Methodenartikel

Konstruktion und Evaluation eines murinen Calvarial Osteolyse-Modells durch die Einwirkung von CoCrMo Partikel in aseptischen Lockerung

DOI:

10.3791/56276

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17. Februar 2018

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1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt einen murinen calvarial Osteolyse Modell durch die Einwirkung von CoCrMo Partikel, die ideale Tiermodell für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen in aseptischen Lockerung darstellt.

Zusammenfassung

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Abnutzung Partikel-induzierte Osteolyse ist eine der Hauptursachen für aseptische Lockerung Endoprothetik scheitern, aber der zugrunde liegende Mechanismus ist unklar. Durch lange Follow-ups nötig für die Erkennung und sporadisch auftreten ist es schwierig um zu beurteilen, die Pathogenese Ofparticle-induzierte Osteolyse in klinischen Fällen. Daher sind optimale Tiermodelle für weitere Studien erforderlich. Das Mausmodell calvarial Osteolyse gegründet durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein wirksam und gültig Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Partikeln und verschiedenen Zellen in aseptische Lockerung. In diesem Modell wurden CoCrMo Partikel zuerst von Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom und Nukleinsäuretablette in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung in einer Konzentration von 50 mg/mL. Anschließend wurde die entstandene Suspension 50 µL bis zur Mitte des murinen Calvaria angewendet, nach Trennung von der Craniale Periost durch scharfe Dissektion. Nach zwei Wochen die Mäuse wurden geopfert und Calvaria Exemplare wurden geerntet; qualitative und quantitative Auswertungen wurden von Hämatoxylin und Eosin Färbung und Mikro-Computertomographie durchgeführt. Die Stärken dieses Modells gehören Verfahren Einfachheit, quantitative Bewertung des Knochenverlustes, Schnelligkeit der Osteolyse Entwicklung, mögliche Verwendung transgenen oder Ko-Modelle und einen relativ niedrigen Kosten. Jedoch kann dieses Modell verwendet werden, um die mechanische Kraft und chronische Effekte von Partikeln in aseptischen Lockerung zu beurteilen. Murine calvarial Osteolyse Modell generiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein ideales Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen, z. B.Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten in aseptische Lockerung.

Einleitung

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Aseptische Lockerung ist die häufigste Ursache von total hip Arthroplasty (THA) und Knie-Endoprothetik (TKA) Ausfall, erfordert die Überarbeitung Chirurgie1. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt jedoch unklar2. Eine lange Follow-up ist erforderlich, um die Partikel-induzierte Osteolyse, erkennen deren selten vorkommt; Daher ist es schwierig, um seine Pathogenese in klinischen Fällen zu erkunden. Daher benötigen weitere Studien mit Schwerpunkt auf komplexen Mechanismen der zellulären und Gewebe, dass beide in Vivo -Experimente in der Partikel-induzierte Osteolyse Modelle und in-vitro- Assays in Zellen, die im Zusammenhang mit Homöostase3Knochen tragen. Eine gültige Tiermodell ist wichtig enthüllt hat, die Auswirkungen von Abriebpartikeln auf Knochenschwund, Nachweis für weitere zelluläre Assays.

Ein murinen calvarial Osteolyse Modell konstruiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist eine effektive und gültige Methode zur Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Partikeln und verschiedenen Zellen in aseptische Lockerung. In diesem Modell verursachen CoCrMo Partikel calvarial Osteolyse von inflammatorischen Zytokinen in Makrophagen induzieren, Aktivierung von Osteoklasten, Hemmung der Osteoblasten Verbreitung und Förderung der Osteoblasten Apoptose.

Es dauert nur zwei Wochen, dieses Modell zu etablieren. Osteolyse visualisiert und durch Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung quantifiziert werden kann und Mikro Tomographie (Mikro-CT)2berechnet. Darüber hinaus hat dieses Modell eine relativ niedrigen Kosten und transgenen und Knockout Maus Modelle können verwendet werden, um eine große Anzahl von Verbindungen in verschiedene Dosen3Bildschirm.

Das Verfahren zu etablieren und Werten dieses Modell ist einfach. Zunächst wurden CoCrMo Partikel durch Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom gewonnen und Nukleinsäuretablette in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 50 mg/mL. Anschließend wurde die entstandene Suspension 50 µL bis zur Mitte des murinen Calvaria angewendet, nach Trennung von der Craniale Periost durch scharfe Dissektion. Die Mäuse wurden geopfert, nach zwei Wochen, und Calvaria Proben wurden geerntet; qualitative und quantitative Analysen wurden von H & E Färbung Andmicro-CT durchgeführt.

Ein murinen calvarial Osteolyse Modell konstruiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein ideales Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen CoCrMo Partikel und verschiedene Zellen wie Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten in aseptische Lockerung.

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Protokoll

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Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Universität Nanjing genehmigt.

1. CoCrMo Partikel Vorbereitung

  1. Erhalten Sie CoCrMo Partikel mithilfe einer vorgefertigten Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom4. CoCrMo-Legierung in das Instrument unter 10-3 Pa Vakuum, 0,04 MPa Argon und Wasserstoff 3:2 (V/V) und 650 A Katode aktuelle zu platzieren.
  2. Messen Sie den Durchmesser der CoCrMo Partikel.
    1. Fügen Sie 1 mg CoCrMo Partikel in 1,5 mL wasserfreiem Ethanol.
    2. Aufschwemmen Sie CoCrMo Partikel in wasserfreiem Ethanol durch Ultraschall bei 28 kHz und 600 W für 5 min schütteln.
    3. Die entstandene Suspension auf den objektiven Tisch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) einen Tropfen (ca. 20 µL) gelten. TEM Fotoserie bei 200 kV Beschleunigungsspannung und 0,24 nm Auflösung zu erfassen.
    4. Verwenden Sie die mitgelieferte Software, um die mittlere Durchmesser und Partikel Größenverteilung in TEM Mikrographen berechnen.
  3. Dekontaminieren Endotoxine
    1. Autoklaven 50 g der Partikel für 15 min bei 121 ° C und 15 Psi.
    2. Endotoxine durch einen quantitativen Assay Limulus Amebocyte Lysate (LAL) zu erkennen (< 0,25 % EU/mL wurde als Endotoxin Abwesenheit anzugeben)5.
  4. Die Partikel in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 50 mg/mL Stammlösung6aufzuwirbeln.

2. Konstruktion des Modells Calvarial Osteolyse

  1. 6 Wochen alten C57BL/J6 Mäuse (sechs Mäuse pro Gruppe) Withpentobarbital (50 mg/kg) zu betäuben. Verwenden Sie den Kneiftest um das Niveau der Anästhesie zu beurteilen. Verhindert Austrocknen der Augen mit normalen Kochsalzlösung.
  2. Mäuse in Bauchlage zu platzieren. Entfernen Sie das Fell auf den Schädel mit einem Rasierer zu und desinfizieren Sie die Haut mit medizinischen Wattebällchen, die 75 % Ethanol enthält.
  3. Identifizieren Sie für Punkt Lokalisierung zwei Punkte, einschließlich der Halbsummen zwischen den beiden Augen und Ohren, beziehungsweise. Dann bestimmen Sie die Linie zwischen den beiden oben genannten Punkte, und einzuschneiden Sie die Haut entlang der oben genannten Linie mit einer Schere (Abbildung 1A).
  4. Entfernen Sie die Craniale Periost aus der Calvaria mit einem Skalpell (Abbildung 1 b)6.
  5. Naht Haut an beiden Enden mit einfachen unterbrochenen Naht.
  6. Machen Sie eine Naht Linie durch die Mitte des Schnittes ohne verknoten. Halten Sie die beiden Enden der Linie Naht.
  7. Einbetten von 50 µL CoCrMo Partikel Suspension (50 mg/mL, mit PBS-Puffer) in der Mitte der Calvarias (Abbildung 1)2.
  8. Verknoten Sie die letzte Masche in einfachen unterbrochenen Naht (Abbildung 1).
  9. Pflegen Sie Mäuse für weitere 2 Wochen.

3. Bewertung des Calvarial Osteolyse-Modells von Mikro-CT-Scan

  1. Die Mäuse mit Kohlendioxid zu opfern. Die Mäuse in der Horizontalebene zu enthaupten. Entfernen Sie das Hirngewebe im Inneren und die Haut und Fell außerhalb. Ernten Sie die Calvarias für weitere Experimente.
  2. Das weiche Gewebe auf die Calvaria klären Sie vorsichtig mit einer Pinzette. Fix die geräumte Calvarias in 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 h Tauchen Calvarias in PBS 24 h vor dem Mikro-CT-Scan.
  3. Analysieren der Mäuse Calvarias durch hochauflösende Mikro-CT bei einer isometrischen Auflösung von 18 µm und Röntgen-Energieeinstellungen 45 kV und 550 mA.
  4. Durchzuführen Sie dreidimensionale Rekonstruktion von Mikro-CT-Daten mit der Software.
  5. Qualitative und Quantitative Analyse.
    1. Wählen Sie zunächst den quadratischen Bereich rund um die Mittellinie Naht als die Region von Interesse.
    2. Zweitens, Messung der Knochendichte (BMD), Knochen Volumen/Gesamt Volumen (BV/TV), trabekuläre Anzahl (Tb.N), trabekuläre Dicke (Tb.Th), trabekuläre Trennung/Abstand (Tb.Sp) und Prozentsatz der gesamten Porosität mit der mitgelieferten Software für Mikro-CT.
    3. Drittens vergleichen Sie die drei Gruppen für verschiedene Messungen durch einfache ANOVA. Post-hoc-Analyse der Varianz beantragen Sie die Bonferroni-Methode2.

4. Bewertung des Calvarial Osteolyse-Modells von H & E Färbung

  1. Entkalken Calvaria Proben in 15 % Ethylen Diamin Tetraacetic Säure (EDTA)-PBS bei 4 ° C. Wechseln Sie die Entkalkung Lösung 3 Wochen lang jeden Tag.
  2. Betten Sie die Entkalkung Proben in Paraffin für eine 2 x 1 cm x 1 cm-Würfel, und schneiden Sie sie in 2 µm Abschnitte im Bereich der Partikelabscheidung.
  3. Fleck in den Abschnitten mit Hämatoxylin und Eosin wie oben beschrieben7.
  4. Aufnahmen des gesamten Pathomorphism durch Lichtmikroskopie zu erfassen.

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Ergebnisse

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Die hauseigene erzeugten nanoskaligen CoCrMo Partikel wurden rund 50 nm (Standardfehler von 3,56) im Durchmesser, wie durch TEM (Abbildung 2) quantifiziert. Nach Exposition der Maus Calvarias CoCrMo Teilchen, die Tiere (n = 6 pro Gruppe) wurden für weitere zwei Wochen beibehalten. Innerhalb der zwei Wochen der calvarial Schnitt war vollständig geheilt, und die Naht kann fallen. Keine lokale Infektion oder Pseudarthrose Mai Knochen Verlust Bewertung beeinfluss...

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Diskussion

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Es gibt zwei Hauptmethoden für Abnutzung Partikel-induzierte Osteolyse bei Mäusen: die Luft-Beutel und das Modell calvarial Osteolyse. In der Luft-Beutel-Modell wird zuerst ein subkutan erzeugte Luft-Beutel hergestellt, gefolgt von Abnutzung Partikel Einführung und Implantation in die Knochen Gewebe8. Die Beutel Wand imitiert das Periost in aseptische Lockerung. Implantation von Knochen ist jedoch nonvascular ohne biologische Aktivität, wodurch es schwierig zu beurteilen, direkte Wechselwirkungen ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (81572111), der klinischen Wissenschaft und Technologie Projekt Stiftung der Provinz Jiangsu (BL2012002), der wissenschaftlichen Forschung Projekt Nanjing (201402007), die Naturwissenschaft unterstützt. Gründung der Provinz Jiangsu (BK20161385), und die besondere Gründung der Chinese Medical Doctor Association (2015COS0810).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CoCrMo-Legierung aus ProtheseWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIRohstoff zur Gewinnung von CoCrMo-Nanopartikeln
Hergestellter Hochvakuum-Gleichstrom mit drei ElektrodenCollege of Materials Science & Ingenieurwesen, Nanjing University of TechnologySelbst entworfene Maschine
6 Wochen alte männliche C57BL / 6J MäuseModelltierforschungszentrum der Universität NanjingN000013
100% EthanolNanjing ReagenzC0691514023Lösungsmittel von CoCrMo-Nanopartikeln für das Transmissionselektronenmikroskop Scannen
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenTaizhou Weierkang Medical Supplies Co., LtdW603
Mikroanalytische WaageShenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTDEX125DZH
Ultraschall-ShakerShanghai Yuhao wissenschaftliches Instrument Co., LTDYH-200DHZum Suspendieren von CoCrMo-Nanopartikeln
TransmissionselektronenmikroskopFEITecnai G20
SimplePCI SoftwareCompix Inc.Version 6.6Zur Berechnung des mittleren Durchmessers und der Partikelgrößenverteilung.
Sterilisationspfanne mit hoher HandQIULONGYIQIKYQL-100DSZur Dekontamination des Endotoxins
Limulus Amöbozyten-Lysat (LAL) AssayCharles RiverR13025Zum Nachweis von Endotoxin
15 ml MikrozentrifugenröhrchenTaizhou Suyi MedicalB122
Phosphatgepufferte KochsalzlösungBoster Biological TechnologyAR0030Lösungsmittel von CoCrMo-Nanopartikeln Stammlösung
Pentobarbital NatriumSigmaP3761Zur Betäubung von Mäusen
Normale KochsalzlösungSACKLERSR8572EP-15Zur Verhinderung des Austrocknens der Augen von Mäusen
75% EthanolNanjing ReagenzC0691560275Desinfektion
Medizinischer WattebauschShuitao1278298933
DesinfektionsrasiererKemeiKM-3018Zum Rasieren des
Fells SchereRWD LIFE SCIENCES12005-10Zum Einschneiden der Haut
Naht RWDLIFE SCIENCEF34001-01Zum Nähen
der Haut NadelhalterRWD LIFE SCIENCEF33001-01Zum Nähen der Haut
NadelRWD LIFE SCIENCER14003-12Zum Nähen der Haut
GefäßzangeRWD LIFE SCIENCEF22003-09Zum Nähen
der Haut SkalpellRWD LIFE SCIENCES31010-01Zur Entnahme von Schädelgatha
PinzetteRWD LIFE SCIENCEF12006-10Zur Entnahme von Schädelgatha
100 µ L PipettenEppendorf3120000240Zum Einbetten von Partikelsuspension in die Calvatias
100 & micro; L PipettenspitzenAXYGENT-200-YZum Einbetten von Partikelsuspension in die Calvatias
5 ml MikroröhrchenTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% ParaformaldehydServicebioG1101Fixierung
Mikro-Computertomographie SkyScanSkyScan1176
Ethylendiamin TetraessigsäureServicebioG1105Entkalkung
ParaffinServicebio#0001
ParaffinschneidemaschineLeicaRM2125RTS
ObjektträgerServicebioG6004
DeckglasServicebio200
HE FärbesetServicebio#1-5HE Färbeset
LichtmikroskopNikonE200

Referenzen

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  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
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  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
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  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
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  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
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Schlagwörter

Murines ModellMikro CT AnalyseH E F rbungPartikelsuspensionkraniales PeriostKnochenmineraldichteTEM Bildgebung

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