G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

Zusammenfassung

Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um den Fortschritt der DNA-Replikation durch die S-Phase des Zellzyklus folgen. Die meisten dieser Techniken sind in Richtung Aufklärung des Standortes und der Zeitpunkt der Einleitung des Genoms Vervielfältigung, anstatt seine Vollendung verwiesen worden. Es ist jedoch wichtig, dass wir Regionen des Genoms, die letzten Replikation abgeschlossen sind verstehen, weil diese Regionen erhöhten chromosomalen Bruch und Mutation leiden, und sie im Zusammenhang mit Krankheit und Alterung wurden. Hier beschreiben wir, wie wir eine Technik, die verwendet wurde, um die Replikation Einleitung um stattdessen diesen Regionen des Genoms letzte vollständige Replikation identifizieren überwachen ausgedehnt haben. Dieser Ansatz basiert auf einer Kombination der Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Anwendung dieser Technik auf Hefe, kann der Ansatz mit beliebigen Zellen verwendet werden, die in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt sortiert werden können.

Einleitung

Eukaryotische Genom Replikation wird eingeleitet, an mehreren diskreten Standorten, genannt Ursprünge der Replikation, von welchen Replikation Gabeln in beide Richtungen (rezensiert in Fragkos Et Al., 2015¹) gehen. Ursprünge variieren in ihren Zeitplan und die Effizienz der Zündung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Replikation Herkunft Aktivitäten überwachen und die Ursachen dieser Unterschiede zu erhellen. Die Aktivität der einzelnen Ursprünge kann aus einsträngiger DNA², welche Formulare rund um aktive Ursprung abgeleitet werden oder mithilfe von 2D Gelelektrophorese, um spezielle Replikations Z....

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für Flow Cytometry sortieren

1. 15 mL Reagenzgläsern, 8 mL YEPD Brühe enthält, so dass die Kulturen eine Dichte von 5 x 10⁶ bis 1,5 x 10⁷ Zellen pro mL nach Übernachtung Wachstum erreichen zu impfen (siehe Diskussion Hinweis 1).
2. Spin-down Hefezellen (1.400 x g, bei Raumtemperatur oder 4 ° C) in eine Schraubkappe Zentrifugenröhrchen 15 mL für 5 min, Zellen in 1,5 mL 70 % igem Ethanol und Transfer nach einem 1,6 mL Microfuge Rohr, lassen diese Sit für 1 h bei Raumtemperatur oder mindestens 3 h auf Eis (Aufschwemmen können gespeichert werden auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C) (siehe Diskussionspunkt (2)).

Ergebnisse

Wir haben wie oben beschrieben vor spät replizierenden Standorte in der angehenden Hefe verwendet. Tests dieser Ansatz mit einer bekannten späten replizierende Region auf ein künstliches Chromosom erwies sich die Technik präzise und zuverlässig sein. Unsere Ergebnisse haben auch gezeigt, die biologische Bedeutung der rechtzeitigen Abschluss der Replikation zeigen, dass eine spätere replizierende Region auf Chromosom 7, die wir identifiziert als späte Replikation auf der Grundlage unserer .......

Diskussion

Während diese Technik robust ist und relativ geradlinig, besondere Aufmerksamkeit werden, an folgende gewidmet sollte:

(1) Wir empfehlen, mindestens 12 h Kulturen wachsen, bevor sie Log-Phase erreichen, da Unterschiede im Zellzyklus Distributionen zu manifestieren, wenn Kulturen geerntet werden, nach dem Erreichen der gewünschten Dichte nur 4 h nach der Inokulation. Unsere Annahme ist, dass eine Zellzyklus-Distribution, die ein relativ stabiles Gleichgewicht erreicht hat besser als eine Vertei.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
YeaStar Genomic DNA Kit	Genesee Scientific	11-323
1 µ M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	resuspendiert in 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2
50 mM Natriumcitrat, pH 7,2
RNase-Lösung (0,25 mg / ml)	Sigma	R6513	0,25 mg / mL RNaseA resuspendiert in 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, RNase-Lösung nur 10 Minuten vor dem ersten Gebrauch kochen und von da an bei -20 ° C lagern;
Proteinase K Lösung (20 mg / ml)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	resuspendiert in 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% Glycerin, lagern bei -20° C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-Spin III Säulen	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q33216
Covaris Modell LE220 Fokussierter Ultraschallgerät	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Probenvorbereitungskit	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 Instrument	Illumina	SY– 401– 2501
Gsnap Ausrichtungssoftware	Open Source Software / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap