Name: Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung der intravitalen Mikroskopie zur Untersuchung von Monozyten-Homing und Angiogenese in einem murinen Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen für die kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Arbeit wurde von der ELSE-Kröner-Stiftung unterstützt und die DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, Sonderforschungsbereich). Besonderen Dank an Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke Universität Magdeburg, Magdeburg, Deutschland, für den technischen Support.

unserer Studie wurde durchgeführt mit freundlicher Genehmigung des Landes Sachsen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle gemäß § 8 des deutschen Rechts für den Tierschutz. (§ 8 Abs. 1 des deutschen Gesetzes für den Tierschutz aus 18.05.2016 - BGBI. BGBl. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV aus 13.08.2013).
 Hinweis: für die Experimente hier 8 bis 12 Wochen alten männlichen BALB/c Mäuse waren und menschlichen Monozyten von Blutspendern wurden verwendet für die Visualisierung von Monozyten über intravitalen Mikroskopie.
 1. Zelle Vorbereitung Hinweis: für die Isolierung von Monozyten, finden Sie in unserem früheren veröffentlichten Video zu Jupiter Anweisungen: &#34; Isolation und intravenöse Injektion von murinen Knochenmark abgeleitet Monozyten &#34; von Wagner Et Al. 4 Hinweis: Wenn alle Arbeitsschritte mit den Zellen zur Vermeidung von Kontaminationen steril sein muss.
<ol><li>Zelle färben mit 3,3 &#39;-Perchlorat Dioctadecyloxacarbocyanine <ol><li>Aufschwemmen der Zellen im Serum freien Kulturmedium mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen/mL. 
		Hinweis: Nur Serum freie Medium ermöglicht eine effiziente Färbung, da der lipophile Farbstoff von lipophilen Komponenten des Serums sonst bereits erfasst werden würde.</li>
		<li>Hinzufügen 5 µL 1 mM 3,3 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat in Dimethylformamid, 1 mL Zellsuspension und sorgfältig Aufschwemmen.</li>
		<li>Inkubation der Zelle-Lösung bei 37 ° C für 20 min.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 500 X g für 5 min.</li>
		<li>Den Überstand zu verdrängen und die Zellen mit 37 ° C warmen fetalen Kalb Serum ergänzt Medium Aufschwemmen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5 zweimal.</li>
		<li>Zählen die Zellen mit der Formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" /></li> <li>die Zellen mit 150 µL steriler 0,9 % NaCl-Lösung Aufschwemmen.</li>
		<li>Der Zellen in die Rute Vene injizieren.</li>
	</ol></li></ol> 2. Narkose <ol><li>Inhalation Narkose <ol><li>verdampfen Isofluran mit Hilfe eines Vaporizers mit einer Konzentration von 5 % in einen geschlossenen Behälter unter einer Haube Chemikaliensicherheit.</li>
		<li>Die Maus vorsichtig handhaben und steckte ihn in den Papierkorb.</li>
		<li>Das Tier durch die Haut des Halses posterior zu behandeln, nachdem es aufgehört hat sich zu bewegen.</li>
	</ol></li> <li>Intraperitoneal Anästhesie Hinweis: Verwendung Isoflurane Narkose, beschrieben unter Schritt 2.1, eine intraperitoneale Injektion durchführen. Mit der schnellen Erholung und kurzwirksamen narkotische Wirkung der Isoflurane Narkose ist es einfacher zu handhaben die Maus und intraperitoneale Anästhesie zu injizieren.
	<ol><li>Eine Lösung von 2,4 mL Ketamin (10 %), 0,8 mL Xylazin (2 %) und 6,8 mL NaCl (0,9 %) für die intraperitoneale Injektion verwenden.</li>
		<li>Wiegen das Tier vor der Narkose Anwendung. 
		Hinweis: Die Formel für die Narkose ist: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" /></li> <li>eine 1 mL Spritze mit Insulin mit einer 30 G-Nadel, um die Lösung in den linken Unterbauch zu injizieren verwenden.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in seinem Käfig und narkotische Wirkung warten. 
		Hinweis: Die narkotische Wirkung erscheint normalerweise innerhalb von 5 min wenn die Injektion erfolgreich war. Die richtige Tiefe der Narkose kann durch das Fehlen der Deckel Reflex oder Reaktion auf Zehe Prise sowie einer regelmäßigen, kontrollierten Rate der Atmung bestimmt werden.</li>
	</ol></li></ol> 3. Implantation von Basalmembran-ähnliche Matrix Hinweis: Diese Methode wird verwendet von unserer Fraktion, um Tumor-Angiogenese nach Monocyte Injektion zu studieren. Je nach den Experimenten können die Basalmembran-ähnliche Matrix Wachstumsfaktoren hinzugefügt werden. Wir führten Femoral Arterie Ligatur vor der Injektion des Tumors in der Flanke der Maus. Die Matrix muss eine Temperatur von 4 ° C für die Injektion. Bei dieser Temperatur ist die Matrix Flüssigkeit; das Gel härtet zu einem festen bei Körpertemperatur (37 ° C). Zur besseren Sichtbarkeit der subkutane Matrix stecken, rasieren, die Haut der Maus an der Injektionsstelle.
 Hinweis: Optional: Fügen Sie 100 ng grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 300 ng vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und 26 IE Heparin unter sterilen Bedingungen der Basalmembran-ähnliche Matrix.
<ol><li>1 mL der Matrix in einer 30 G Insulin Spritze und speichern auf Eis bis zum Gebrauch laden.</li>
	<li>Das Tier auf den Tisch legen und halten Sie die Haut der Maus neben der Einstichstelle an der Flanke.</li>
	<li>Injizieren 500 µL der Basalmembran-ähnliche Matrix subkutan. 
	Hinweis: Aus praktischen Gründen ist es notwendig, die Basalmembran-ähnliche Matrix kompakt an einem Ort, subkutane Streuung zu vermeiden zu injizieren. Es wird leichter sein, die künstliche Tumor aus dem Gewebe zu entfernen, nach Opfern der Maus am Ende des Experiments.</li>
</ol> 4. Vene Injektion Tail Hinweis: üben Sie die Rute Vene Injektion mit NaCl-Lösung auf Versuchstiere vor Experimenten. Wenn die Monozyten können nicht ausreichend in die Rute Vene injiziert werden, werden keine systemische Wirkung auf die Besicherung. In diesem Protokoll injiziert wir 2,5 Millionen Monozyten. Versuchen Sie, nicht mehr als 5 µL/g Körpergewicht Spritzen.
<ol><li>Die Monocyte-Lösung unter Schritt 1.1.8 mit 2,5 Millionen Monozyten vorbereitet.</li>
	<li>30 G Nadel und eine 1 mL Insulin Spritze für die Injektion verwenden.</li>
	<li>Sorgfältig behandeln die Maus, das Tier in die Restrainer zurückhalten und sicherstellen, dass die Maus nicht geschädigt und hat ausreichend Platz zum Atmen.</li>
	<li>Das Heizkissen die Restrainer aufsetzen, so dass das Heck die Platte kontaktieren kann.</li>
	<li>Identifizieren die Rute Venen, die an der lateralen Seite des Hecks befinden.</li>
	<li>Das Heck 90 ° drehen, so die Rute Vene auf der Oberseite der Rute erscheint.</li>
	<li>Desinfizieren der Spritzseite vor der Injektion der Monozyten.</li>
	<li>Versuchen, die schräge der Nadel mit Blick auf die Monocyte-Lösung in einem flachen Winkel spritzen 
	Hinweis: Stoppen der Injektion, erscheint eine Blase, da dies ein Zeichen für eine fehlerhafte Injektion. Versuchen Sie erneut, das Verfahren mehr proximal.</li>
	<li>Blutungen an der Injektionsstelle durch sanften Druck auf die Rute für ca. 60 s.</li>
	<li>Beobachten das Tier für 30 min für systemische Nebenwirkungen überwachen und platzieren Sie den Mauszeiger in seinem Käfig, nachdem das Tier vollständig erholt hat.</li>
</ol> 5. Intravitalen Mikroskopie <ol><li>Vorbereitung <ol><li>die narkotisierten Maus auf das Heizkissen (37 ° C) zu halten eine konstante Temperatur und fixieren Sie die Pfoten mit Klebeband zu platzieren.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Haut an der Stelle des am Bein oder Flanke, die für die Mikroskopie verwendet wird.</li>
		<li>Die Region von Interesse für ein besseres Handling und zur Vermeidung von Interferenzen mit Haare zu rasieren.</li>
		<li>Verbrauchsteuern die Haut mit einem sterilen Skalpell und feine Pinzette in eine quadratische Fläche von 0,5 x 0,5 cm. 
		Hinweis: Es ist wichtig, die Region von Interesse feucht zu halten; Andernfalls wird die Qualität der Bilder und Gewebe beeinträchtigt. NaCl-Lösung kann verwendet werden, um das Gebiet befeuchten.</li>
		<li>Das Bein zwischen zwei verstellbaren Stempel platzieren und positionieren Sie ein Deckglas auf den Briefmarken.</li>
		<li>Sicherzustellen, dass das Gewebe nass und steht in Kontakt mit dem Glas.</li>
		<li>Inject 50 µL Rhodamin Dextran retrobulbären in das venöse System für bessere Sichtbarkeit der Schiffe.</li>
		<li>Mikroskopie zu starten und passen Sie die Position des Beines, wenn nötig.</li>
	</ol></li> <li>Intravitalen Mikroskopie Einstellungen <ol><li>schalten Sie das Mikroskop, Computer, elektronische Schnittstellen und Laser.</li>
		<li>Schalten Sie die Heizeinheit Inkubation Kammer und/oder Heizung (Platte/Pad) zu inszenieren, und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° c</li>
		<li>Starten Sie die Software zur Datenerfassung. Wenn das Mikroskop mit einem Resonanz-Scanner ausgestattet ist, wählen Sie diesen schnellen Scan Modus.</li>
		<li>Warten, bis die Temperatur konstant (35-37 ° C) erreicht 
		Hinweis: Eine stabile Temperatur ist wichtig, dass: (a) die Maus, die Narkose seine Körpertemperatur und (b) vermeiden oder zumindest minimieren fokale Drift nicht kontrollieren kann. Dies kann bis zu mehreren Stunden, je nach den Umgebungsbedingungen (z.B., Klimaanlage und die Anzahl der Wärmequellen im Raum, einschließlich Menschen) 1 h dauern. Wenn eintauchen Ziele verwendet werden, ist die Kontaktzone zwischen Objektiv und Deckglas (oder Gewebe) eine typische Ursache für Instabilität. Das Objektiv mit einer objektiven Heizung Heizung kann helfen; Alternativ ein Mikroskop mit einem Autofokus-System ist sehr zu empfehlen.</li>
		<li>Wählen Sie eine Vergrößerung Objektiv mit einer hohen Zahl Blende das erfüllt die Anforderungen der Auflösung des Experiments (siehe Hinweis am Ende dieses Abschnitts).</li>
		<li>Die Mikroskop-Einstellungen in Bezug auf Gewinn, Kanaleinstellungen, Scan-Geschwindigkeit, Pixelauflösung, Tiefe Volumen, Schrittgröße und bevor man das Versuchstier auf der Bühne mit durchschnittlich optimieren.</li>
		<li>Scannen bidirektional Erfassungszeit reduzieren.</li>
		<li>Die narkotisierten Maus auf die vorgewärmte Mikroskoptisch zu platzieren, nachdem das Mikroskop stabile Verhältnisse erreicht hat und die Einstellungen wurden mit Hilfe von einem Dummy getestet.</li>
		<li>Bringen die Region von Interesse innerhalb der Basalmembran-ähnliche Matrix in den Fokus, indem helle Beleuchtung und überprüfen Sie kurz die Kapillaren durch UV-Licht mit angemessenen Filtereinstellungen für die angewandte Fluorophore.</li>
		<li>Schalten Sie den Scan-Modus; starten Sie den Scanvorgang bei niedriger Auflösung 256 x 256 Mode und Gewinn steigern und Laserleistung, bis ein Signal auf dem Monitor beobachtet wird.</li>
		<li>Fokus auf die Struktur von Interesse. Vergrößern Sie, bis alle Details sichtbar sind.</li>
		<li>Definieren &#34; start &#34; und &#34; Ende &#34; Positionen in Axialrichtung.</li>
		<li>Suchlauf.</li>
		<li>Definieren stepping Größe (z. B. 0,5 µm) und Anzahl der fokalen Flächen (z.B. 10-20).</li>
		<li>Schalter auf die endgültige Pixelauflösung (512 x 512 oder 1.024 x 1.024) abhängig von der Geschwindigkeit der bewegten subzellulären Strukturen oder Zellen und wählen Sie die Scan-Geschwindigkeit (Abtastrate), die am besten zu den Sätzen. Bidirektionale Scannen wird empfohlen, den Erwerb von Stacks befestigen. 
		Hinweis: Wählen Sie die höchste Scan-Rate von Scannen, die ausreichende Bildqualität gibt. Typischen Point Scanner bieten Geschwindigkeiten von 400 Hz bis 1,4 kHz. Resonanz-Scanner bieten eine zusätzliche 8 kHz oder 12 kHz. Durch die Reduzierung der Anzahl der Zeilen in y-Richtung, die Abtastrate kann weiter erhöht werden (typische Werte sind 512 x 512, 512 x 256 oder 512 x 200 Pixelauflösung). Je nach Signal-Rausch-Verhältnis kann man versuchen, die Bildqualität zu verbessern, indem Sie Zeile durchschnittlich zwischen 2 und 4. In der Regel eine Einstellung von 512 x 200 ohne Mittelung Ergebnisse in einem Erwerb/Zeitrahmen von 18 ms im bidirektionalen Modus mit einem 8 KHz Resonanz-Scanner; mit 512 x 200 und 4 x durchschnittlich, es verlangsamt bis 56 ms pro Bild.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
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<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die hier beschriebene Methode wirft Licht auf die Entwicklung von Sicherheiten Arterien, das Verhalten von Monozyten in diesen Gefäßen und den Prozess der Arteriogenesis. Die Schritte für die Anwendung dieses Protokolls sind leicht zu erlernen und kann verwendet werden, in anderen Bereichen der Wissenschaft. Trotz dieser Vorteile gibt es einige Nachteile. Zum Beispiel ist mikroskopische Ausrüstung erforderlich, um die beschriebenen Techniken ausführen. Beschaffung von Ausrüstung für ein Experiment ist unhaltbar, so ist e...

Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich koronarer Herzkrankheit oder periphere arterielle Verschlusskrankheit, sind die häufigsten Todesursachen weltweit1. Zelltherapie ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Herz-und Kreislauferkrankungen, insbesondere für Menschen, die nicht in der Lage, chirurgische Eingriffe zu unterziehen sind. Es gibt mehrere Ansätze, Zellen oder ihre sekretierten Stoffe als therapeutisches Werkzeug2,3, mit dem übergeordneten Ziel, verbessern die Durchblutung und Funktion des ischämischen und underperfused Gewebe zu verwenden. Ein Versuch, dieses Ziel zu erreichen ist, Arteriogenesis, zu verbessern, die die Entwicklung von Sicherheiten Arterien erhöht. Monozyten sind ein wichtiger Zelltyp Besicherung zugeordnet. Unsere Gruppe konzentrierte sich auf die Erforschung der Wirkung von Monozyten in Bereichen der Entzündung4,5, insbesondere mit dem Megalosauridae Ischämie Modell induzieren Ischämie und anschließende Entzündung6. Monozyten nach Hause zu Bereichen der Entzündung und führen komplexe systemische Reaktionen, die zur Entwicklung der Besicherung7führen.
Mit dem Einsatz der intravitalen Mikroskopie wir untersuchen das Verhalten von diesen Zellen in Vivo und der Homing von injizierten Monozyten zu Bereichen der Entzündung zu beobachten. Die meisten frühere Studien beschreiben nur post-mortem Analysen, die Nachteile einschließlich einer Einführung der histologische Artefakte und eine große Zahl des Tieres für Vorbereitungen erforderlich halten. Mit unserem Ansatz können wir untersuchen, immunologische Prozesse und Sicherheiten Bildung über live imaging zu mehreren Zeitpunkten.
Neben der Entwicklung von Sicherheiten Arterien in ischämische Bereiche beeinflussen Monozyten auch Tumorwachstum. Um diese Prozesse zu untersuchen, wir Spritzen eine Basalmembran-ähnliche Matrix aus Engelbreth-Holm-Schwarm Maus Sarkom, ein Tumor reiche extrazelluläre Matrix Proteine8, extrahiert und analysieren mit intravitalen Mikroskopie. Diese Matrix wird für Endothelzellen Netzwerkbildung oder Anti-Krebs-Therapien durch Hemmung der Angiogenese zu Probeaufnahmen Moleküle verwendet; in diesem Fall werden wir das Tumor angiogenen Potenzial von Monozyten für Zelle Therapie9,10,11bewerten.
Dieses Protokoll soll eine einfache und effiziente Möglichkeit, immunologische Prozesse verursacht durch Ischämie in einem in Vivo Modell zu studieren nachgewiesen werden. Wir erzeugen eine realistische Testumgebung im Vergleich zur histologischen Aufarbeitung von post-mortem Muskelgewebe.

<table><tbody><tr><td>10% fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL Omnifix -F Insulinspritze</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Spritze&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Deutschland</td><td></td><td>Injectomat-Spritze 50 ml mit Kanüle</td></tr><tr><td>6-Well-Ultra-Low-Attachement-Platten</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8- 12 Wochen alt, männlich, C57BL/6, BalbC Mäuse&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>TESA SE, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akquisitionssoftware</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica Application Suite Erweiterte Fluoreszenz (LAS AF); Ausführung: 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Deutschland</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturmedium</td><td>Hergestellt von unserer Gruppe mit Einzelkomponenten</td><td></td><td>Medium199, 10% Fötales Kälberserum, 1% Antibiotikum (Penicillin/Streptomycin)</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland</td><td></td><td>Allegra X-15R Zentrifuge</td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Veet, Mannheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregon, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desinfektionsmittel</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Skalpell Nr.10&nbsp;</td><td>Feder-Rasierhobel Co.Ltd, Osaka, Japan&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben</td><td>GVB, Herzogenrath, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Rubis, Stabio, Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Hot Plate 062</td></tr><tr><td>Humaner Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland</td><td>SRP3110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Humane Leukozytenfilter</td><td>Blutkonservierungs-Inkubator</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (10%)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leukozyten-Trennröhrchen (Röhrchen mit Filter)&nbsp;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Deutschland</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>Lymphozyten-Trennmedium LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Österreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium M199&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologische Werkbank</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Deutschland</td><td></td><td>Hera sicherer</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopstativ mit Inkubator und Heizeinheit</td><td>; Leica DMI 6000, Pecon, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monozyten-Waschpuffer</td><td>Hergestellt von unserer Gruppe mit Einzelkomponenten</td><td></td><td>PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>Maus-Restrainer</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskop&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica SP5 Konfokales Mikroskop, Cameleon, Coherent</td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG, Berlin, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Zählkammer&nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziel</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland</td><td></td><td>ph 7,4 steriles</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Hergestellt von unserer Gruppe mit Einzelkomponenten</td><td></td><td>90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, &rho;= 1.064 g cm-3</td></tr><tr><td>Percoll Lösung</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Schweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td>10&micro; L/100&Mikro; L/200&Mikro; L/1000&Mikro; L</td></tr><tr><td>Pipetten serologische</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td>&nbsp; Cellstar2ml, 5ml, 10ml</td></tr><tr><td>Pipettierköpfe</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Röhrchen</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gie&szlig; de, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absaugeinheit</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Deutschland</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen mit Kappe</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>Xylazin (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, D&uuml; Düsseldorf, Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravitalen mikroskopie monocyte homing und tumor-bezogene angiogenese in einem mausmodell der peripheren arteriellen verschlusskrankheit

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Das therapeutische Ziel für periphere arterielle Verschlusskrankheit und ischämischen Herzkrankheiten soll Blutfluss auf ischämische Bereiche durch hämodynamische Stenose verursacht zu erhöhen. Gefäßchirurgie ist ein gangbarer Weg in ausgewählten Fällen, sondern für Patienten ohne Indikation für eine Operation wie Fortschreiten zum Ausruhen, Schmerzen, kritische Extremität Ischämie oder größeren Störungen zum Leben oder arbeiten, gibt es nur wenige Möglichkeiten zur Linderung ihrer Krankheit. Zelltherapie über Monocyte-verbesserte Durchblutung durch die Stimulierung der Sicherheiten Bildung ist eine der wenigen nicht-invasive Optionen.
Unsere Gruppe untersucht Arteriogenesis nach der Monocyte Transplantation in Mäuse mit dem Megalosauridae Ischämie-Modell. Wir haben zuvor, Verbesserung der Megalosauridae Perfusion mit Tetanus-stimulierten Phänomen Monocyte Transplantation gezeigt. Neben den Effekten auf die Sicherheiten Bildung könnte diese Therapie sowie Tumorwachstum betroffen sein. Um diese Effekte zu untersuchen, verwenden wir eine Basalmembran-wie Matrix-Maus-Modell durch die Injektion der extrazellulären Matrix von Engelbreth-Holm-Schwarm-Sarkom in der Flanke der Maus, nach Okklusion der Femoral Arterie.
Nach dem Studium der künstlichen Tumor wir verwenden intravitalen Mikroskopie in Vivo Tumor-Angiogenese und Monocyte homing in Sicherheiten Arterien zu studieren. Frühere Studien haben die histologische Untersuchung von Tiermodellen, beschrieben die anschließende Analyse zu Post-Mortem- Artefakten voraussetzt. Unser Ansatz Monocyte Homing auf Bereiche der Besicherung in Echtzeit Sequenzen visualisiert, ist einfach durchzuführen, und den Prozess der Arteriogenesis und Tumor Angiogenesis in Vivountersucht.

Intravitalen Mikroskopie zur Untersuchung von Tumor und Sicherheiten Behälterwachstum ausgelöst durch Monozyten kann helfen, neue Aspekte in die molekularen Mechanismen der Tumor-Angiogenese und Arteriogenesis zeigen. Zellen müssen vorbereitet sein und sorgfältig mit den Schritten des Protokolls injiziert. Unterschiede führen zu Abweichungen zwischen den einzelnen Experimente. Die Monozyten müssen injiziert werden, in das venöse System (Abbildung 1), systemis...

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Hallo, mein Name ist Christian Deffge. Ich bin Arzt am Universitätsklinikum in Magdeburg und arbeite in der kardiovaskulären Forschungsgruppe von Dr. Herold und Professor Braun-Dullaeus. Wir untersuchen die Förderung des Kollateralwachstums.Daher verwenden wir die Bildgebung. In diesem Video möchten wir unsere Methoden erläutern. Resuspendieren Sie die Zellen in serumfreiem Kulturmedium mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.Fügen Sie fünf µL einer einmillimolaren DIO-Lösung in Dimethylformamid zu einem Milliliter der Zellsuspension hinzu und resuspendieren Sie vorsichtig. Inkubieren Sie die Zelllösung 20 Minuten bei 37 °C. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei 500 ×g.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem auf 37 Grad Celsius erwärmten Medium, das mit FCS ergänzt ist. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Zählen Sie die Zellen mithilfe einer Neubauer-Zählkammer und der Lichtmikroskopie.Suspendieren Sie die Zellen erneut in Natriumchloridlösung. Injizieren Sie die Zellen in die Schwanzvene. Die Matrigel-Matrix ist eine rekonstituierte Basalmembranpräparation, die aus dem Plattenepithelsarkom gewonnen wird.Es dient der Untersuchung von Testsubstanzen hinsichtlich der Bildung von endothelialen Zellnetzwerken oder anti-krebswirksamer Therapien durch angiogenetische Hemmung. Wir überprüfen erneut das tumorangiogenetische Potenzial von Monozyten, die wir für die Zelltherapie verwenden möchten. Geben Sie unter sterilen Bedingungen 100 Nanogramm BFGF, 300 Nanogramm VEGFA und 26 internationale Einheiten Heparin zum Matrigel hinzu.Nach dem Vortexen der Lösung füllen Sie diese in eine Ein-Milliliter-Insulinspritze und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis. Um die subkutane Matrigel-Plaque besser sichtbar zu machen, rasieren Sie die Haut der Maus an der Injektionsstelle. Sie können dazu ein scharfes Skalpell oder Enthaarungscreme verwenden.Legen Sie das Tier auf den Tisch und halten Sie die Haut der Maus neben der Injektionsstelle an der Flanke fest. Injizieren Sie 500 Mikroliter Matrigel subkutan. Aus praktischen Gründen ist es notwendig, das Matrigel kompakt an einer Stelle zu injizieren, um eine subkutane Verteilung zu vermeiden.Es wird einfacher sein, die Matrigel-Matrix nach der Tötung der Maus am Ende des Experiments vom Gewebe zu lösen. Üben Sie die Monozyteninjektion mit Natriumchloridlösung vor der eigentlichen Versuchsdurchführung. Wenn die Monozyten nicht systemisch appliziert werden können, wird keine systemische Wirkung auftreten.Innerhalb dieses Protokolls injizierten wir 2,5 Millionen Monozyten. Versuchen Sie, nicht mehr als fünf Mikroliter pro Gramm zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass die Maus während des gesamten Verfahrens mit Hilfe einer Heizplatte erwärmt wird.Für die systemische Applikation der Zellen benötigen Sie einen Halteapparat und eine Ein-Milliliter-Insulinspritze, eine 30-G-Nadel sowie die resuspendierten Monozyten und Natriumchloridlösung. Handhaben Sie die Maus vorsichtig und fixieren Sie das Tier im Halteapparat. Stellen Sie sicher, dass der Maus keine Verletzung zugefügt wird und dass ausreichend Platz zum Atmen vorhanden ist.Platzieren Sie den Halter auf der Heizplatte, sodass der Schwanz die Platte berühren kann. Stellen Sie sicher, dass Sie die Injektionsstelle desinfizieren, um eine Infektion zu vermeiden. Identifizieren Sie die Schwanzvenen, die sich an der Seitenfläche des Schwanzes befinden.Drehen Sie den Schwanz um 90 Grad, sodass die Schwanzvene an der Oberseite des Schwanzes sichtbar wird. Versuchen Sie, die Monozytenlösung in einem flachen Winkel zu injizieren. Beobachten Sie das Tier 30 Minuten lang auf systemische Nebenwirkungen.Stellen Sie die Maus in ihren Käfig, nachdem sich das Tier vollständig erholt hat. Legen Sie die anästhetisierte Maus auf die vorgewärmte Mikroskopbühne, nachdem das Mikroskop stabile Bedingungen erreicht hat und die Einstellungen mit einem Dummy getestet wurden. Fixieren Sie die Pfoten mit Klebeband.Desinfizieren Sie die Haut an der Stelle des Beins oder der Flanke, die für die Mikroskopie verwendet wird. Rasieren Sie den interessierenden Bereich für eine bessere Handhabung und um Störungen durch Haare zu vermeiden. Halten Sie den interessierenden Bereich feucht. Andernfalls wird die Qualität der Bilder und des Gewebes beeinträchtigt. Platzieren Sie das Bein zwischen zwei verstellbaren Stäben. Legen Sie ein Deckglas auf die Stäbe.Beginnen Sie mit der Mikroskopie und passen Sie gegebenenfalls die Position des Beins an. Die Mikroskopeinstellungen hängen von der verwendeten Software ab. Weitere Informationen finden Sie im Protokoll.Unsere Daten zeigen, dass die intravitale Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug zur Visualisierung transplantierte Monozyten im Blutfluss bei kleinen Tiermodellen darstellt. Die Monozyten müssen in das venöse System injiziert werden, um systemische Effekte aufrechtzuerhalten und Embolien vorzubeugen, die auftreten können, wenn die Injektion im arteriellen System durchgeführt wird. Wenn Matrigel verwendet wird, hilft langsames Injizieren, um eine Dispersion zu vermeiden, bei der Plaque-Explantation für weitere histologische Untersuchungen.Innerhalb der Matrigel-Plaque können wir die Angiogenese durch Zählung der Kapillaren unter verschiedenen experimentellen Bedingungen messen. Die Befunde der intravitale Mikroskopie können durch histologische Untersuchung verifiziert werden. Monocyten, die mittels intravitale Mikroskopie detektiert wurden, finden sich in allen Gewebeschnitten.Wenn viel Zeit für die Bildaufnahme benötigt wird, nimmt die Menge an Rhodamin-Dextran im Gefäß ab. Um die Gefäße besser sichtbar zu machen, muss die Applikation des Rhodamin-Dextrans wiederholt werden. Die Verwendung positiver Proben für Zellen auf Matrigel kann helfen, optimale Einstellungen zu erzielen.Das Ziel der Therapie peripherer arterieller Erkrankungen oder ischämischer Herzerkrankungen besteht darin, den Blutfluss zu anderen perfundierten Bereichen zu erhöhen, die durch eine hämodynamische Stenose verursacht wird. Eine Zelltherapie über monocyte-verstärkte Perfusion durch Stimulation der Kollateralbildung stellt eine nichtinvasive Option für Patienten ohne chirurgische Indikation dar. Neben der Entwicklung kollateraler Arterien in ischämischen Bereichen können Monocyten auch das Tumorwachstum beeinflussen.Um diese Prozesse zu untersuchen, verwenden wir die Matrigel-Injektion in Verbindung mit intravitalem Mikroskopie. Unser Ziel mit diesem Protokoll ist es, eine einfache und effiziente Methode zur Untersuchung immunologischer Prozesse, die durch Ischämie verursacht werden, an einem In-vivo-Modell zu demonstrieren. Mit dieser neuen Methode können wir im Vergleich zur histologischen Aufarbeitung von postmortal entnommenem Muskelgewebe ein realistischeres Testumfeld erzeugen.

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Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

In diesem Video demonstrieren wir die Echtzeit-Visualisierung von Blutzell-Endothel-Wechselwirkungen in den Mesenterialvenen eines Mausmodells, das intraperitoneal mit Lipopolysaccharid injiziert wurde.

Intravitalmikroskopie zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und Endothel in einem Entzündungs-Mausmodell

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Durch die Verwendung von transgenen Reportermäusen und injizierbaren Fluoreszenzmarkierungen ermöglicht die konfokale Langzeitmikroskopie mit intravitaler Spinning-Disk die direkte Visualisierung des Verhaltens myeloischer Zellen in intestinalen Adenomen im ApcMin/+ Darmkrebsmodell.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics Apc Min / + Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Dieses Protokoll beschreibt die intravitalen Bildgebung von transgenen Mäusen zellspezifische fluoreszierenden Marker zum Ausdruck zu bringen. Intravitalen Bildgebung stellt eine nicht-invasive Methode für hochauflösende Beobachtungen an lebenden Tieren mit implantierbaren Windows durch die mikroskopische Visualisierung von Prozessen möglich ist. Diese Methode ist besonders nützlich, um längs Prozesse zu studieren.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von transgenen Reporter Mäuse und verschiedenen Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin-II-induzierte Hypertonie mit intravitalen Videomikroskopie der Blutgefäße, um die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten und ihre Fähigkeit, Rollen und halten uns an das Endothel.

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Erfahren Sie die Anwendung der intravitalen Mikroskopie zur Untersuchung von Monozyten-Homing und Angiogenese in einem murinen Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen für die kardiovaskuläre Forschung.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (Video) | JoVE Journal

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

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