Methodenartikel

Live-Darstellung der Brust Epithelzelle Migration nach der vorübergehenden Erschöpfung der TIP60

DOI:

10.3791/56248

⸱

7. Dezember 2017

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1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Ihnen die Echtzeit-Überwachung der Zellwanderung in einem Wundheilung Assay mit TIP60-abgereicherte MCF10A Brust Epithelzellen. Die Umsetzung des live-Zelle bildgebender Verfahren in unserem Protokoll erlaubt uns, Analyse und Visualisierung von einzelligen Bewegung in Echtzeit und über die Zeit.

Zusammenfassung

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Die Wundheilung Assay ist effizient und eine der günstigsten Möglichkeiten, um Zelle Migration in-vitro-Studie. Konventionell, Bilder sind am Anfang und Ende eines Experiments mit dem Phasenkontrast-Mikroskop genommen, und die Migration-Fähigkeiten der Zellen werden durch die Schließung der Wunden ausgewertet. Jedoch Zellbewegung ist ein dynamisches Phänomen und eine konventionelle Methode lässt sich nicht für die Verfolgung von einzelligen Bewegung. Um aktuelle Wundheilung Assays zu verbessern, verwenden wir Leben-Zelle bildgebende Verfahren Zellwanderung in Echtzeit zu überwachen. Diese Methode ermöglicht es uns, festzustellen, die Zelle Migrationsrate basierend auf eine Zelle, die tracking-System und bietet eine klarere Unterscheidung zwischen Zellwanderung und Zellproliferation. Hier zeigen wir den Einsatz von live Cell Imaging Wundheilung Assays, die unterschiedliche Migration Fähigkeiten der Brust Epithelzellen beeinflusst durch das Vorhandensein von TIP60 zu studieren. Wie Zelle Motilität sehr dynamisch ist, bietet unsere Methode weitere Einblicke in die Prozesse der Wundheilung als eine Momentaufnahme der Wundverschluss mit den traditionellen bildgebenden Verfahren zur Wundheilung Assays aufgenommen.

Einleitung

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HIV-Tat-interaktive Protein 60 kDa (TIP60) ist eine Lysin-Acetyltransferase, die Histone und nicht-Histonproteine1,2acetylate kann. Seine Funktionen befinden sich in mehrere Signalwege, einschließlich Transkription, DNA-Schäden reparieren und Apoptose1,3,4,5,6, Auswirkungen haben 7 , 8. Darüber hinaus TIP60 ist oft herunterreguliert bei Krebsarten, und die Herunterregulierung ist ....

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Protokoll

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1. Vorbereitung

  1. MCF10A Kulturmedium vorbereiten: Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) mit 5 % Pferd Serum, 20 ng/mL epithelialen Wachstumsfaktor, 0,5 mg/mL Hydrocortison, 100 ng/mL Cholera Toxin und 10 µg/mL Insulin.
  2. Bereiten Sie serumfreien Medium: DMEM/F12 (1:1) mit 20 ng/mL epithelialen Wachstumsfaktor, 0,5 mg/mL Hydrocortison 100 ng/mL Cholera Toxin und 10 µg/mL Insulin.
  3. Verwenden Sie die folgende SiRNA-Sequenz:
    SiControl:
    Vorwärts: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3 "
    Revers: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3 "
    siTIP60:
    Vorwärts: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3 "
    Revers: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3 "
  4. Verw....

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Ergebnisse

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Allgemeines Schema Live Cell Imaging-basierte Cell Migration Assay
Abbildung 1A ist ein Schema dieses Protokolls. MCF10A Zellen transfiziert mit SiControl zeigte typische epithelialen Morphologie. Nach der Erschöpfung der TIP60 waren MCF10A Zellen mehr mesenchymalen im Vergleich zu Kontrollzellen (Abbildung 1 b).

Prüfung der TIP60 Knockdown E.......

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Diskussion

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Es ist bekannt, dass in den Prozess der Zellwanderung, Zellen entweder Bewegung in Form von anhaftenden Blättern können; losen Cluster; oder einzelnen, isolierten Zellen. Den Modus und die Dynamik der Zellinvasion variieren von einem Zustand zum anderen, und der Phänotyp kann innerhalb von Stunden ändern. Die traditionelle Wundheilung Assay basiert auf Snapshot Bilder aus dem Mikroskop mit einer lange Zeit-Intervall, z. B. 12 oder 24 Stunden. Dies erschwert es, die Dynamik der Wundverschluss und das Muster der Zelle Bewe.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Wir danken die Mitgliedern des Ji-Labors für ihre hilfreiche Diskussion und Kommentare. S.J wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Research Foundation Singapur und das Singapur Bildungsministerium unter seine Forschungszentren der Exzellenzinitiative zu dem Krebs Science Institute of Singapore (R-713-006-014-271), der nationalen medizinischen Forschungsrat (CBRG-NIG; BNIG11nov001 und CS-IRG; R-713-000-162-511), akademische Forschungsfonds Bildungsministerium (MOE AcRF Stufe 1 T1-2012 Okt-04). Y.Z, G.S.C. und C.Y.T. wurden durch ein Post-graduate Fellowship von Krebs Science Institute of Singapore, National University of Singapore ausgezeichnet unterstützt.....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MCF10A-ZelleATCCCRL-10317TM
DMEM/F12-Medien für Brustepithelzellen (1:1)Gibco11330-032MCF10A-Kulturmedien
Epithelwachstumsfaktor (EGF)PeprotechAF-100-15Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
CholeratoxinSigma-AldrichC-8052Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
HydrocortisonSigma-AldrichH-0888Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
InsulinSigma-AldrichI-1882Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
HausserumGibco16050-122Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
TrypsinGibco25200-056Für MCF10A von der Platte
abnehmen HämazytometerFisher Scientific267110Für die Zellzählung
Opti-MEM Medium mit reduziertem SerumGibco31985-070Für siRNA-Gemisch
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies56532Transfect Reagenz
Trizol ReagenzInvitrogen/Life Technologies15596-026Für mRNA-Extraktion
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad170-8891Für cDNA Generation
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5125Für real time qPCR
7500 Schnelles Real Time PCR SystemBiosystemsReal time qPCR Mechine
10-cm SchaleGreiner bio-one664160Für Knockdown-Experimente
24-Well-PlatteCellstar662160Für Wundheilungsassay
siControl siRNASelf designedSelf designedCGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNASelf designedUGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Live cellZeissZeiss invertted Cell Observer für Lebendzellexperimente
observer

Referenzen

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  1. Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
  2. Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B.

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Schlagwörter

Live Zell ImagingWound Healing AssayTIP60 DepletionBrustepithelzellensiRNA BehandlungPhasenkontrastmikroskopieCell Tracking Systemepitheliale mesenchymale TransitionEchtzeit Imaging

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