum und dann von innen außerhalb der direkt zweite Intercostalneuralgie Raum. Übernachten in der Nähe von Costo sternale Winkel zur Vermeidung von Verletzungen, Intercostalneuralgie und interne thorakalen Gefäße oder Rippenfell.
17. Zusammenbringen der sternalen Kanten durch das Binden von 6/0 Monofile Polypropylen Naht mit einem Crile-Wood Nadelhalter.
18. Schließen die Haut mit einem 5/0 Monofile Polypropylen mit Naht in einer Schicht eine Crile-Wood Nadelhalter.
19. Führen Sie die Schein identisch zu der Verengung Operation aber ohne eine Naht in der Aorta zu binden.

3. Postoperative Erholung

1. die Tiere sehr genau beobachten. übertragen Sie die Maus in einen einzelnen Käfig und legen Sie es in Bauchlage.
2. Erlauben die Maus wieder unter ein wärmendes Licht bis voll wach (weniger als 1 h nach Induktion der Anästhesie).
3. 0,1 mg/kg von Buprenorphin injizieren für postoperative Analgesie, intraperitoneal. subkutane Injektionen von 0,1 mg/kg von Buprenorphin alle 8 h für die ersten drei Tage wiederholen, wie angegeben.
4. Legen die betriebenen Mäuse in Standardkäfige (maximal 3 Mäuse pro Käfig) und mindestens 2 Mäuse pro Käfig.

4. Herz-Ernte

1. am Tag der Analyse einschläfern die Maus mit einer Lösung von Ketamin 300 mg/kg und Xylazin 20 mg/kg in Kochsalzlösung durch intraperitoneale Injektion.
2. Zunächst das Blut von der minderwertigen Vena Cava zu ernten und dann durch die gleiche Linie spritzen 5 mL der Lösung von 2,6 mM EDTA in Kochsalzlösung.
3. Herzen zu ernten, entfernen Sie die Vorhöfe und Gewicht das Herz (linker und rechter Ventrikel ohne Atrien).
4. Links von der rechten Ventr trennenICLE mit dem Septum in den linken Ventrikel Teil übrig. Wiegen beide Gewebeproben und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.

Ergebnisse

Operative und späten überleben
Das operative überleben war sehr hoch, 98,3 % (59/60) für die gesamte Serie (TAC und Schein betrieben Tiere). Der nur operative Tod war durch eine Blutung Komplikation in einer Maus für Schein Betrieb geplant. Postoperative Überleben während des Beobachtungszeitraums von 28 Tagen war auch ausgezeichnet, von 98,3 % (58 von 59). Die nur späte postoperative Tod kam in eine TAC-Maus am Tag (D) 16, möglicherweise der kardialen Ursprungs.

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Diskussion

Das Ziel dieses Protokolls ist, eine schrittweise Darstellung der Operationstechnik für minimal-invasive quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen zu präsentieren. Ausführliche technische Beschreibung der transversalen Aortenstenose Verengung bei Mäusen wurde von anderen Autoren^2,8berichtet. Aber diese Ermittler operieren nach Intubation und Beatmung von Tieren. Die Verwendung von einen zusätzlichen Schritt der Intubation Beatmung erhöht die Komplexität und die Dau...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Operationsmikroskop	Olympus	SZX2-TR30
Rasierer	Rowenta	Nomad TN3650FO
Nähte:
Polypropylen 7/0	Ethicon	BV-1X
Polypropylen 6/0	BBraun	C0862061
Silk 6/0 Ligatur	FST	18020-60
Polypropylen 4/0	Ethicon	8683
Polypropylen 5/0	Ethicon	Z303
Medikamente:
Ketamin	Merial	Imalgè ne 1000, LBM154AD
Xylazin	Bayer	Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorphin	Ceva	Vetergesic, 072013
Instruments:
Knochenzange Feine	chirurgische Werkzeuge	16101-10
Ligatationshilfe	feine chirurgische Werkzeuge	18062-12
Bindezange	feine chirurgische Instrumente	18026-10
Nadelhalter Crile-Wood	feine chirurgische Werkzeuge	12003-15
Mikrochirurgische Zange	Feine chirurgische Werkzeuge	11003-12
Zange für die Mikrochirurgie	Feine chirurgische Werkzeuge	11002-12
Gewebezange	Feine chirurgische Werkzeuge	11021-12
Nadelhalter für die Mikrochirurgie	Feinchirurgische Werkzeuge	12076-12
Mikrochirurgische Schere	Feine chirurgische Werkzeuge	91501-09
Mayo-Schere	Feine chirurgische Werkzeuge	14511-15
Messer mit 11 Klingen	Fine Surgical Werkzeuge	10011-00<
strong>RNA-Extraktion und qPCR:
TriReagenz	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini-Kit	Qiagen	74704
Qubit Fluorimetrischer RNA-Assay	Fisher Scientific	10034622
RNA 6000 Nano-Kit	Agilent	5067-1511
cDNA-Kit mit hoher Kapazität	Fisher Scientific	10400745
Taqman Master Mix	Fisher Scientific	10157154
Taqman BNP-Primer	Fisher Scientific	Mm01255770_g1
Taqman ANP-Primer	Fisher Scientific	Mm01255747_g1
Taqman ACE Primer	Fisher Scientific	Mm00802048_m1
Taqman Col1a1 Primer	Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Taqman TGFb Primer	Fisher Scientific	Mm01178820_m1
Taqman Gapdh Primer	Fisher Scientific	Mm99999915_g1
ABIPrism  Thermocycler	Applied Biosystems	7000
Software:
GraphPad Prism	GraphPad	Prism 7
TierfutterAlleinfuttermittel
für erwachsene Ratten/Mäuse	Sicher	UB220610R