Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Zusammenfassung

Die Produktion von ATP durch Oxidative Phosphorylierung ist die primäre Funktion der Mitochondrien. Mitochondrien in den höheren Eukaryotes auch an cytosolischen Ca^{2 +} Pufferung und die ATP-Produktion in Mitochondrien kann durch intramitochondrial frei Ca^{2 +} Konzentration vermittelt werden. Ca^{2 +} Rückhaltevermögen kann als die Fähigkeit der Mitochondrien, Kalzium in der mitochondrialen Matrix zu behalten. Kumulierte intrazellulären Ca^{2 +} führt zu der Durchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran bezeichnet die Öffnung des mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), was dazu führt, das Austreten von Molekülen mit einer molekularen Gewicht weniger als 1,5 kDa. Ca^{2 +}-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Hier beschreiben wir zwei Tests untersuchen die Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien ausgelöst. Nach bestimmten Mengen von Ca^{2 +} werden hinzugefügt, können alle Schritte innerhalb eines Tages abgeschlossen und von einer Mikrotestplatte Leser aufgenommen. Somit können diese zwei einfachen und effektiven Assays ergriffen werden, um die Ca^{2 +}bewerten-mitochondriale Funktionen.

Einleitung

Mitochondrien sind die zellulären Hauptorgane, fast 95 % der verwendeten in den Säugetier-Zellen durch Oxidative Phosphorylierung ATP zu produzieren. Es wird berichtet, dass die abgesonderten mikromolaren Konzentration von Ca^{2 +} von Mitochondrien, die Anwesenheit von ADP und anorganischem Phosphat ADP zu ATP-Synthese¹phosphorylieren verwendet werden können. Wenn die Konzentration der cytosolischen Ca^{2 +} einen Schwellenwert überschreitet, Mitochondrien können Aufnahme Ca^{2 +} schnell und Ausfluss es langsam. So können die funktionierenden Mitochondrien Zustrom der erhöhten cytosolischen Ca^{2 +}. Irrelevant....

Protokoll

1. Isolation von Mitochondrien

Hinweis: Alle Lösungen und Geräte sollten auf 0 - 4 ° C vorgekühlt und auf Eis gehalten werden.

1. Samen etwa 3 x 10⁶ SH-SY5Y Zellen pro 10 cm Zelle Kulturschale. Zellkulturen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin (100 U/mL)-Streptomycin (100 µg/mL). Bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ über Nacht behalten.
   Hinweis: mindestens 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y Zellen für jedes Assay Isolierung erforderlich sind.
2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit etwa 1 mL Eis kaltem PBS in einer Kulturschale 1....

Ergebnisse

Ca^{2 +} Rückhaltevermögen Vertreter folgendes Ergebnis:
Die Ergebnisse wurden als Fluoreszenz-Werte. Mit der zusätzlichen Impulsen von Ca^{2 +} (200 Nmols/mg mitochondrialen Proteins), die Fluoreszenz durch doppelte über dem Ausgangswert mit der Eröffnung von mPTP erhöht. 5 μM Bongkrekate (BKA), ein Inhibitor von Ca^{2 +}-induzierte mPTP Öffnung oder 1 μM Atractyloside (ATR), Aktivator von Ca^{2 +}-induzierte mPTP Öffnung, wurden in den isolier.......

Diskussion

Wir beschrieben hier, ein einfaches und effektives Protokoll für die mitochondriale Ca^{2 +} Retention Kapazität Assay und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst.

Stellen Sie für die mitochondriale Isolierung sicher, dass alle Materialien und Rohre auf Eis, besonders wenn die Zellen zu homogenisieren. 0,25 % Trypsin-EDTA kann auch verwendet werden, um Zellen aus der Schale für 5 min bei 37 ° c zu lösen Nach 15-25 Schlägen ist es notwendig, die intakte Zellmembran un.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SH-SY5Y Zelllinie	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC-Nummer: CRL-2266
Calcium grün-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-bindender grüner Fluoreszenzfarbstoff
vollständige Proteaseinhibitoren	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
Glashomogenisator	Kimble Chase	9885303002
Glutamat	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malat	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan Blitzgeräte	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
Atractylosid	Sigma-Aldrich	C4992
Dulbecco mit hohem Glukosegehalt s modifiziertes Eagle Medium	Hyclone	SH30022	4,5 g/L Glukose, L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat
fötales Rinderserum	Hyclone	SV30087
Penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
Streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm Zellkulturschale	NEST	704001