Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung der Seelenwanderung von Monozyten in menschlichen Endothelzellen Monolagen und ihre anschließende Reifung in Schaumzellen. Dies stellt eine vielseitige Methode, die atherogenen Eigenschaften von Monozyten aus Menschen mit unterschiedlichen Erkrankungen isoliert zu beurteilen und Faktoren im Blut zu bewerten, die diese Neigung erhöhen können.

Abstract

Koronare Herzkrankheit (KHK) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Arteriosklerose, eine führende Ursache für CAD, ist initiiert von der Seelenwanderung des angeborenen Immunsystems Monozyten zu entzündlichen Websites hinterlegten Lipid namens fetthaltige Streifen, die in Arterienwände des Mediums zu großen Arterien vorhanden sind. Die pathogenen Läsionen in diesem frühen Stadium der Arteriosklerose zeichnet sich die Reifung von Monozyten, die in Arterien zu Schaumzellen oder Lipid-beladene Makrophagen zu migrieren. Beträchtlichen Beweis stützt die Hypothese, das Risiko von Arteriosklerose wird durch chronische Entzündungszustände Begleiterkrankungen wie rheumatoide Arthritis und HIV sowie allgemeine Alterung erhöht, und das dieses Risiko wird durch Monocyte vorhergesagt Aktivierung. Während Maus-Modelle eine gute Plattform bieten, um die Rolle von Monozyten in Atherogenese in Vivozu untersuchen, sie erfordern genetische Veränderung der natürlichen Cholesterin-Stoffwechsel und drastische Veränderung der normalen Maus Diäten, und haben nur begrenzte Eignung für die Studie der atherogenen Einflüsse der menschlichen Comorbid Krankheiten. Dies hat uns motiviert, ein menschlichen in-vitro- Modell zur Messung der atherogenen Potenzials von Monozyten von Individuen mit bestimmten Krankheitszuständen isoliert zu entwickeln. Derzeit sind menschlichen in-vitro- Modelle begrenzt, insofern sie Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung isoliert zu bewerten. Hier beschreiben wir ein Protokoll in der Monozyten aus Patientenblut isolierte transmigrate in menschlichen Endothelzellen in einem Typ-1-Kollagen-Matrix und ihre Neigung zu Schaumzellen in das Vorhandensein oder Fehlen von exogenen Lipid heranreifen wird gemessen. Das Protokoll wurde für die Verwendung von menschlichen Monozyten von Personen mit HIV-Infektion und älteren Menschen, die HIV-nicht infizierten gereinigt validiert. Dieses Modell ist vielseitig und ermöglicht Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewertenden Verwendung entweder Mikroskopie oder Durchflusszytometrie sowie ermöglicht die Beurteilung der atherogenen Faktoren im Serum oder Plasma zu präsentieren.

Introduction

Monocyte Seelenwanderung ist ein entscheidender Schritt in der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, die zu Thrombosen, Schlaganfall und Herzinfarkt führen kann. Arteriosklerotische Plaques entwickeln sich aus fetthaltige Streifen, in der Regel an den Standorten des geringen oszillierenden Blutflusses in Medium zu großen Arterien, wo hinterlegten Lipid trägt zur endotheliale Aktivierung und lokalisierte Entzündung¹vorhanden. Monozyten rekrutiert, Endothelzellen in fetthaltige Streifen über Monocyte chemotaktische Proteine (z. B. CCL2) und transmigrate in der Intima-². Im Anschluss an Seelenwanderung können Monozyt....

Protocol

Hinweis: alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik von Alfred Hospital Komitee der menschlichen Ethik, Melbourne durchgeführt. Alle Versuche wurden in Klasse II Biosicherheit Schränken durchgeführt, sofern nicht angegeben. " Prewarmed " bezieht sich auf Reagenzien auf 37 ° C in einem Wasserbad erwärmt.

1. Vorbereitung der Typ I faserigem Kollagen Gele: Tag1

1. Prepare polymerisiert Kollagen Gele nacheinander hinzufügen und Mischen von 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4,58 mM Essigsäure und 1,71 mg/mL Typ I Kollagen faserige in 5 mL Polystyrol Rohr gemäß Tabelle 1.
   Hinwei....

Results

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung

Monozyten werden hinzugefügt, um das Modell wie in Abbildung 1beschrieben, und sechs Gele sind bereit für jede Bedingung. Monozyten für 6 Gele pro Spender (d.h., 5.0 x 10⁴ Monozyten pro Gel 6 Gele = 3,0 x 10⁵ Monozyten pro Spender) sind zu einem Endvolumen von 600 µL M199 Medien enthält die erforderlichen Se.......

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine vielseitige und physiologisch relevante Methode für die Bewertung der Atherogenicity von Monozyten aus menschlichen klinischen Kohorten durch die Kombination von Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung. Dieses Modell bietet Vorteile gegenüber alternativen Methoden der Zelle Schaumbildung wie es die Wirkung der Monocyte Seelenwanderung auf Zelle Schaumbildung berücksichtigt und die Messung von reverse Seelenwanderung⁶ neben der inhärenten ermögli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Präparationsreagenzien
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0,1 M NaOH verdünnt in H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Essigsäure verdünnt in H20
Cultrex Rinderkollagen I	F& Forschung D Systems	3442-050-01	Typ I Faserkollagen
Name	<>Unternehmen	Katalognummer	<>Kommentare
Zellkultur
M199	Life Technologies	11150-059	M199-Medien, die Earle-Salze, L-Glutamin und 2,2 g/l Natriumbicarbonat enthalten. Medien, ergänzt mit 100 &; micro; g/mL L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin
M20			Supplementiertes M199 mit 20 % hitzeinaktiviertem Pool- oder Spenderserum. Einzelne Lipidspezies wie LDL können zu M199 hinzugefügt werden.
HUVEC			Primäre humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) können aus Nabelschnüren isoliert werden, die mit Einverständniserklärung und Ethikgenehmigung gespendet wurden. Isolierte HUVEC können auch kommerziell erworben werden.
		der menschlichen Koronararterien	Primäre Endothelzellen der Koronararterien können aus gespendeten Arterien mit Einverständniserklärung und Ethikgenehmigung isoliert werden. Isolierte Zellen können auch kommerziell erworben werden.
EDTA	BDH Merck	10093,5V	Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) - 0,5 M, pH 8,0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) - 1 mM, pH 8,0
0,05 % Trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0,05 % Trypsin/0,53 EDTA (1X)
L-Glutamin	Gibco	25030-081	L-Glutamin (200 mM)
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 µ g/mL Streptomycin)
Serum für neugeborene Kälber	Gibco	16010-142	Serum für neugeborene Kälber: neuseeländischen Ursprungs
Fibronektin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronektin - 50 & micro; g/mL Aliquots hergestellt und gelagert
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung (10x): Verdünnt auf 1x mit sterilem H20
0,1% TNF	Gibco	PHC3015	Rekombinantes humanes TNF - Rekonstituiert in H20 und gelagert in 10 & Mikro; g/mL Aliquote
Low-Density Lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-Density Lipoprotein (LDL)
Name	<>Company	Katalognummer	Kommentare
Mikroskopie
1 oder 2% Formaldehyd	Polysciences	4018	1 oder 2 % Formaldehyd, verdünnt mit sterilem H20
50 % und 78 % Methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50 % oder 78 % v/v Methanol, verdünnt mit H20
Öl Rot O-Färbung	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Verdünnen auf 2 mg/ml in 22 % 1M NaOH und 78 % (v/v) Methanol
Objektträger	Mikro-Glass	S41104AMK	Zwei mattierte 45 Grad geschliffene Mikroskop-Objektträger (25 x 76 mm)
Deckgläser	Menzel-Glä ser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1,5 Glasabdeckgläser
Doppelseitiges Klebeband	3M Scotch	4011	Superstarkes Außenmontageband (25,4 mm x 1,51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsas Azur Eosin Methylenblau Lösung (verdünntes Material 1:10 in H20)
Locher			Handgeführter Einzellocher (6,35 mm Locher)
Name	<>Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Durchflusszytometrie
Kollagenase D	Diagnostics	11088858001	Kollagenase D verdünnt in M199-Medien auf 1 mg/ml
35 & Mikro; m Nylon-Mesh-beschichtete Polystyrol-FACS-Schläuche	BD Biosciences	352235	35 µ m Nylon-Mesh-bedeckte Polystyrol-FACS-Schläuche
Lebend/tot fixierbarer gelber Fleck für tote Zellen	Life Technologies	L34959	Lebend/tot fixierbarer gelber Fleck für tote Zellen
FACS-Waschen			Bereiten Sie sich vor, indem Sie 1 x PBS-, 2 mM EDTA und 1 % Serum für neugeborene Kälber
mischenName	<>Unternehmen<	strong>Katalognummer	Kommentare
Plasticware96 Well-Platte
	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottom 96 well plate
10 cm Petrischale	TPP	93100	Steril 10 cm Petrischale
1,5 mL Eppendorf Röhrchen	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf Röhrchen
Transfer Pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile Transferpipette (1 mL, großer Kolben)