Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich koronarer Herzkrankheit oder periphere arterielle Verschlusskrankheit, sind die häufigsten Todesursachen weltweit¹. Zelltherapie ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Herz-und Kreislauferkrankungen, insbesondere für Menschen, die nicht in der Lage, chirurgische Eingriffe zu unterziehen sind. Es gibt mehrere Ansätze, Zellen oder ihre sekretierten Stoffe als therapeutisches Werkzeug^2,3, mit dem übergeordneten Ziel, verbessern die Durchblutung und Funktion des ischämischen und underperfused Gewebe zu verwenden. Ein Versuch, dieses Ziel zu erreichen ist, Arteriogenesis, zu verbessern, die die Entwicklung von Sicherheiten Arterien erhöht. Monozyten sind ein wichtiger Zelltyp Besicherung zugeordnet. Unsere Gruppe konzentrierte sich auf die Erforschung der Wirkung von Monozyten in Bereichen der Entzündung^4,5, insbesondere mit dem Megalosauridae Ischämie Modell induzieren Ischämie und anschließende Entzündung⁶. Monozyten nach Hause zu Bereichen der Entzündung und führen komplexe systemische Reaktionen, die zur Entwicklung der Besicherung⁷führen.

Mit dem Einsatz der intravitalen Mikroskopie wir untersuchen das Verhalten von diesen Zellen in Vivo und der Homing von injizierten Monozyten zu Bereichen der Entzündung zu beobachten. Die meisten frühere Studien beschreiben nur post-mortem Analysen, die Nachteile einschließlich einer Einführung der histologische Artefakte und eine große Zahl des Tieres für Vorbereitungen erforderlich halten. Mit unserem Ansatz können wir untersuchen, immunologische Prozesse und Sicherheiten Bildung über live imaging zu mehreren Zeitpunkten.

Neben der Entwicklung von Sicherheiten Arterien in ischämische Bereiche beeinflussen Monozyten auch Tumorwachstum. Um diese Prozesse zu untersuchen, wir Spritzen eine Basalmembran-ähnliche Matrix aus Engelbreth-Holm-Schwarm Maus Sarkom, ein Tumor reiche extrazelluläre Matrix Proteine⁸, extrahiert und analysieren mit intravitalen Mikroskopie. Diese Matrix wird für Endothelzellen Netzwerkbildung oder Anti-Krebs-Therapien durch Hemmung der Angiogenese zu Probeaufnahmen Moleküle verwendet; in diesem Fall werden wir das Tumor angiogenen Potenzial von Monozyten für Zelle Therapie^9,10,11bewerten.

Dieses Protokoll soll eine einfache und effiziente Möglichkeit, immunologische Prozesse verursacht durch Ischämie in einem in Vivo Modell zu studieren nachgewiesen werden. Wir erzeugen eine realistische Testumgebung im Vergleich zur histologischen Aufarbeitung von post-mortem Muskelgewebe.

unserer Studie wurde durchgeführt mit freundlicher Genehmigung des Landes Sachsen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle gemäß § 8 des deutschen Rechts für den Tierschutz. (§ 8 Abs. 1 des deutschen Gesetzes für den Tierschutz aus 18.05.2016 - BGBI. BGBl. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV aus 13.08.2013).

Hinweis: für die Experimente hier 8 bis 12 Wochen alten männlichen BALB/c Mäuse waren und menschlichen Monozyten von Blutspendern wurden verwendet für die Visualisierung von Monozyten über intravitalen Mikroskopie.

1. Zelle Vorbereitung

Hinweis: für die Isolierung von Monozyten, finden Sie in unserem früheren veröffentlichten Video zu Jupiter Anweisungen: " Isolation und intravenöse Injektion von murinen Knochenmark abgeleitet Monozyten " von Wagner Et Al. ⁴

Hinweis: Wenn alle Arbeitsschritte mit den Zellen zur Vermeidung von Kontaminationen steril sein muss.

1. Zelle färben mit 3,3 '-Perchlorat Dioctadecyloxacarbocyanine
   1. Aufschwemmen der Zellen im Serum freien Kulturmedium mit einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen/mL.
      Hinweis: Nur Serum freie Medium ermöglicht eine effiziente Färbung, da der lipophile Farbstoff von lipophilen Komponenten des Serums sonst bereits erfasst werden würde.
   2. Hinzufügen 5 µL 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat in Dimethylformamid, 1 mL Zellsuspension und sorgfältig Aufschwemmen.
   3. Inkubation der Zelle-Lösung bei 37 ° C für 20 min.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 500 X g für 5 min.
   5. Den Überstand zu verdrängen und die Zellen mit 37 ° C warmen fetalen Kalb Serum ergänzt Medium Aufschwemmen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5 zweimal.
   7. Zählen die Zellen mit der Formel:
      
   8. die Zellen mit 150 µL steriler 0,9 % NaCl-Lösung Aufschwemmen.
   9. Der Zellen in die Rute Vene injizieren.

2. Narkose

1. Inhalation Narkose
   1. verdampfen Isofluran mit Hilfe eines Vaporizers mit einer Konzentration von 5 % in einen geschlossenen Behälter unter einer Haube Chemikaliensicherheit.
   2. Die Maus vorsichtig handhaben und steckte ihn in den Papierkorb.
   3. Das Tier durch die Haut des Halses posterior zu behandeln, nachdem es aufgehört hat sich zu bewegen.
2. Intraperitoneal Anästhesie
   Hinweis: Verwendung Isoflurane Narkose, beschrieben unter Schritt 2.1, eine intraperitoneale Injektion durchführen. Mit der schnellen Erholung und kurzwirksamen narkotische Wirkung der Isoflurane Narkose ist es einfacher zu handhaben die Maus und intraperitoneale Anästhesie zu injizieren.
   1. Eine Lösung von 2,4 mL Ketamin (10 %), 0,8 mL Xylazin (2 %) und 6,8 mL NaCl (0,9 %) für die intraperitoneale Injektion verwenden.
   2. Wiegen das Tier vor der Narkose Anwendung.
      Hinweis: Die Formel für die Narkose ist:
      
   3. eine 1 mL Spritze mit Insulin mit einer 30 G-Nadel, um die Lösung in den linken Unterbauch zu injizieren verwenden.
   4. Platzieren Sie den Mauszeiger in seinem Käfig und narkotische Wirkung warten.
      Hinweis: Die narkotische Wirkung erscheint normalerweise innerhalb von 5 min wenn die Injektion erfolgreich war. Die richtige Tiefe der Narkose kann durch das Fehlen der Deckel Reflex oder Reaktion auf Zehe Prise sowie einer regelmäßigen, kontrollierten Rate der Atmung bestimmt werden.

3. Implantation von Basalmembran-ähnliche Matrix

Hinweis: Diese Methode wird verwendet von unserer Fraktion, um Tumor-Angiogenese nach Monocyte Injektion zu studieren. Je nach den Experimenten können die Basalmembran-ähnliche Matrix Wachstumsfaktoren hinzugefügt werden. Wir führten Femoral Arterie Ligatur vor der Injektion des Tumors in der Flanke der Maus. Die Matrix muss eine Temperatur von 4 ° C für die Injektion. Bei dieser Temperatur ist die Matrix Flüssigkeit; das Gel härtet zu einem festen bei Körpertemperatur (37 ° C). Zur besseren Sichtbarkeit der subkutane Matrix stecken, rasieren, die Haut der Maus an der Injektionsstelle.

Hinweis: Optional: Fügen Sie 100 ng grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 300 ng vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und 26 IE Heparin unter sterilen Bedingungen der Basalmembran-ähnliche Matrix.

1. 1 mL der Matrix in einer 30 G Insulin Spritze und speichern auf Eis bis zum Gebrauch laden.
2. Das Tier auf den Tisch legen und halten Sie die Haut der Maus neben der Einstichstelle an der Flanke.
3. Injizieren 500 µL der Basalmembran-ähnliche Matrix subkutan.
   Hinweis: Aus praktischen Gründen ist es notwendig, die Basalmembran-ähnliche Matrix kompakt an einem Ort, subkutane Streuung zu vermeiden zu injizieren. Es wird leichter sein, die künstliche Tumor aus dem Gewebe zu entfernen, nach Opfern der Maus am Ende des Experiments.

4. Vene Injektion Tail

Hinweis: üben Sie die Rute Vene Injektion mit NaCl-Lösung auf Versuchstiere vor Experimenten. Wenn die Monozyten können nicht ausreichend in die Rute Vene injiziert werden, werden keine systemische Wirkung auf die Besicherung. In diesem Protokoll injiziert wir 2,5 Millionen Monozyten. Versuchen Sie, nicht mehr als 5 µL/g Körpergewicht Spritzen.

1. Die Monocyte-Lösung unter Schritt 1.1.8 mit 2,5 Millionen Monozyten vorbereitet.
2. 30 G Nadel und eine 1 mL Insulin Spritze für die Injektion verwenden.
3. Sorgfältig behandeln die Maus, das Tier in die Restrainer zurückhalten und sicherstellen, dass die Maus nicht geschädigt und hat ausreichend Platz zum Atmen.
4. Das Heizkissen die Restrainer aufsetzen, so dass das Heck die Platte kontaktieren kann.
5. Identifizieren die Rute Venen, die an der lateralen Seite des Hecks befinden.
6. Das Heck 90 ° drehen, so die Rute Vene auf der Oberseite der Rute erscheint.
7. Desinfizieren der Spritzseite vor der Injektion der Monozyten.
8. Versuchen, die schräge der Nadel mit Blick auf die Monocyte-Lösung in einem flachen Winkel spritzen
   Hinweis: Stoppen der Injektion, erscheint eine Blase, da dies ein Zeichen für eine fehlerhafte Injektion. Versuchen Sie erneut, das Verfahren mehr proximal.
9. Blutungen an der Injektionsstelle durch sanften Druck auf die Rute für ca. 60 s.
10. Beobachten das Tier für 30 min für systemische Nebenwirkungen überwachen und platzieren Sie den Mauszeiger in seinem Käfig, nachdem das Tier vollständig erholt hat.

5. Intravitalen Mikroskopie

1. Vorbereitung
   1. die narkotisierten Maus auf das Heizkissen (37 ° C) zu halten eine konstante Temperatur und fixieren Sie die Pfoten mit Klebeband zu platzieren.
   2. Desinfizieren Sie die Haut an der Stelle des am Bein oder Flanke, die für die Mikroskopie verwendet wird.
   3. Die Region von Interesse für ein besseres Handling und zur Vermeidung von Interferenzen mit Haare zu rasieren.
   4. Verbrauchsteuern die Haut mit einem sterilen Skalpell und feine Pinzette in eine quadratische Fläche von 0,5 x 0,5 cm.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Region von Interesse feucht zu halten; Andernfalls wird die Qualität der Bilder und Gewebe beeinträchtigt. NaCl-Lösung kann verwendet werden, um das Gebiet befeuchten.
   5. Das Bein zwischen zwei verstellbaren Stempel platzieren und positionieren Sie ein Deckglas auf den Briefmarken.
   6. Sicherzustellen, dass das Gewebe nass und steht in Kontakt mit dem Glas.
   7. Inject 50 µL Rhodamin Dextran retrobulbären in das venöse System für bessere Sichtbarkeit der Schiffe.
   8. Mikroskopie zu starten und passen Sie die Position des Beines, wenn nötig.
2. Intravitalen Mikroskopie Einstellungen
   1. schalten Sie das Mikroskop, Computer, elektronische Schnittstellen und Laser.
   2. Schalten Sie die Heizeinheit Inkubation Kammer und/oder Heizung (Platte/Pad) zu inszenieren, und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° c
   3. Starten Sie die Software zur Datenerfassung. Wenn das Mikroskop mit einem Resonanz-Scanner ausgestattet ist, wählen Sie diesen schnellen Scan Modus.
   4. Warten, bis die Temperatur konstant (35-37 ° C) erreicht
      Hinweis: Eine stabile Temperatur ist wichtig, dass: (a) die Maus, die Narkose seine Körpertemperatur und (b) vermeiden oder zumindest minimieren fokale Drift nicht kontrollieren kann. Dies kann bis zu mehreren Stunden, je nach den Umgebungsbedingungen (z.B., Klimaanlage und die Anzahl der Wärmequellen im Raum, einschließlich Menschen) 1 h dauern. Wenn eintauchen Ziele verwendet werden, ist die Kontaktzone zwischen Objektiv und Deckglas (oder Gewebe) eine typische Ursache für Instabilität. Das Objektiv mit einer objektiven Heizung Heizung kann helfen; Alternativ ein Mikroskop mit einem Autofokus-System ist sehr zu empfehlen.
   5. Wählen Sie eine Vergrößerung Objektiv mit einer hohen Zahl Blende das erfüllt die Anforderungen der Auflösung des Experiments (siehe Hinweis am Ende dieses Abschnitts).
   6. Die Mikroskop-Einstellungen in Bezug auf Gewinn, Kanaleinstellungen, Scan-Geschwindigkeit, Pixelauflösung, Tiefe Volumen, Schrittgröße und bevor man das Versuchstier auf der Bühne mit durchschnittlich optimieren.
   7. Scannen bidirektional Erfassungszeit reduzieren.
   8. Die narkotisierten Maus auf die vorgewärmte Mikroskoptisch zu platzieren, nachdem das Mikroskop stabile Verhältnisse erreicht hat und die Einstellungen wurden mit Hilfe von einem Dummy getestet.
   9. Bringen die Region von Interesse innerhalb der Basalmembran-ähnliche Matrix in den Fokus, indem helle Beleuchtung und überprüfen Sie kurz die Kapillaren durch UV-Licht mit angemessenen Filtereinstellungen für die angewandte Fluorophore.
   10. Schalten Sie den Scan-Modus; starten Sie den Scanvorgang bei niedriger Auflösung 256 x 256 Mode und Gewinn steigern und Laserleistung, bis ein Signal auf dem Monitor beobachtet wird.
   11. Fokus auf die Struktur von Interesse. Vergrößern Sie, bis alle Details sichtbar sind.
   12. Definieren " start " und " Ende " Positionen in Axialrichtung.
   13. Suchlauf.
   14. Definieren stepping Größe (z. B. 0,5 µm) und Anzahl der fokalen Flächen (z.B. 10-20).
   15. Schalter auf die endgültige Pixelauflösung (512 x 512 oder 1.024 x 1.024) abhängig von der Geschwindigkeit der bewegten subzellulären Strukturen oder Zellen und wählen Sie die Scan-Geschwindigkeit (Abtastrate), die am besten zu den Sätzen. Bidirektionale Scannen wird empfohlen, den Erwerb von Stacks befestigen.
       Hinweis: Wählen Sie die höchste Scan-Rate von Scannen, die ausreichende Bildqualität gibt. Typischen Point Scanner bieten Geschwindigkeiten von 400 Hz bis 1,4 kHz. Resonanz-Scanner bieten eine zusätzliche 8 kHz oder 12 kHz. Durch die Reduzierung der Anzahl der Zeilen in y-Richtung, die Abtastrate kann weiter erhöht werden (typische Werte sind 512 x 512, 512 x 256 oder 512 x 200 Pixelauflösung). Je nach Signal-Rausch-Verhältnis kann man versuchen, die Bildqualität zu verbessern, indem Sie Zeile durchschnittlich zwischen 2 und 4. In der Regel eine Einstellung von 512 x 200 ohne Mittelung Ergebnisse in einem Erwerb/Zeitrahmen von 18 ms im bidirektionalen Modus mit einem 8 KHz Resonanz-Scanner; mit 512 x 200 und 4 x durchschnittlich, es verlangsamt bis 56 ms pro Bild.

Intravitalen Mikroskopie zur Untersuchung von Tumor und Sicherheiten Behälterwachstum ausgelöst durch Monozyten kann helfen, neue Aspekte in die molekularen Mechanismen der Tumor-Angiogenese und Arteriogenesis zeigen. Zellen müssen vorbereitet sein und sorgfältig mit den Schritten des Protokolls injiziert. Unterschiede führen zu Abweichungen zwischen den einzelnen Experimente. Die Monozyten müssen injiziert werden, in das venöse System (Abbildung 1), systemische Wirkungen zu erhalten und zu vermeiden, Embolie, die auftreten können, wenn die Injektion in das arterielle System durchgeführt wird.

Wenn Basalmembran-ähnliche Matrix verwendet wird, mit Stecker Explantation zur histologischen Untersuchung hilft langsam Einspritzen, um Streuung zu vermeiden (Abbildung 2, Abbildung 3). Nach der Maus zu opfern, wird der Basalmembran-wie Matrix-Stecker von der Flanke der Maus explantiert werden. Innerhalb der Basalmembran-wie Matrix-Stecker messen wir Vaskularisierung durch zählen der Kapillaren in verschiedenen experimentellen Einstellungen (Abbildung 4, Abbildung 5).

Eine weitere Voraussetzung für erfolgreiche Experimente ist die Mikroskop-Einstellung, die abhängig von Software, Hardware und tierische Vorbereitung (Abbildung 6). Wenn subzellulären Strukturen (< 2 µm) müssen identifiziert werden, eine aufrechte Mikroskop mit 2-Photonen-Anregung und Wasser eintauchen Ziele (20 X oder 25 X, numerischen Apertur 1.0) mit langem Arbeitsabstand (> 2 mm) sind zu empfehlen. Da Wasser eintauchen mit hoher numerischen Apertur extrem empfindlich auf Brechungsindex Variationen zielen darauf ab, müssen die optimale Auflösung und Helligkeit angepasst werden, durch Verschieben eines Korrektur Kragens an das Ziel. Anpassung von Hand ist leider ziemlich schwierig aus Platzgründen. Daher sind teure Ziele mit einer motorisierten Kragen Korrektur von Mikroskop-Herstellern angeboten.

Wenn zelluläre Auflösung (ca. 5-10 µm) ausreicht, trocknen ein 10 X Objektiv mit einer Ziffer Blende 0,4 oder höher und eine lange Arbeitsabstand (> 2 mm) wird empfohlen. In diesem Fall kann eine aufrechte oder eine umgekehrte Mikroskopstativ ausgewählt werden. Live Cell Imaging mit einem 10-fach trocken Objektiv (Ziffer Blende 0,4) bei höheren Zoom-Faktoren (> 3) ist viel einfacher und billiger, weil klassische konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (d.h. 1 Photon Erregung) verwendet werden, um Bild-Stacks mit ausreichend zu erhalten Auflösung. Wenn viel Zeit für den Erwerb von Bildern benötigt wird, verringert die Menge von Rhodamin Dextran innerhalb des Schiffes. Für eine bessere Sichtbarkeit der Schiffe, die Injektion von der Fluorophor muss sein wiederholt (Abbildung 7).

Es ist am effektivsten, probieren Sie die verschiedenen Einstellungen und entscheiden, die beste Bildqualität möglich. Die Verwendung von positiven Proben für Zellen oder Basalmembran-wie Matrix (ohne Transplantation) kann helfen, optimale Einstellungen zu erhalten. Wir konnten beschriftete Monozyten über intravitalen Microcopy im Blut fließen und Muskel Gewebe (Bild 8, Bild 9) erkannt werden. Histologische Untersuchung von Gewebeschnitten bestätigt unsere Ergebnisse (Abbildung 10).

Abbildung 1 : Injektion von 2,5 Millionen Monozyten in den Schweif Vene. Venen befinden sich an der lateralen Seite der Rute, mit Arterien auf der dorsalen und ventralen Seite. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Injektion von Basalmembran-ähnliche Matrix. Behandeln Sie die Haut der Maus und injizieren Sie die Basalmembran-ähnliche Matrix in die Flanke zu. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Explantierten Matrix Stecker aus der Flanke der Maus (siehe Punkt 3.5). Eingearbeitete Schiffe, fünf Tage nach der Transplantation Monocyte über die Rute Vene. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Vergleich der Vaskularisation innerhalb der Basalmembran-wie Matrix ( + SD, n = 3 in jeder Gruppe). Gefäße innerhalb der Basalmembran-wie Matrix-Stecker, mit kein Wachstumsfaktor hinzugefügt (roter Balken), im Vergleich zu Schiffen der Basalmembran-ähnliche Matrix Stecker mit Wachstumsfaktor hinzugefügt. Die Ergänzung der Basalmembran-ähnliche Matrix mit Wachstumsfaktor führt zu erhöhten Behälterwachstum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Schiffe innerhalb der Basalmembran-ähnliche Matrix Stecker. Visualisierung von Blut fließen innerhalb von Schiffen (Pfeile) und Monocyte homing innerhalb des Basalmembran-wie Matrix-Steckers (grün) (rot). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Maus bereit für die Bildaufnahme. Die Pfoten sind fest mit Klebeband und einem Deckglas befindet sich auf der Oberseite zwei verstellbare Briefmarken. Die Region von Interesse wurde mit einem Skalpell herausgeschnitten. NaCl wird verwendet, um die Gegend zu befeuchten, damit die Qualität der Bilder und das Gewebe nicht beeinträchtigt wird.csource.Jove.com/files/ftp_upload/56290/56290fig6large.jpg"Target ="_blank"> klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 : Sichtbarkeit der Schiffe gesunken. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat gebeizt Monozyten (Pfeile) in Basalmembran-ähnliche Matrix neben einem Schiff (Längsschnitt, *). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8 : Monocyte in Behälter gespült. In Vivo Visualisierung von 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat gebeizt und transplantierten Monocyte (grün, Pfeil) innerhalb der kollaterale Arterie (*). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 9 : Intravitalen Mikroskopie. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat gebeizt Monozyten (Pfeile) in kollaterale Gefäße mit typische Korkenzieher Formation (*) mit Rhodamin Dextran befleckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 10 : Immunohistologische Anfärbung der Oberschenkel-Muskulatur. Schiffe (rot: alpha Glattmuskel Aktin, *), Makrophagen (grün: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat, Pfeile), Zellkern (blau). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.