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Methodenartikel

Live-Darstellung der Brust Epithelzelle Migration nach der vorübergehenden Erschöpfung der TIP60

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DOI:

10.3791/56248

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7. Dezember 2017

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1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen die Echtzeit-Überwachung der Zellwanderung in einem Wundheilung Assay mit TIP60-abgereicherte MCF10A Brust Epithelzellen. Die Umsetzung des live-Zelle bildgebender Verfahren in unserem Protokoll erlaubt uns, Analyse und Visualisierung von einzelligen Bewegung in Echtzeit und über die Zeit.

Zusammenfassung

Die Wundheilung Assay ist effizient und eine der günstigsten Möglichkeiten, um Zelle Migration in-vitro-Studie. Konventionell, Bilder sind am Anfang und Ende eines Experiments mit dem Phasenkontrast-Mikroskop genommen, und die Migration-Fähigkeiten der Zellen werden durch die Schließung der Wunden ausgewertet. Jedoch Zellbewegung ist ein dynamisches Phänomen und eine konventionelle Methode lässt sich nicht für die Verfolgung von einzelligen Bewegung. Um aktuelle Wundheilung Assays zu verbessern, verwenden wir Leben-Zelle bildgebende Verfahren Zellwanderung in Echtzeit zu überwachen. Diese Methode ermöglicht es uns, festzustellen, die Zelle Migrationsrate basierend auf eine Zelle, die tracking-System und bietet eine klarere Unterscheidung zwischen Zellwanderung und Zellproliferation. Hier zeigen wir den Einsatz von live Cell Imaging Wundheilung Assays, die unterschiedliche Migration Fähigkeiten der Brust Epithelzellen beeinflusst durch das Vorhandensein von TIP60 zu studieren. Wie Zelle Motilität sehr dynamisch ist, bietet unsere Methode weitere Einblicke in die Prozesse der Wundheilung als eine Momentaufnahme der Wundverschluss mit den traditionellen bildgebenden Verfahren zur Wundheilung Assays aufgenommen.

Einleitung

HIV-Tat-interaktive Protein 60 kDa (TIP60) ist eine Lysin-Acetyltransferase, die Histone und nicht-Histonproteine1,2acetylate kann. Seine Funktionen befinden sich in mehrere Signalwege, einschließlich Transkription, DNA-Schäden reparieren und Apoptose1,3,4,5,6, Auswirkungen haben 7 , 8. Darüber hinaus TIP60 ist oft herunterreguliert bei Krebsarten, und die Herunterregulierung ist korreliert mit Krebsmetastasen und schlechten Überlebensraten9,10,11,12, 13,14. Tumor Metastasen ist die Hauptursache von Krebs-Todesfälle. Es ist ein mehrstufiger Prozess, und der erste Schritt der Metastasierung beinhaltet die Migration und Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe15,16. Um dies zu tun, Tumorzellen zuerst müssen aus der Masse der Primärtumor, entweder in Form von einem Kollektiv eindringenden Zelle Blatt lösen oder losgelöst als Einzelzellen17. Während dieses Prozesses werden Tumorzellen oft epithelialen, mesenchymale Transition (EMT), was zu Veränderungen in der Morphologie und Zelle Adhäsion Fähigkeit17,18unterzogen.

Ein paar Techniken wurden entwickelt, um die Migration zu studieren und Invasion Fähigkeit von Tumor-Zellen in Vitro. Unter ihnen ist die Wundheilung Assay die effiziente und kostengünstige19. Zunächst beinhaltet diese Methode die Schaffung einer künstlichen Lücke auf eine konfluierende Monolage von Zellen, wodurch die Zellen zu migrieren und die Lücke zu schließen. Zweitens können Bilder der Lücken am Anfang und Ende des Experiments erfasst werden. Schließlich wird ein Vergleich der Lückenschluss zur Bestimmung des Zellmigration. Phasenkontrast-Mikroskop wird in der Regel verwendet, um Bilder für konventionelle Wundheilung Assays zu erfassen. Ein weiterer Vorteil der Wundheilung Test ist, dass es teilweise in Vivo Tumor Zellwanderung ähnelt. Ebenso zeigt Zellwanderung in Wundheilung Assays zur in-Vivo Tumor Metastasen der kollektiven Migration der epithelialen Blätter und die Migration von freistehenden Einzelzellen.

Allerdings Zellwanderung ist bekannt, dass dynamische, und gibt es eine Notwendigkeit, die Bewegung der Zellen in Echtzeit zu dokumentieren. Zum Beispiel erlaubt ein konventionelle Wundheilung Assay kein Forscher, einzelne Zelle Bewegung zu analysieren. Auf der anderen Seite sind Zellen kultiviert für Wundheilung Assays oft Serum-verhungert, Zellproliferation hemmen. Dies soll der Lückenschluss durch Zellproliferation nicht ausschließen. Dennoch, es werden einige Proliferation und Zelltod und Phasenkontrast-Aufnahmen vor und nach das Experiment sind nicht in der Lage zu unterscheiden.

Das Leben-Zelle bildgebende Verfahren befasst sich mit dieser Einschränkung von konventionellen Wundheilung Assays. Mit einem live-Imaging Mikroskop kombiniert mit einer CO2 Inkubator und entsprechende Temperierung, können Forscher messen die Lückengröße und Steuersatzes Schließung im Laufe der Zeit während der Verfolgung der Bewegung aktiv Migration Zellen befindet sich an den Spitzen der invasive vorne. Daher die Umsetzung von live-Cell imaging zur Überwachung der Zellwanderung bieten nicht nur bessere Visualisierung der Zellwanderung, sondern ermöglicht es auch die Möglichkeit zur Unterscheidung Zellwanderung und Zellproliferation, wodurch eine mehr zuverlässige Analyse der Zellmigration.

In dieser Studie wurden MCF10A Brust Epithelzellen zur Kombination der Wundheilung Assay und live-Cell imaging zur Untersuchung der Rolle von TIP60 in Zelle Migration zu demonstrieren. Die Erschöpfung der TIP60 führt zu zunehmenden Migration Fähigkeiten in den MCF10A Zellen.

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Protokoll

1. Vorbereitung

  1. MCF10A Kulturmedium vorbereiten: Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) mit 5 % Pferd Serum, 20 ng/mL epithelialen Wachstumsfaktor, 0,5 mg/mL Hydrocortison, 100 ng/mL Cholera Toxin und 10 µg/mL Insulin.
  2. Bereiten Sie serumfreien Medium: DMEM/F12 (1:1) mit 20 ng/mL epithelialen Wachstumsfaktor, 0,5 mg/mL Hydrocortison 100 ng/mL Cholera Toxin und 10 µg/mL Insulin.
  3. Verwenden Sie die folgende SiRNA-Sequenz:
    SiControl:
    Vorwärts: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3 "
    Revers: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3 "
    siTIP60:
    Vorwärts: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3 "
    Revers: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3 "
  4. Verwenden Sie 10 cm Zelle Kultur Gerichte und 24-Well Platten.

(2) vorübergehende Erschöpfung der TIP60 mittels siRNA

  1. Am 1. Tag aliquoten 15 µL Transfection Reagens (z. B. Lipofectamine RNAiMAX) und 2 mL Serum Medium (z. B. Opti-MEM) reduziert und mischen sie mit 10 µL jeder SiRNA (10 µM bestand), beziehungsweise.
  2. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min.
  3. Samen Sie 1 x 106 MCF10A Zellen zusammen mit 3 mL Kulturmedium in einer 10 cm Petrischale. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
  4. Die 10 cm Teller die SiRNA Mischung tropfenweise hinzufügen.
  5. Schütteln Sie das Gericht um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind, bevor man sie in den Inkubator 37 ° C.
  6. Ersetzen Sie nach 6 h Inkubation die SiRNA-haltigen Medium mit 8 mL frisches Kulturmedium.
  7. Am 2. Tag bereiten Sie eine weitere Gruppe von SiRNA-Mischungen und inkubieren sie bei Raumtemperatur für 20 min.
  8. Aspirieren Sie, 8 mL Kulturmedium hinzugefügt am Tag 1 und ersetzen Sie es mit 3 mL frisches Nährmedium.
  9. Die zweite Gruppe von SiRNA-Mischung zu den Speisen tropfenweise hinzufügen. Schütteln Sie die Gerichte um sicherzustellen, dass die Reagenzien vollständig gemischt werden, bevor man sie in den Brutkasten.
  10. Ersetzen Sie nach 6 h die SiRNA-haltigen Medium mit 8 mL frisches Kulturmedium.

(3) Samenzellen für die Wundheilung Assay

  1. Am 3. Tag entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer zu. Entsorgen Sie die PBS-Puffer.
  2. Trypsinize SiControl und siTIP60-behandelten Zellen durch Zugabe von 1 mL 1 x Trypsin-EDTA Puffer auf den Teller. Steckte es wieder in den Inkubator für 20 Minuten.
  3. Jede Platte 4 mL komplette Kulturmedium hinzu, Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren, und übertragen Sie sie auf eine 15-mL-Tube.
  4. 200 g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
  5. Wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit 5 mL serumfreien Medium und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
  6. Bereiten Sie eine Zellsuspension von 6 x 105 Zellen/mL für die SiControl und siTIP60; Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut gemischt sind. Geben Sie 500 µL Zellsuspension in einer 24-Well-Platte zu 100 % Konfluenz zu gewährleisten. Samen Sie 5 bis 6 Brunnen für SiControl und siTIP60.
  7. Schütteln Sie die Platte hin und her und dann nebeneinander auf gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Vermeiden Sie eine Kreisbewegung. Lassen Sie die Platte in den Inkubator für 24 h.
  8. Ernten Sie die verbleibenden Zellen um die Knockdown Effizienz der TIP60 überprüfen. Dies zu tun, die restlichen Zellsuspension bei 200 g für 5 min Zentrifugieren den Überstand zu entfernen.
  9. Isolieren Sie RNA mit einer kommerziellen Reagenz nach Protokoll des Herstellers, zu und fahren Sie mit Real-time quantitative PCR, Knockdown Effizienz zu bewerten.

4. Legen Sie die Wunde

  1. Überprüfen Sie unter dem Phase-Kontrast-Mikroskop um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig befestigt sind. Die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten (4 X, 10 X und 20 X Vergrößerung), um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig befestigt sind, dass eine konfluierende Monolage von Zellen gebildet hat.
    Hinweis: SiControl Zellen legen in der Regel besser als siTIP60 Zellen. Dies wird erwartet, da die Erschöpfung der TIP60 den Zellen mehr mesenchymalen-wie20macht. Hier wird eine normale Benchtop Weißlicht-Phase Kontrast Mikroskop verwendet.
  2. Um die Wunde zu generieren, sanft Kratzen einer geraden Linie quer durch die Mitte des Brunnens mit einer Pipettenspitze 200 µL; die Länge der Wunde erzeugt ist identisch mit dem Durchmesser des Brunnens. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle übrigen Brunnen. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze für jedes gut.
  3. Vorsichtig waschen, jeweils gut 5 Mal mit serumfreien Medium um freistehenden Zellen zu entfernen.
  4. Fügen Sie 1 mL serumfreien Medium in jede Vertiefung und fahren Sie mit live Cell Imaging.

5. Setup Live Cell Imaging

  1. Schalten Sie das Mikroskop und die Kontrolle der Temperatur mindestens 1 h vor dem Einrichten von live Cell imaging um sicherzustellen, dass die Temperatur in der Kammer 37 ° c erreicht
  2. Schalten Sie die Gaszufuhr Kohlendioxid (CO2) vor Beginn der live-Cell-Imaging. Einstellen der CO2 -Konzentration auf 5 %.
  3. Platzieren Sie die 24-Well-Platte auf der Bühne des Mikroskops und wählen Sie das Objektiv mit 10 X Vergrößerung für die Bildgebung. Direkt das emittierte Licht auf die Okulare anstelle der Kamera und stellen Sie den Fokus auf die Wunde und die umgebenden Zellen zu finden.
    Hinweis: In diesem Fall wurde weißes Licht mit Phasenkontrast verwendet.
  4. Verwenden Sie ein live-Cell Observer System, markieren Sie die Position der Wunde in jede Vertiefung.
    Hinweis: Der automatisierte Teil der live-Cell-imaging-System ermöglicht für die Bildaufnahme an mehreren Positionen. Bilder werden auf jeder markierten Position einmal jedes Intervall aufgenommen.
  5. Richten Sie den Zustand der Zeit: 1 h-Intervall und 72 h Dauer; gemäß dieser Einstellung wird das System an jede markierte Position jede Stunde für 72 h richten Sie jede gewünschte Zeitintervall und Zeitraum für die Überwachung fotografieren.
    Hinweis: Hier ist eine Dauer von 72 h am besten weil diese Zellen sterben nach 72 h in serumfreien Medium zu starten.

6. Verfolgung einzellige Bewegung

  1. Exportieren Sie die Daten nach 72 h. exportieren Sie die Daten als Bilder im JPEG-Format sowie Videos im AVI-Format.
    Hinweis: Dies ist wichtig, weil ImageJ Software nur Videos im AVI-Format erkennen kann. Die andere Zelle Migration Geschwindigkeiten zwischen siTIP60 und SiControl Zellen können deutlich im Video zu sehen.
  2. Öffnen Sie die AVI-Video in der ImageJ-Software.
  3. Öffnen Sie das MTrackJ-Plugin (das Plugin heruntergeladen und installiert werden muss separat): Plugins > MtrackJ.
  4. Fügen Sie eine Spur für einzelne Zellen ausgewählt aus dem Video durch Klicken auf die Registerkarte "Hinzufügen" in der MtrackJ-Symbolleiste hinzu. Wählen Sie eine Zelle an der Spitze der invasiven Front und eine Zelle, die auf eigene migriert werden kann (einzellige Migration). Folgen der Bewegung der ausgewählten Zellen auf das Video und sie verfolgen mit MtrackJ.
  5. Messen Sie den Abstand der Bewegung, indem Sie auf die Registerkarte "Maßnahme" auf der Symbolleiste.
    Hinweis: Hier zog fast keine Zellen in der SiControl als Einzelzellen, macht es schwierig, einzellige Bewegung zu messen, während viele der siTIP60 Zellen als Einzelzellen verschoben. Jedoch kann die Bewegung der Zellen invasive vorne noch verfolgt und in SiControl und siTIP60 Zellen berechnet werden.
  6. Speichern Sie das Video mit den Tracks im AVI-Format.

(7) Quantifizierung der Zelle Migration Fähigkeit

  1. Wählen Sie für die Quantifizierung um 0 Uhr und Bilder mit "n" h, wo "n" die Timepoint bezieht, wenn entweder die siTIP60 oder SiControl Zellen die Wunde vollständig geschlossen haben.
    Hinweis: Hier wurde 48 h gewählt, da die Wunden in siTIP60 Zellen fast vollständig geschlossen waren.
  2. Quantifizieren die prozentuale Migration mit ImageJ mithilfe der folgenden Formel: (Bereich der Wunde um 0 Uhr - Wunde "n" h) / Wunde bei 0 h x 100.

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Ergebnisse

Allgemeines Schema Live Cell Imaging-basierte Cell Migration Assay
Abbildung 1A ist ein Schema dieses Protokolls. MCF10A Zellen transfiziert mit SiControl zeigte typische epithelialen Morphologie. Nach der Erschöpfung der TIP60 waren MCF10A Zellen mehr mesenchymalen im Vergleich zu Kontrollzellen (Abbildung 1 b).

Prüfung der TIP60 Knockdown E...

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Diskussion

Es ist bekannt, dass in den Prozess der Zellwanderung, Zellen entweder Bewegung in Form von anhaftenden Blättern können; losen Cluster; oder einzelnen, isolierten Zellen. Den Modus und die Dynamik der Zellinvasion variieren von einem Zustand zum anderen, und der Phänotyp kann innerhalb von Stunden ändern. Die traditionelle Wundheilung Assay basiert auf Snapshot Bilder aus dem Mikroskop mit einer lange Zeit-Intervall, z. B. 12 oder 24 Stunden. Dies erschwert es, die Dynamik der Wundverschluss und das Muster der Zelle Bewe...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken die Mitgliedern des Ji-Labors für ihre hilfreiche Diskussion und Kommentare. S.J wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Research Foundation Singapur und das Singapur Bildungsministerium unter seine Forschungszentren der Exzellenzinitiative zu dem Krebs Science Institute of Singapore (R-713-006-014-271), der nationalen medizinischen Forschungsrat (CBRG-NIG; BNIG11nov001 und CS-IRG; R-713-000-162-511), akademische Forschungsfonds Bildungsministerium (MOE AcRF Stufe 1 T1-2012 Okt-04). Y.Z, G.S.C. und C.Y.T. wurden durch ein Post-graduate Fellowship von Krebs Science Institute of Singapore, National University of Singapore ausgezeichnet unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MCF10A-ZelleATCCCRL-10317TM
DMEM/F12-Medien für Brustepithelzellen (1:1)Gibco11330-032MCF10A-Kulturmedien
Epithelwachstumsfaktor (EGF)PeprotechAF-100-15Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
CholeratoxinSigma-AldrichC-8052Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
HydrocortisonSigma-AldrichH-0888Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
InsulinSigma-AldrichI-1882Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
HausserumGibco16050-122Nahrungsergänzungsmittel für MCF10A-Kulturmedien
TrypsinGibco25200-056Für MCF10A von der Platte
abnehmen HämazytometerFisher Scientific267110Für die Zellzählung
Opti-MEM Medium mit reduziertem SerumGibco31985-070Für siRNA-Gemisch
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies56532Transfect Reagenz
Trizol ReagenzInvitrogen/Life Technologies15596-026Für mRNA-Extraktion
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad170-8891Für cDNA Generation
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5125Für real time qPCR
7500 Schnelles Real Time PCR SystemBiosystemsReal time qPCR Mechine
10-cm SchaleGreiner bio-one664160Für Knockdown-Experimente
24-Well-PlatteCellstar662160Für Wundheilungsassay
siControl siRNASelf designedSelf designedCGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNASelf designedUGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Live cellZeissZeiss invertted Cell Observer für Lebendzellexperimente
observer

Referenzen

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