Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

Zusammenfassung

Eine einfache und effiziente Mikroinjektion Protokoll zur gen Bearbeitung im Channel Catfish Embryonen mit dem CRISPR/Cas9-System wird vorgestellt. In diesem Protokoll führen RNAs und Cas9 Protein wurden in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert. Dieses Protokoll wurde bestätigt durch zwei Channel Catfish immunvermittelte Gene ausschlagen.

Zusammenfassung

Das komplette Genom von der Kanal-Wels Ictalurus Punctatus, wurde sequenziert, führt zu größeren Möglichkeiten für Channel Catfish Genfunktion zu studieren. Gen Knockout wurde verwendet, um diese gen Funktionen in Vivozu studieren. Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System ist ein mächtiges Werkzeug zum Bearbeiten von genomischer DNA-Sequenzen um Genfunktion zu ändern verwendet. Während der traditionelle Ansatz CRISPR/Cas9 mRNA in die einzelne Zelle Embryonen durch Mikroinjektion einbringen wurde, kann dies ein langsamer und ineffizienter Prozess in Wels. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion Channel Catfish Embryonen mit CRISPR/Cas9 Protein beschrieben. Kurz, Ei- und Samenzellen wurden gesammelt und dann künstliche Befruchtung durchgeführt. Befruchtete Eizellen wurden in einer Petrischale mit Holtfreter Lösung überführt. Injektionsvolumen war kalibriert und dann leiten RNAs/Cas9 Ausrichtung, die die Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM 1) gen und Rhamnose Bindung Lektin (RBL) gen in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert waren. Die gen-Knockout war erfolgreich, DNA-Sequenzierung Indels bestätigt wurden. Die vorhergesagte Protein Sequenz Veränderungen durch diese Mutationen enthalten Frameshift und Proteins wegen vorzeitigen Stopp-Codons abgeschnitten.

Einleitung

Mikroinjektion ist eine verbreitete Labortechnik verwendet, um eine kleine Menge einer Substanz wie DNA, RNA, Proteine und andere Makromoleküle in Zellen oder Embryos durch eine Glas-Kapillare-¹liefern. Mikroinjektion wird mit Sonderausstattung Einrichtung einschließlich einer Microinjector, Mikromanipulator und Mikroskop²durchgeführt. Die Technik wurde von den Forschern verwendet, um genetisch zu verändern viele Organismen durch die Generierung von gentechnisch veränderten Pflanzen, gen-Knockouts und Gentherapie, mit dem Ziel, Verständnis der Dynamik von intrazellulären Komponenten^3,

Protokoll

Dieses Experiment wurde durchgeführt am Fisch Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Auburn University, AL. Alle experimentelle Protokolle in diesem Experiment verwendet wurden von der Auburn University institutionelle Animal Care und Use Committee (AU-IACUC) genehmigt, bevor das Experiment ins Leben gerufen wurde. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der Geräte und Zubehör in diesem Experiment verwendet. Im folgenden sind die Schritte und Verfahren für die Vorbereitung und Mikroinjektion Channel Catfish einzelligen Embryonen, wie in Abbildung 1dargestellt.

1. Brut Aktienauswahl un....

Ergebnisse

Um die Effizienz des Protokolls Mikroinjektion zu demonstrieren, wurden entwickelt, um den Channel Catfish Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose Bindung Lektin (RBL) gen Ziel gRNAs mikroinjiziert.

TICAM 1
DNA-Sequenzierung von Vektoren aus einzelnen Kolonien von aggregiert, geklonten PCR-Produkte ergab die Indel Mutationen in TICAM 1 gen induziert. Die Mutations.......

Diskussion

Ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion Channel Catfish Embryonen gen Knockout zu erreichen wurde vorgestellt. Injektion von CRISPR/Cas9 Eiweiß im Eigelb ist viel einfacher, spart Zeit und erfordert keine umfangreiche Ausbildung im Vergleich zu microinjecting die Blastodisc der einzelligen Embryonen, die die gängige Methode für die meisten Gentransfer und gen-Bearbeitung mit Fisch ist ^{30 , 42}. das aktuelle Protokoll erwies sich als erfolgreich bei der .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reproboost-Implantat	Zentrum für Marine Biotechnologie		Luteinisierendes Hormon-Releasing-Hormon-Analogon (LHRHa) zur Induktion des Eisprungs bei weiblichen Kanalwelsen
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		Zur Sedierung von Brutstockfischen während der Hormoninjektion und des Eistreifens.
Phenolrot	Sigma-Aldrich	P0290	0,5%, steril gefiltert
Stereomikroskop	Olympus	213709	Zur Visualisierung der Eier während der Mikroinjektion
Mikroinjektor	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Modell MPPI-3	Für die Abgabe des Injektionsmaterials in die Embryonen
Mikromanipulator	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Modell MM33	Zum Halten und Steuern der Bewegung der Injektionsnadel.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	Zum Laden von Injektionslösung in Mikroinjektionsnadeln.
Vertikaler Nadelabzieher	David Kopf Instruments	Modell 720	Zum Ziehen von Mikroinjektionsnadeln
Cas9 Protein	PNA Bio Inc.	CP01	Rekombinantes Cas9-Protein aus Streptococcus pyrogenes.
Erweitern Sie das High FidelityPLUS PCR-System	Roche Diagnostics, USA		Für die PCR und Amplifikation von DNA-Templates zur Verwendung bei der gRNA-Präparation
Borosilikatglaskapillaren	Fisher Scientific		mm Außendurchmesser (OD), zur Herstellung von Mikroinjektionsnadeln.
Petrischale	VWR	25384-302	Zum Halten der Embryonen während der Mikroinjektion.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Gemüsefett zum Beschichten von Laichpfannen und Petrischale.
Holtfreter's Lösung	Home Made		59 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,76 mM CaCl2, 1,67 mM MgSO4 zur Inkubation der mikroinjizierten Embryonen bis zum Schlüpfen.
Doxycyclinhyclat USP (Monohydrat)	Letco Medical	690904	Antibiotikum, das der Lösung von Holtfreter auf 10 ppm zugesetzt wurde, um bakterielle Infektionen zu verhindern.

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