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Methodenartikel

Mittels Laser-Doppler Imaging und Überwachung, Rückenmark Mikrozirkulation in der Ratte zu analysieren

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DOI:

10.3791/56243

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30. Mai 2018

 ,  ,  , 
1China Rehabilitation Research Center, 2Institute of Rehabilitation Science of China, 3Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders, 4Beijing Key Laboratory of Neural Injury and Rehabilitation

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Kombination aus Laser-Doppler-Perfusion imaging (LDPI) und Laser Doppler Perfusion Überwachung (LDPM) Wirbelsäule Messen lokale Blut fließt und der Sauerstoffsättigung (SO2), sowie ein standardisiertes Verfahren für die Einführung von Rückenmark Schnur Trauma auf Ratte.

Zusammenfassung

Laser-Doppler-Flowmetry (LDF) ist eine nicht-invasive Methode für Blut (BF) Durchflussmessung, wodurch es zur Messung der mikrozirkulatorischen Veränderungen des Rückenmarks vorzuziehen. In diesem Artikel war unser Ziel, Laser-Doppler-Bildgebung und Überwachung verwenden, um die Änderung der BF nach Verletzungen des Rückenmarks zu analysieren. Der Laser-Doppler Image-Scanner und die Sonde/Monitor wurden eingesetzt, um jede Anzeige zu erhalten. LDPI Angaben eine lokale Verteilung der BF, das gab einen Überblick der Perfusion um Verletzung Aufstellungsort und vergleichende Analyse der BF unter verschiedenen Standorten zugänglich gemacht. Durch die bohrenden Messfläche intensiv über einen Zeitraum von Zeit, wurde eine kombinierte Sonde zur simultane Messung von BF und Sauerstoffsättigung des Rückenmarks, zeigt insgesamt Rückenmark Durchblutung und Sauerstoffversorgung. LDF selbst hat ein paar Einschränkungen, z. B. relative Bewegung, Sensibilität für Bewegung und biologische NULL signal. Jedoch wurde die Technologie in klinischen und experimentellen Studie aufgrund seiner einfachen Installation und schnelle Messung der BF angewendet.

Einleitung

Das Gewebe des Rückenmarks ist stark vaskularisierte und extrem empfindlich gegen Hypoxie induziert durch Verletzung des Rückenmarks (SCI). Unsere früheren Studien zeigten, dass die Durchblutung des Rückenmarks nach Gehirnerschütterung Verletzung1,2, deutlich gesunken war, um das Defizit der motorischen Funktion in Zusammenhang stehen könnten. Neuere Studien haben gezeigt, dass die Integrität der Blutgefäße nach SCI gut korreliert mit der Verbesserung der sensorischen und motorischen Funktion3. Es wurde berichtet, dass verbesserte Vaskularität weißen Substanz, indirekt führt zu verbesserter Funktion4retten könnte. Daher schien die Aufrechterhaltung der posttraumatischen Rückenmark Perfusion von zentraler Bedeutung für die Erhaltung der Lebensfähigkeit und Funktionalität.

Die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf Perfusion nach SCI wurden von zahlreichen Forschern mit einer Vielzahl von Techniken in experimentellen Modellen SCI5,6,7untersucht. Laser-Doppler, als etablierte Technik, war zweifellos eine nützliche Methode zur Quantifizierung der Perfusion in mehrere Tier- und Humanstudien8,9,10,11. Die Technik basiert auf der Messung der Doppler-Verschiebung12 indem roten Blutkörperchen auf das leuchtende Licht induziert. Seit der Kommerzialisierung der Technik in den frühen 1980er Jahren hat große Fortschritte in der Lasertechnik, Faseroptik und Signalverarbeitung zur Messung der Perfusion durch Laser Doppler Instrumente13, erzielt die LDF in eine zuverlässige Technologie gemacht.

In der aktuellen Studie wurden beide Methoden der Laser-Doppler-Messung zur Beurteilung der Durchblutung (BF) in das Rückenmark von erschütternder Ratten angewendet. Aufgrund der nicht-invasive Art der Technologie und die einfache Einrichtung bietet unser Protokoll eine sensible, schnelle und zuverlässige Methode für BF Messungen des Rückenmarks. Noch wichtiger ist, ermöglicht diese Methode Längsschnittstudie von BF post erschütternder SCI ohne Tieropfer zu jedem Zeitpunkt.

Aufgrund der Fähigkeit, die BF des Gewebes und schnelle Wechsel der Perfusion während der Stimulation zu beurteilen ist es möglich, die Anwendung dieses Protokolls zu zerebralen BF14,15 zu bewerten sowie andere Gewebe wie Leber16, zu messen 17, Haut18,19und Darm20. In einem Rattenmodell der transienten Okklusion der mittlere zerebrale Arterie wurden die Laser-Doppler-Messungen zur richtigen Senkung des BF auf ein Niveau zu gewährleisten, die in den ischämischen Penumbra14erwartet werden. Bei Ratten, die kritische Extremität Ischämie (CLI) Induktion unterzogen wurden, wurde die Laser-Doppler scanning angewandt, um Hind Gliedmaßen BF vor und nach dem Eingriff CLI und in verschiedenen Zeiträumen nach Behandlung21beobachten. Darüber hinaus hing die Bioverfügbarkeit und metabolische Clearance von einigen Medikamenten von hepatischen BF, die durch LDF16entdeckt wurde. Daher könnte LDF in experimentellen Modell pharmakodynamische und pharmakokinetische Bewertung verbreitet werden.

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Protokoll

Tier-Protokolle mit Versuchstieren gefolgt von National Institute of Health (NIH) aufgestellten Richtlinien und von der Animal Care und Nutzung Ausschuss der Hauptstadt Medizinische Universität angenommen wurden.

Die Verfahren der Einführung von SCI und Messung der BF des Rückenmarks mit Laser Doppler Geräte beschrieben wurden in einer veröffentlichten Studie1verwendet.

1. Vorbereitung auf die Operation

  1. Pentobarbital-Natrium-Lösung 3 % (w/V) in Kochsalzlösung vorbereiten und verwalten in der Dosis von 35 mg/kg.
    Achtung: Pentobarbital-Natrium ist eine kontrollierte Substanz. Detaillierte Aufzeichnungen aufbewahrt werden und Lösungen in einem sicheren und verschlossenen Ort gespeichert.
  2. Ausrüstung zu sterilisieren und OP-Bereich vorzubereiten.
    1. Reinigen Sie das Chirurgie-Gerät mit den folgenden Schritten: 75 % Ethanol, Reinigung, dann Autoklaven bei 121 ° C für 30 min, dann in einem 60 ° C Ofen über Nacht trocken. Sterilisieren Sie die OP-Bereich mit 75 % Alkohol.

2. Vorbereitung der Ratte für Chirurgie

  1. Die Ratte eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (35 mg/kg) zu betäuben. Das gesamte Verfahren dauert 30-40 min einschließlich Operation, BF Messungen und Nähte.
  2. Rasieren Sie die dorsalen Bereich der Ratte aus dem unteren Rücken bis zum Hals. Das Haar sollte so kurz wie möglich geschnitten werden. Legen Sie die Ratte auf eine 40 ° C Heizkissen um die Körpertemperatur konstant zu halten.

(3) Laminektomie und die Erschütterung des Rückenmarks

Hinweis: Um Laminektomie nur zum Schein Gruppe ausführen, führen Sie Schritte 3.1 bis 3.6.

  1. Positionieren Sie die tierische dorsale Seite oben. Sterilisieren Sie die rasierten Teil mit Jod gefolgt von 75 % Alkohol mit sterilen Wattebällchen. Machen Sie einen Hautschnitt (4 cm) mit dem Skalpell über die Laminektomie-Website für Brustwirbel T7, T11.
  2. Geschnitten Sie die angeschlossenen Muskeln auf beiden Seiten aus T8 T10, setzen den Dornfortsätzen, die Schichten und der Facettengelenke.
  3. Verwenden Sie das Skalpell, um Einschnitte machen, die die Verbindung zwischen T10 und T11 trennen. Weiter aussetzen der Kreuzung durch sorgfältig durch sezieren die Muskelschicht entfernt um den Knochen freizulegen.
  4. Verwenden Sie die Schere weiter Muskel von der Lamina und um den Stiel mit kleinen Scheren löschen. Dies öffnet einen kleinen Raum zwischen den Wirbeln an T10 und T11 (Abbildung 1A). Langsam und vorsichtig einfügen Sie eine blutstillende Zange in diese Lücke und brechen Sie Knochenschrauben (Abbildung 1 b). Stellen Sie sicher, dass die Krümmung der Zange immer seitlich, Weg von der Schnur sitzt. Wiederholen auf der anderen Seite.
  5. Setzen Sie des Rückenmarks (Abbildung 1 aus) und heben Sie vorsichtig und brechen Sie der Lamina ab. Achten Sie darauf, dass keine freie oder gezackte Knochenfragmente hinter sich zu lassen.
  6. Wiederholen Sie den Vorgang, um weitere T9 und T8 Schichten entfernen.
  7. Verschieben Sie das Tier in der Impaktor-Ausrüstung-Tabelle und verwenden Sie das Paar von Adson Pinzette an die Tabelle angehängt, um das Tier Wirbelsäule zu stabilisieren, klemmend auf den Dornfortsatz T7 und T11, dann passen Sie die Zange um die Wirbelsäule (Abbildung 1).
  8. Setzen Sie das Tier unter den Impaktor, Ziel ist des Streik-Stabes in die Mitte des exponierten Rückenmark und senken die Rute auf innerhalb von 3-5 mm von der Oberfläche des Rückenmarks.
  9. Die Auswirkungen Parameter wie z. B. der fangstoss (160 KD) und Verweilzeit (1 s)
    1. Induzieren Sie die SCI "Experiment starten" klicken Sie auf die Software-Schnittstelle, dann klicken Sie "Ja" auf die folgende Schnittstelle die Auswirkungen automatisch gestartet. Nach dem Aufprall die Software zeigt die tatsächlichen Daten der Auswirkungen neben der eingestellten Parameter, überprüfen Sie die Daten, um sicherzustellen, dass es in der Nähe der Einstellung (Abbildung 1E) war.
      Hinweis: Ein typischen Zeichen für den Erfolg des Experiments war kurze Zeit unfreiwillige Tail Swing und Gliedmaßen Bewegung nach dem Aufprall. Reize am Schwanz Glied Reflexion überprüfen könnte auch durchgeführt werden. Bewegungsapparates Bewertung wie Basso, Beattie und Bresnahan (BBB) Bewegungsorgane Skala22,23 ist jedoch notwendig, um die Wirksamkeit der induzierten Verletzung festzustellen.

(4) Laser-Doppler Scanning

  1. Sehen Sie die Tabelle der Materialien für die Details des Laserscanners Doppler in dieser Studie verwendet. Um die exponierte Rückenmark zu scannen, Ort der Ratte dorsalen Seite nach oben auf eine schwarze, nicht reflektierende Hintergrund.
  2. Scan-Parameter eingerichtet: Öffnen Sie die Scan-Software zu, klicken Sie auf "Messen" geben die grafische Benutzeroberfläche von Messung und klicken auf die Schaltfläche "Scanner-Setup" die Scanner-Setup-Benutzeroberfläche geöffnet. Um Kleinflächen wie dieses Experiment zu scannen, wählen Sie "High Resolution" unter die "Scan-Größe und Anzeigeoptionen" für eine feine Scan-Modus mit höherer Auflösung (256 × 256 Punkte für 4 × 10 cm2) (Abbildung 2A). Klicken Sie auf "Scannen", um die Scan Umfänge (Abb. 2 b) zu überprüfen.
  3. Klicken Sie auf die Option "Video und Entfernung", das live-Videobild zu überprüfen. Positionieren Sie den Scanner 10-13 cm über den chirurgischen Fenster und bewegen Sie den Hintergrund mit dem Tier Center das exponierte Rückenmark im Scan-Fenster (Abbildung 2).
  4. Die Funktion "Auto entfernten" fein Scan Höhe einstellen, beachten, dass die Höhe des Scannens konsistent über alle Messungen im Experiment Abbildung 2gehalten werden sollte.
  5. Verwenden Sie eine reflektionsfrei Abdeckung mit einem Fenster um zu entlarven nur den OP-Bereich weiter zu minimieren Hintergrund und Markieren des Tieres Richtung.
  6. Klicken Sie auf "Wiederholen Sie Scan", legen Sie die Anzahl der Scans (in diesem Fall verwenden wir 8 wiederholten Scans), dann klicken Sie auf "OK", um der erneuten Scan-Schnittstelle öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" den Scanvorgang zu starten und der ganze Vorgang dauert ca. 3-4 min (Abb. 2D).

(5) Laser-Doppler Überwachung

  1. Wir haben einen Scanner-Monitor mit VP3 stumpfe Nadel Lieferung Prüfpunkt End Monitor BF und SO2 im Laufe der Zeit. Befestigen Sie die Laser-Doppler Sonde senkrecht zu einer stereotaktischen Instrument zum Einrichten der Überwachungsgeräte.
  2. Aufmachungen der Ratte an der dorsalen Seite der stereotaktischen Apparat, das Tier mit einem kleinen Stück Styropor, wenn notwendig, um die exponierte Rückenmark Ebene Unterlage.
  3. Senken Sie die Sonde des Rückenmarks zu Monitor BF.
    Hinweis: Schritt 5.3 ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit der Messung, da die Daten Lesungen auf der Sonde ausgeübte Druck empfindlich sind, daher ist besondere Vorsicht walten lassen, nicht über - oder unter - position der Sonde erforderlich.
    1. Untersuchen Sie die Inzision und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und Blut mit einer sterilen Wattepad.
    2. Verwenden das Gerät X und Y Achse um die Sonde bis 2 mm auf den Mittelpunkt des exponierten Rückenmarks rostral zu suchen oder Läsion zeigen und die zentrale Vene zu vermeiden.
    3. Verwenden Sie die Z-Achse, um die Sonde auf die bloße Berührung der Oberfläche des Rückenmarks Ebene langsam zu senken. Die Sonde sollte nur die Oberfläche des Rückenmarks sondern nicht so locker zu lassen jede helles Licht von der Seite der Kontaktstelle zu entkommen berühren.
  4. Datenaufzeichnung
    1. Öffnen Sie die Datenerfassungs-Software zu, klicken Sie auf die Schaltfläche "neues experiment" die Setup-Benutzeroberfläche geöffnet. Unter "Allgemein" Option für die Systemkonfiguration überprüfen und klicken Sie auf "Weiter" (Abbildung 3A), in den Display-Einstellungen wählen Sie den Kanal für BF und SO2 und klicken Sie auf "Weiter" (Abb. 3 b).
    2. Geben Sie Datei-Informationen und klicken Sie auf "Weiter" (Abbildung 3) geben das Data Recording Interface, klicken auf die grüne Dreieck-Taste zur Aufzeichnung von Daten von der Sonde (Abbildung 3D) zu starten.
    3. Sobald das Signal stabil, erfassen Daten für 8 aufeinander folgenden min ist. Dann heben Sie die Sonde und nehmen Sie das Tier vom stereotaktischen Apparat, Naht des Schnittes und das Tier in die postoperative Pflege.

(6) Nähte und postoperative Betreuung

  1. Naht den Schnitt: Naht Nadel in den Muskel auf beiden Seiten des Schnittes. Ziehen Sie den Faden durch das Gewebe an einem Strang, und deckt damit das exponierte Rückenmark an der Stelle der entfernten Schichten. Mit den Nadelhalter, ziehen Sie den ganzen Thread durch Form drei Quadrat Knoten und schneiden Sie den Faden als in der Nähe der Knoten wie möglich.
  2. Naht der Haut mit 3-4 Quadrat Knoten in die gleiche Weise wie den Schnitt Nähen, dann schneiden Sie die Fäden ca. 1 cm aus dem Knoten.
  3. Legen Sie die Ratte auf die Seite in seinem Käfig, Vermeidung des Kontakts zwischen der Chirurgie-Website und der Käfig unten. Käfige sollten auf Heizkissen gelegt werden.
  4. Überwachen Sie das Tier, bis er aus der Narkose erwacht zu gewährleisten keine postoperative Blutungen und die Nähte geschlossen bleiben.
  5. Subkutan Spritzen Sie Benzyl-Penicillin Natrium in Ratte für 3 Tage nach der Operation, 120 mg/kg pro Tag. Intraperitoneale Injektion Buprenorphin (0,05 mg/kg) unmittelbar nach der Operation und alle 6 Stunden nach der Operation für 1 Tag.
  6. Um sicherzustellen, dass Tiere Zugang zu ausreichend Nahrung und Wasser haben, passen Sie Trinkflaschen mit längeren Tüllen und setzen Sie essen in der Nähe das Tier in den Käfig.
    Hinweis: Wir führten BBB-Rating-Skala zur Bewertung der Megalosauridae Bewegungsorgane Funktion die Tiere 24 Stunden nach der Verletzung auszuschließende Tiere mit einem BBB-Wert größer als 0, damit sichergestellt wird, dass das Tier durch die induzierte Verletzung gelähmt war.
  7. Nach der Operation, ggf. manuelle leer der Harnblase durch sanft Druck auf den Bauch zweimal täglich vorsehen.

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Ergebnisse

LDPI wurde zur BF in das Rückenmark zu messen, die entlang der rostral-kaudalen Achse des Rückenmarks quantifiziert wurde, durch die Gewinnung von linearen Profilen (Abbildung 4). Abbildung 5A und 5 b Abbildung repräsentieren die Flux-Bildgebung des Rückenmarks von der Sham-Gruppe und SCI. Abbildung 5 und Abbildung 5 repräsentieren die Verän...

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Diskussion

Ein paar Details sollten beachtet werden, bei der Durchführung dieses Protokolls. Erstens sollte der Prozess der Anästhesie und Chirurgie möglichst schnell und elegant wie möglich an den eingeführten Stress für das Tier zu minimieren durchgeführt werden. Um Störungen zu den Ergebnissen zu verringern, halten Sie das Tier in einem relativ ruhigen und stabilen Zustand. Zweitens sollten mehr Aufmerksamkeit zu Blutungen während der Messung mit Laser-Doppler-Geräte, da Blut mit dem Lesen möglicherweise stören könnten. Zu guter...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Laser-Doppler-LinienscannerMoor InstrumentsmoorLDLS2
Laser-Doppler-MonitorMoor InstrumentsmoorVMS-LDF
Sonde für MonitorMoor InstrumentsVP3Stumpfe Nadelend-Einführsonde
ImpactorPrecision Systems and InstrumentationIH-0400
Phenobarbital-NatriumSigma-AldrichP3761
BuprenorphinSigma-AldrichB-908
SpritzeBecton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd300841
Chirurgische Nahtnadeln mit FadenShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd18T0329 (Chargennummer) /4-0
Fabrik für Skalpell-Operationsinstrumente von Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J11030 4 #
SkalpellklingeFabrik für Operationsinstrumente von Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J12130 20 #
Ophthalmische ZangeFabrik für Operationsinstrumente von Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.JD1040
Fabrik für hämostatische Pinzettenfür Operationsinstrumente von Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J31050
Benzyl-Penicillin-NatriumNorth China Pharmaceutical Co., LtdF6072116 (Chargennummer)
75 % AlkoholDezhou Anjie Gaoke Desinfektionsprodukte Co., Ltd150421R (Chargennummer)
JodShandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd20170102 (Chargennummer)
RatLaboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical SciencesSprague-Dawly (Rattenstamm)

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