Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

Summary

Wir beschreiben ein experimentelles Verfahren zur Messung der neuronalen Aktivität durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P) Mikroskopie in Vivo.

Abstract

Das Gehirn von Säugetiere weist deutliche Symmetrie in der Sagittalebene. Detaillierte Beschreibung der neuronalen Dynamik in symmetrischen Gehirnregionen bei erwachsenen Säuger bleibt jedoch schwer. In dieser Studie beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Messung der Kalzium-Dynamik durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P)-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Aufnahmen und Quantifizierungen der neuronalen Aktivität in bilateralen Maus Gehirnregionen eins zu einem Zeitpunkt im gleichen Experiment für einen längeren Zeitraum in Vivo. Schwerpunkte dieser Methode, die innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden können, sind minimal-invasive Chirurgie Verfahren zum Erstellen von dual optische Fenster und die Verwendung der 2P-Bildgebung. Obwohl wir nur die Technik im Bereich S1 zeigen, kann die Methode auf andere Regionen des lebenden Gehirns erleichtern die Aufklärung der strukturellen und funktionellen Komplexität des Gehirns neuronale Netze angewendet werden.

Introduction

Kalzium und seine Regulierung sind unerlässlich bei der Vermittlung mehrerer physiologischer Prozesse. Überwachung von Kalzium Dynamik ist hilfreich für das Verständnis der normalen Gehirnfunktion sowie pathologische Zustände des Gehirns Störungen ^{1,2,3,4,5,6 ,7,8}. GCaMP6s Fluoreszenz Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Quantifizierung der Spike-Nummern, timing, und Frequenz sowie Ebenen der synaptischen Eingang sowohl in Vitro und in Vivo ^9,10,11.

Das Gehirn von Säugetiere weist deutliche Symmetrie in der Sagittalebene. Obwohl neuere neurologische Forschung über die kortikalen Umgestaltung Aufschluss hat und neuronaler Aktivität durch traumatische Gehirn oder Rückenmark Verletzungen ^6,7, die Rollen, dass intakte Gewebe der symmetrisch ausgelöst spielen entsprechende Regionen bei der Wiederherstellung sind noch unklar.

In dieser Studie beschreiben wir experimentelle Verfahren zum Erstellen von bilaterale symmetrische optische Fenster für in-Vivo Bildgebung. Mit dieser optischen Fenster, beschreiben wir das Messen von Kalzium Dynamik von primären somatosensorischen Cortex (S1) in GCaMP6s transgene Mäuse mit 2P Mikroskopie. Im Abschnitt “Ergebnisse” zeigen wir auch in Vivo dendritischen Morphologie zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der S1-Region in den EGFP transgenen Mäusen mit 2P Bildgebung. Die Beobachtungsmethode hinsichtlich der Netzwerk-Dynamik in den bilateralen S1-Bereichen ist aber ein erstes Beispiel von wie dual kranialen Fenster Neurowissenschaftler, lokalen und symmetrische Informationsverarbeitung in das Erwachsene Gehirn von Säugetieren in normalen Sonde hilft Bedingungen oder bei anderen Krankheit in VivoModellen.

Protocol

Alle chirurgischen und Tier Handhabung wurden durchgeführt, als unter der Führung für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und die Leitlinien der Indiana Universität Schule von Medizin institutionelle Animal Care und Nutzung genehmigt Ausschuss. Die schematische Darstellung des 2-Photon imaging Setup ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Vorbereitung des Tieres für die Bildgebung

1. Statt steriler Gaze, Wattestäbchen und autoklaviert chirurgische Instrumente im OP-Bereich (Tabelle 1). Schalten Sie ein Mikro Perle Sterilisator für intersurgery Sterilisation chirurgischer Instrumente.
2. Die Maus (männlich oder weiblich, 1,5 – 2,5 Monate, 20 – 25 g) durch intraperitoneale Injektion (i.p.) aus einer Mischung von Acepromazine (0,238 mg/mL) (6 µL/g Körpergewicht), Ketamin (17,2 mg/mL) und Xylazin (0,475 mg/mL) zu betäuben. Warten Sie, bis die richtige Tiefe der Narkose erreicht ist, wenn das Tier nicht mehr auf einen Zeh Prise Reiz reagieren und keine Hornhaut Reflex hat. Während der Operation geben eine Booster-Dosis von 1/3 die ursprüngliche Dosis des Betäubungsmittels als cocktail mußte die Narkose Originalzustand beibehalten.
3. Buprenorphin subkutan zu injizieren (s.c.; 0,05-0,10 mg/kg) als schmerzstillende Mittel vor der Operation. Gelten Sie schützende Salbe für die Augen des Tieres, Hornhaut trocknen und Katarakt-Bildung zu verhindern.
4. Legen Sie eine GCaMP6s transgenen Maus auf ein Heizkissen zu verhindern Hypothermie und bedecken Sie es mit einem sterilen OP-Tuch. Stabilisieren Sie den Kopf des Tieres mit einem Kopf halten Adapter für Mäuse.
5. Rasieren des Kopfes über den größten Teil der Kopfhaut mit einer Rasierklinge zweischneidiges. Reinigen Sie den OP-Bereich mit einem sterilen Vorbereitung Alkoholtupfer gefolgt von Povidon-Jod-Lösung.

2. chronische kranialen Fenster Vorbereitung

1. Machen Sie einen rechteckigen Schnitt der Kopfhaut (2 x 3 mm) mit einer Schere auf einer Seite (rechts) des Schädels. Drücken Sie die Haut mit einem Wattestäbchen erstelle ich ein Belichtungsbereich von > 3 mm im Durchmesser (Abb. 3A). Entfernen Sie das Bindegewebe befestigt an den Schädel durch vorsichtig abkratzen des Schädels mit einem stumpfen mikrochirurgischen Messer (Skalpell Klinge #10; Abbildung 3).
2. Markieren Sie den Bereich S1 sanft einen Kreis gezeichnet (3 mm im Durchmesser, Zentrum Koordination:-1,50 mm von der Bregma und 2,5 mm von der Mittellinie) auf den Schädel mit einem Dental bohren (Abb. 2 b).
3. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken Schädel (Abb. 2 b).
4. Wenden Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat Super Glue bis auf die Knochen um eine Basis für dental Zement Anwendung bereitzustellen.
5. Unter dem sezierenden Mikroskop dünn auf eine kreisförmige Nut in den Schädel um den S1-Bereich mit einem High-Speed-Microdrill (Abbildung 3D). Das Ziel ist die Schaffung eine glatte Kante für die Platzierung eines optischen Fensters drauf.
6. Immer wieder gelten Sie künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS, Raumtemperatur) für den Schädel in regelmäßigen Abständen während der Ausdünnung Prozess zu erleichtern, Bohren und Wärme. Führen Sie das Bohren zeitweise um Reibung-induzierte eine Überhitzung zu vermeiden. Nuckeln Sie die Knochen-Trümmer mit einem Haus Vakuumleitung oder einer Vakuumpumpe.
7. Nach ca. 2/3 Tiefe der Knochen gebohrt wird, langsam und vorsichtig dünn die Restknochenhöhe 1/3 bis ein rundes Stück des Schädels (Knochen-Klappe) völlig frei von den umliegenden Schädel ist.
8. Langsam und vorsichtig entfernen Sie die kreisförmigen Knochen-Klappe mit einem paar # 5/45 Zange zu und setzen Sie die Dura (Abbildung 2; Abbildung 3E).
9. Halten Sie die exponierten Hirnregion feucht mit ACFS (Abbildung 3E). Vermeiden Sie Schäden an pial Schiffe, da Blutung Hirndurchblutung verändert, Gehirn Schwellung zu beschleunigen und Bildqualität stark beeinträchtigen.
10. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken (kontralateralen) Seite des Schädels.
11. Benutzen Sie für die Montage der optischen Fenster optische Kleber Kleber und Heilung zwischen Deckglas Schichten zu einem Zeitpunkt. Bei Bedarf erwärmen Sie das optische Fenster (50 ° C für 12 h) in einem Inkubator, die Verklebung zu verbessern. Das optische Fenster enthält 2 Portionen: der obere Teil enthält ein einzelnes Runde Abdeckung Glas mit einem Durchmesser von 5 mm und im unteren Teil 1 – 3 Runde Deckgläser mit einem Durchmesser von 3 mm (Abb. 2D).
12. Das optische Fenster in Ethanol (70 %, Vol/Vol) speichern und mit steriler Kochsalzlösung vor Gebrauch abspülen. Überprüfen Sie vor dem optischen Fenster Einbau das optische Fenster für Mängel, einschließlich einen falschen Betrag des optischen Klebstoff oder ungenaue Ausrichtung unter einem Stereoskop.
13. Installieren Sie das optische Fenster über der Kraniotomie Region (Abb. 2D). Der obere Teil des optischen Fensters ruht auf den Schädel und der unteren Teil des optischen Fensters innerhalb der craniotomized Öffnung passt und beruht auf der Dura im Beisein von CSF (Abbildung 2D, E).
14. Dichtung im oberen Teil des optischen Fensterrand an den Schädel mit den Cyanacrylat Super Glue (Abbildung 2F; Abbildung 3F).
15. Wenn der Cyanacrylat-Super-Kleber getrocknet ist, gelten Sie schwarze dental Zement (Dentsply) zur Deckung der Glaskante. Dental Zement auf der exponierten Schädel anwenden und Wunde Margen zu blockieren, Licht (Abbildung 2-H; Abb. 3 b).
16. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken Seite.
17. Lassen Sie das Tier erholen auf das Heizkissen und das Tier zu seinem Hause Käfig für die Wiederherstellung unter angemessene Überwachung zurückkehren. Bieten Sie Nassfutter um kauen und Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern. Um Schmerzen zu reduzieren, verwalten Buprenorphin s.c. (0,05-2,0 mg/kg) alle 8 – 12 h Postinjury für 2 Tage. Lassen Sie die Maus zu erholen um weitere 7 – 10 Tage vor der Bildgebung.

3. zwei-Photon imaging

1. Am Tag des Experiments betäuben Sie das Tier mit Ketamin und Xylazin (Dosen und Aufrechterhaltung der Anästhesie wie oben beschrieben). Reinigen Sie die kraniale Fenster mit 75 % (Vol/Vol) Ethanol.
2. Platzieren Sie den Mauszeiger unter einer bildgebenden Aufbau bestehend aus einem 2P-Mikroskop und den Kopf halten Adapter, ruht auf einem Heizkissen mit seinem Kopf bewegungsunfähig durch Ohr Bars auf einen Maus-Kopf-Halter befestigt.
3. Bild einer Seite des optischen Fensters zu einem Zeitpunkt. Zur Minimierung von optischen Aberrationen stellen Sie sicher, dass das optische Fenster und rechten Schädel orientierten senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops.
4. Nehmen Sie sich ein erstes Bild des kranialen Fensters mit Hellfeld-Beleuchtung bei 4 X Vergrößerung als eine Referenzkarte für Registrierung bei höherer Vergrößerung 2P Angiographien (Abbildung 4A1).
5. Vergrößern Sie den gewünschten Bereich mit 10 X Vergrößerung (Abbildung 4A2).
6. Wählen Sie ein Interessengebiet im Bereich S1 in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 µm unterhalb der pial Oberfläche). Wenn höherer Vergrößerung gewünscht wird, verwenden Sie ein 20 X Objektiv.
7. Suchen Sie ein Sichtfeld mit mehreren Neuronen. Abrufen von Bildern mit einem 2P-Mikroskop (Abb. 4 b). Bestimmen der Belichtungszeit und Anregung Licht-Ebene (≈910 nm) abhängig von der Tiefe und Ausdruck GCaMP6s, mit schwächeren Signalen erfordern längere Belichtungszeiten und übereinstimmend weniger zeitliche Auflösung. Wir verwenden in der Regel ~ 4 µs pro Pixel Belichtungszeiten. Abrufen von Bildern mit Bildraten von 3 – 5 Hz bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel.
8. Die Zeitreihe Aufnahme starten. Speichern Sie Koordinaten für alle Regionen von Interesse (ROI) bezogen auf das vaskuläre Muster oder so Punkte in geringer Vergrößerung Bilder. Bild der gleichen ROI im Laufe der Zeit. Führen Sie das gleiche Verfahren, um Kalzium Dynamik von der S1-Bereich auf der linken Hemisphäre beobachten. Berechnen Sie Änderungen in Fluoreszenz von jedem ROI.
9. Bilder zu erwerben, entweder einzeln oder als Zeitraffer-Film (Abbildung 41-C3, D, E).
10. Studie kortikalen blood Flow Dynamics in Vivo durch bildgebende Dextran fluoreszierende Farbstoffe injiziert in die Rute Vene von Nagetieren mit 2P-Mikroskopie. Verwenden Sie Vasculatures als Wahrzeichen zu erkennen und Bild den gleichen ROI Imaging-Sitzungen über einen längeren Zeitraum.

4. Datenverarbeitung

1. Verwenden Sie ImageJ und Herkunft für die Bildanalyse. Importieren von Bildsequenzen mit ImageJ (Abbildung 5A-B). Wählen Sie für einzelne Bilder (oder t-Serie Filme) einen ROI innerhalb einer abgebildeten Neurons und 2 separaten nahe gelegenen Regionen für Hintergrundmessung (Abbildung 5). Erwerben Sie die Gesamtintensität mit einem ROI-Manager (Abbildung 5C).
   Hinweis: Bild 6 zeigt repräsentative Kalzium Bilder. Kalzium Transient (grün) und Blutgefäße (rot) zeigen zu verschiedenen Zeitpunkten in Sekunden (Abbildung 6A-D) in einer Maus auf 7D nach dem ersten Fenster Einbau. Die Z-Projektion ein 3 min Aufzeichnungszeit für roten und grünen Kanal (Abb. 6E) oder Grün-Kanal (Abb. 6F) wird ebenfalls angezeigt. Eine Z-Projektion zeigt ein komprimiertes Abbild aller Bilder in dem Film aus dem Rough und Kreis Grenze (umfasst das Objekt Neuron von Interesse in allen Frames) sowie die Auswahl der unabhängigen in der Nähe Hintergrund Regionen ( 2 manuell ausgewählt ist Abbildung 6).
2. Von jedem ROI, berechnen die durchschnittliche Fluoreszenz Hintergrund FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 und die Fluoreszenz-Änderungen von Soma (F) ausgedrückt als ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Führen Sie die Spitze Analyse Schritt für Schritt mit Funktionen von ImageJ einschließlich Basislinienkorrektur, Peak Finding/Bestimmung, Peak-Integration, Anpassung Peak und/oder Time-Saving-Peak-Analyse-Funktionen.

Representative Results

Discussion

Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglicht die gleichzeitige Messung der Aktivität von vielen Zellen mit einer vernünftigen Auflösung bei bis zu ca. 800 µm unterhalb der Oberfläche des Gehirns. Wir integrierte 2P und eine dual optische Fenster-Technik mit genetisch codierten GCaMP6s Kalzium Dynamik in den Bevölkerungen der Schicht V neuronalen Somata befindet sich beobachten > 500 µm unterhalb der Pia. Bei offenem optische Fenster auf jeder Seite des Schädels ermöglicht die Methode Aufnahmen der neuronalen Aktivität über symmetrische Gehirn von Säugetieren Regionen für lange und stabile Kalzium in Vivoimaging. Schwerpunkte dieser Methode sind die Leistung der minimal invasiven Chirurgie duale offenen Schädel optische Fenster erstellen und 2P Bildgebung neuronaler Aktivität in symmetrischen S1-Regionen.

Prüfung der Netzwerkaktivität in bilateralen S1 Regionen ist ein Beispiel für wie dual kranialen Fenster verwendet werden könnten, lokalen und symmetrische Informationsverarbeitung im erwachsenen Gehirn in Vivozu untersuchen. Diese Methode kann auch verwendet werden, zur Untersuchung der neuronalen Aktivität (z.B. mit Hilfe von Thy1 –GCaMP6s Mäusen) und kortikale Plastizität B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J von intaktem Gewebe der entsprechenden symmetrischen Regionen Erholung nach Deafferentation aufgrund einer einseitigen CNS Verletzung. Die Methode kann auch verwendet werden, kortikale Aktivität als Reaktion auf periphere Stimulation Strategien wie optogenetische, elektrische oder chemische Reize zu untersuchen. Obwohl wir nur die Technik im Bereich S1 zeigen, könnte dieser Ansatz eingesetzt werden, um die Aktivitäten in anderen symmetrischen Gebieten lebenden Gehirn wie der Schicht V Neuronen des primären motorischen Kortex (M1) untersuchen. Bemerkungen zur Reorganisation von Hirnregionen können ein neuronales Substrat für adaptive motor Verhalten liefern, die eine entscheidende Rolle bei der postinjury Wiederherstellung der Funktion spielt. Es ermöglicht auch chronischen Messung der symmetrischen Aktivität genetisch identifizierten Zellen während Verhalten bei Mäusen Kopf fixiert.

Technisch sollten Ermittler sorgfältig auf die Qualität und Konsistenz der dual kranialen Fenster achten. Ausgedünnt-Totenkopf kranialen Fenster Technik ¹² empfiehlt sich für Anfänger zum üben. Stacheln sind Kalzium Fächer aufgrund ihrer Morphologie und lokale Zustrom und Extrudieren Mechanismen. In dieser Studie verwendeten wir B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J Mäusen als Beispiel dendritische Wirbelsäule Dynamik in Vivo (Abbildung 4) nachweisen. Eine offenen Schädel Glas Fenster Installation verursachen hohe Wirbelsäule Umsatz und reaktive glialer Reaktionen nach Chirurgie ¹². Im Gegensatz dazu können mit verdünnt-Totenkopf Fenstertechnik, Stacheln und Dendriten gut konserviert werden.

Auswahl an Abmessungen und dicken von optischen Fenster werden das gewünschte Sichtfeld, die Krümmung der Schädel, Schädel Dicke und die Art der Bildgebung ¹³abhängig sein. Zu niedriger Druck des optischen Coverglasses auf die Dura verursachen Verdickung der Dura, Nachwachsen des Schädels, und Gehirn Bewegung erhöht. Im Gegensatz dazu kann übermäßiger Druck des optischen Coverglasses kortikalen Blutfluss behindern.

Für optische Fenster Montage kleben und zusätzliche Schichten von Coverglasses eine zu einem Zeitpunkt mit optischen Kleber und langwellige UV-Licht zu heilen. Zur Stärkung der Klebtechnik warm gefertigte Fenster (50 ° C für 12 h) in einem Inkubator. Optische Fenster Deckglas in Ethanol 70 % (Vol/Vol) aufbewahren und vor der Operation mit steriler Kochsalzlösung durchspülen. Das optische Fenster für Mängel (z. B. einen falschen Betrag des optischen Klebstoff oder ungenaue Ausrichtung) untersucht werden muss unter einem Stereoskop vor Gebrauch, Fehler zu vermeiden. Wenn der optische Klebstoff zu dünn ist, kann Lufträume zerknittert werden die optischen Aberrationen oder Deckglas Ablösung mit der Einnistung führen kann. Im Gegensatz dazu kann zu viel optischen Kleber Überlauf vorbei an den Rändern des kranialen Fensters zu verursachen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, beschreiben wir hier ein experimentelles Verfahren zur Messung von Kalzium Dynamik oder dendritische Morphologie durch kranialen Fenster aus 2 symmetrischen primäre somatosensorische kortikalen Regionen Thy1-GCaMP6s und Thy1– YFP transgene Mäuse, bzw. Verwendung 2P Mikroskopie. Diese Technik kann erheblich erleichtern sezieren die komplexe strukturelle und funktionelle Beziehung neuronaler Netze.

Materials

C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. 
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	–	–	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO<sub>3</sub>, 1.25 mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, 2 mM CaCl<sub>2</sub>, 1 mM MgCl<sub>2</sub> and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.