Name: Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Erfahren Sie die bilaterale Calcium-Imaging-Methode im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1-GCaMP6s-Mäusen. Diese Technik ermöglicht langzeitige In-vivo-Aufnahmen neuronaler Aktivität mit Zwei-Photonen-Mikroskopie.

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Wir sind sehr dankbar, Wenbiao Gan (Skirball Institute, Institut für Physiologie und Neurologie, New York University School of Medicine, USA) für hervorragende technische Anleitung und Patti Raley, Medical Editor (Abteilung der neurologischen Chirurgie, Indiana Universitätsschule von Medizin), für die Bearbeitung der Handschrift. Wir danken Dr. Jinhui Chen (Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) für die Bereitstellung von B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J Mäusen. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Gründung der Direktor des Allgemeinen Krankenhauses von Jinan militärische Region von Chines PLA 2016ZD03 unterstützt (XJL) und NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Verdienst Review Award I01 BX002356 aus dem US-Department of Veterans Angelegenheiten, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana Rückenmark und Gehirn Verletzungen Research Foundation, Mari Hulman George Stiftungsfonds (XMX).

Alle chirurgischen und Tier Handhabung wurden durchgeführt, als unter der Führung für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und die Leitlinien der Indiana Universität Schule von Medizin institutionelle Animal Care und Nutzung genehmigt Ausschuss. Die schematische Darstellung des 2-Photon imaging Setup ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Vorbereitung des Tieres für die Bildgebung
<ol><li>Statt steriler Gaze, Wattestäbchen und autoklaviert chirurgische Instrumente im OP-Bereich (Tabelle 1). Schalten Sie ein Mikro Perle Sterilisator für intersurgery Sterilisation chirurgischer Instrumente.</li>
	<li>Die Maus (männlich oder weiblich, 1,5 – 2,5 Monate, 20 – 25 g) durch intraperitoneale Injektion (i.p.) aus einer Mischung von Acepromazine (0,238 mg/mL) (6 µL/g Körpergewicht), Ketamin (17,2 mg/mL) und Xylazin (0,475 mg/mL) zu betäuben. Warten Sie, bis die richtige Tiefe der Narkose erreicht ist, wenn das Tier nicht mehr auf einen Zeh Prise Reiz reagieren und keine Hornhaut Reflex hat. Während der Operation geben eine Booster-Dosis von 1/3 die ursprüngliche Dosis des Betäubungsmittels als cocktail mußte die Narkose Originalzustand beibehalten.</li>
	<li>Buprenorphin subkutan zu injizieren (s.c.; 0,05-0,10 mg/kg) als schmerzstillende Mittel vor der Operation. Gelten Sie schützende Salbe für die Augen des Tieres, Hornhaut trocknen und Katarakt-Bildung zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie eine GCaMP6s transgenen Maus auf ein Heizkissen zu verhindern Hypothermie und bedecken Sie es mit einem sterilen OP-Tuch. Stabilisieren Sie den Kopf des Tieres mit einem Kopf halten Adapter für Mäuse.</li>
	<li>Rasieren des Kopfes über den größten Teil der Kopfhaut mit einer Rasierklinge zweischneidiges. Reinigen Sie den OP-Bereich mit einem sterilen Vorbereitung Alkoholtupfer gefolgt von Povidon-Jod-Lösung.</li>
</ol>2. chronische kranialen Fenster Vorbereitung
<ol><li>Machen Sie einen rechteckigen Schnitt der Kopfhaut (2 x 3 mm) mit einer Schere auf einer Seite (rechts) des Schädels. Drücken Sie die Haut mit einem Wattestäbchen erstelle ich ein Belichtungsbereich von > 3 mm im Durchmesser (Abb. 3A). Entfernen Sie das Bindegewebe befestigt an den Schädel durch vorsichtig abkratzen des Schädels mit einem stumpfen mikrochirurgischen Messer (Skalpell Klinge #10; Abbildung 3).</li>
	<li>Markieren Sie den Bereich S1 sanft einen Kreis gezeichnet (3 mm im Durchmesser, Zentrum Koordination:-1,50 mm von der Bregma und 2,5 mm von der Mittellinie) auf den Schädel mit einem Dental bohren (Abb. 2 b).</li>
	<li>Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken Schädel (Abb. 2 b).</li>
	<li>Wenden Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat Super Glue bis auf die Knochen um eine Basis für dental Zement Anwendung bereitzustellen.</li>
	<li>Unter dem sezierenden Mikroskop dünn auf eine kreisförmige Nut in den Schädel um den S1-Bereich mit einem High-Speed-Microdrill (Abbildung 3D). Das Ziel ist die Schaffung eine glatte Kante für die Platzierung eines optischen Fensters drauf.</li>
	<li>Immer wieder gelten Sie künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS, Raumtemperatur) für den Schädel in regelmäßigen Abständen während der Ausdünnung Prozess zu erleichtern, Bohren und Wärme. Führen Sie das Bohren zeitweise um Reibung-induzierte eine Überhitzung zu vermeiden. Nuckeln Sie die Knochen-Trümmer mit einem Haus Vakuumleitung oder einer Vakuumpumpe.</li>
	<li>Nach ca. 2/3 Tiefe der Knochen gebohrt wird, langsam und vorsichtig dünn die Restknochenhöhe 1/3 bis ein rundes Stück des Schädels (Knochen-Klappe) völlig frei von den umliegenden Schädel ist.</li>
	<li>Langsam und vorsichtig entfernen Sie die kreisförmigen Knochen-Klappe mit einem paar # 5/45 Zange zu und setzen Sie die Dura (Abbildung 2; Abbildung 3E).</li>
	<li>Halten Sie die exponierten Hirnregion feucht mit ACFS (Abbildung 3E). Vermeiden Sie Schäden an pial Schiffe, da Blutung Hirndurchblutung verändert, Gehirn Schwellung zu beschleunigen und Bildqualität stark beeinträchtigen.</li>
	<li>Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken (kontralateralen) Seite des Schädels.</li>
	<li>Benutzen Sie für die Montage der optischen Fenster optische Kleber Kleber und Heilung zwischen Deckglas Schichten zu einem Zeitpunkt. Bei Bedarf erwärmen Sie das optische Fenster (50 ° C für 12 h) in einem Inkubator, die Verklebung zu verbessern. Das optische Fenster enthält 2 Portionen: der obere Teil enthält ein einzelnes Runde Abdeckung Glas mit einem Durchmesser von 5 mm und im unteren Teil 1 – 3 Runde Deckgläser mit einem Durchmesser von 3 mm (Abb. 2D).</li>
	<li>Das optische Fenster in Ethanol (70 %, Vol/Vol) speichern und mit steriler Kochsalzlösung vor Gebrauch abspülen. Überprüfen Sie vor dem optischen Fenster Einbau das optische Fenster für Mängel, einschließlich einen falschen Betrag des optischen Klebstoff oder ungenaue Ausrichtung unter einem Stereoskop.</li>
	<li>Installieren Sie das optische Fenster über der Kraniotomie Region (Abb. 2D). Der obere Teil des optischen Fensters ruht auf den Schädel und der unteren Teil des optischen Fensters innerhalb der craniotomized Öffnung passt und beruht auf der Dura im Beisein von CSF (Abbildung 2D, E).</li>
	<li>Dichtung im oberen Teil des optischen Fensterrand an den Schädel mit den Cyanacrylat Super Glue (Abbildung 2F; Abbildung 3F).</li>
	<li>Wenn der Cyanacrylat-Super-Kleber getrocknet ist, gelten Sie schwarze dental Zement (Dentsply) zur Deckung der Glaskante. Dental Zement auf der exponierten Schädel anwenden und Wunde Margen zu blockieren, Licht (Abbildung 2-H; Abb. 3 b).</li>
	<li>Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken Seite.</li>
	<li>Lassen Sie das Tier erholen auf das Heizkissen und das Tier zu seinem Hause Käfig für die Wiederherstellung unter angemessene Überwachung zurückkehren. Bieten Sie Nassfutter um kauen und Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern. Um Schmerzen zu reduzieren, verwalten Buprenorphin s.c. (0,05-2,0 mg/kg) alle 8 – 12 h Postinjury für 2 Tage. Lassen Sie die Maus zu erholen um weitere 7 – 10 Tage vor der Bildgebung.</li>
</ol>3. zwei-Photon imaging
<ol><li>Am Tag des Experiments betäuben Sie das Tier mit Ketamin und Xylazin (Dosen und Aufrechterhaltung der Anästhesie wie oben beschrieben). Reinigen Sie die kraniale Fenster mit 75 % (Vol/Vol) Ethanol.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger unter einer bildgebenden Aufbau bestehend aus einem 2P-Mikroskop und den Kopf halten Adapter, ruht auf einem Heizkissen mit seinem Kopf bewegungsunfähig durch Ohr Bars auf einen Maus-Kopf-Halter befestigt.</li>
	<li>Bild einer Seite des optischen Fensters zu einem Zeitpunkt. Zur Minimierung von optischen Aberrationen stellen Sie sicher, dass das optische Fenster und rechten Schädel orientierten senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops.</li>
	<li>Nehmen Sie sich ein erstes Bild des kranialen Fensters mit Hellfeld-Beleuchtung bei 4 X Vergrößerung als eine Referenzkarte für Registrierung bei höherer Vergrößerung 2P Angiographien (Abbildung 4A1).</li>
	<li>Vergrößern Sie den gewünschten Bereich mit 10 X Vergrößerung (Abbildung 4A2).</li>
	<li>Wählen Sie ein Interessengebiet im Bereich S1 in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 µm unterhalb der pial Oberfläche). Wenn höherer Vergrößerung gewünscht wird, verwenden Sie ein 20 X Objektiv.</li>
	<li>Suchen Sie ein Sichtfeld mit mehreren Neuronen. Abrufen von Bildern mit einem 2P-Mikroskop (Abb. 4 b). Bestimmen der Belichtungszeit und Anregung Licht-Ebene (≈910 nm) abhängig von der Tiefe und Ausdruck GCaMP6s, mit schwächeren Signalen erfordern längere Belichtungszeiten und übereinstimmend weniger zeitliche Auflösung. Wir verwenden in der Regel ~ 4 µs pro Pixel Belichtungszeiten. Abrufen von Bildern mit Bildraten von 3 – 5 Hz bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel.</li>
	<li>Die Zeitreihe Aufnahme starten. Speichern Sie Koordinaten für alle Regionen von Interesse (ROI) bezogen auf das vaskuläre Muster oder so Punkte in geringer Vergrößerung Bilder. Bild der gleichen ROI im Laufe der Zeit. Führen Sie das gleiche Verfahren, um Kalzium Dynamik von der S1-Bereich auf der linken Hemisphäre beobachten. Berechnen Sie Änderungen in Fluoreszenz von jedem ROI.</li>
	<li>Bilder zu erwerben, entweder einzeln oder als Zeitraffer-Film (Abbildung 41-C3, D, E).</li>
	<li>Studie kortikalen blood Flow Dynamics in Vivo durch bildgebende Dextran fluoreszierende Farbstoffe injiziert in die Rute Vene von Nagetieren mit 2P-Mikroskopie. Verwenden Sie Vasculatures als Wahrzeichen zu erkennen und Bild den gleichen ROI Imaging-Sitzungen über einen längeren Zeitraum.</li>
</ol>4. Datenverarbeitung
<ol><li>Verwenden Sie ImageJ und Herkunft für die Bildanalyse. Importieren von Bildsequenzen mit ImageJ (Abbildung 5A-B). Wählen Sie für einzelne Bilder (oder t-Serie Filme) einen ROI innerhalb einer abgebildeten Neurons und 2 separaten nahe gelegenen Regionen für Hintergrundmessung (Abbildung 5). Erwerben Sie die Gesamtintensität mit einem ROI-Manager (Abbildung 5C). Hinweis: Bild 6 zeigt repräsentative Kalzium Bilder. Kalzium Transient (grün) und Blutgefäße (rot) zeigen zu verschiedenen Zeitpunkten in Sekunden (Abbildung 6A-D) in einer Maus auf 7D nach dem ersten Fenster Einbau. Die Z-Projektion ein 3 min Aufzeichnungszeit für roten und grünen Kanal (Abb. 6E) oder Grün-Kanal (Abb. 6F) wird ebenfalls angezeigt. Eine Z-Projektion zeigt ein komprimiertes Abbild aller Bilder in dem Film aus dem Rough und Kreis Grenze (umfasst das Objekt Neuron von Interesse in allen Frames) sowie die Auswahl der unabhängigen in der Nähe Hintergrund Regionen ( 2 manuell ausgewählt ist Abbildung 6).</li>
	<li>Von jedem ROI, berechnen die durchschnittliche Fluoreszenz Hintergrund FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 und die Fluoreszenz-Änderungen von Soma (F) ausgedrückt als ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.</li>
	<li>Führen Sie die Spitze Analyse Schritt für Schritt mit Funktionen von ImageJ einschließlich Basislinienkorrektur, Peak Finding/Bestimmung, Peak-Integration, Anpassung Peak und/oder Time-Saving-Peak-Analyse-Funktionen.</li>
</ol>

<ol><li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch-specific+dendritic+Ca%282%2B%29+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li>
<li>Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+mouse+higher+visual+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of mouse higher visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Katona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+Dendritic+Spines+in+the+Hindlimb+Representation+of+the+Sensory+Cortex+after+Spinal+Cord+Hemisection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), e0132077(2015).</li>
<li>Keck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+and+homeostatic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
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<li>Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+Microcircuit-Level+Substrates+for+Attention+Are+Disrupted+in+Mouse+Models+of+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism.</a> Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).</li>
<li>Wachowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+dissection+of+odor+information+processing+in+vivo+using+GCaMPs+expressed+in+specified+cell+types+of+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
</ol>

Autoren haben nichts preisgeben.

Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglicht die gleichzeitige Messung der Aktivität von vielen Zellen mit einer vernünftigen Auflösung bei bis zu ca. 800 µm unterhalb der Oberfläche des Gehirns. Wir integrierte 2P und eine dual optische Fenster-Technik mit genetisch codierten GCaMP6s Kalzium Dynamik in den Bevölkerungen der Schicht V neuronalen Somata befindet sich beobachten > 500 µm unterhalb der Pia. Bei offenem optische Fenster auf jeder Seite des Schädels ermöglicht die Methode Aufnahmen der neuronalen Aktivität über symmetrische Gehirn von Säugetieren Regionen für lange und stabile Kalzium in Vivoimaging. Schwerpunkte dieser Methode sind die Leistung der minimal invasiven Chirurgie duale offenen Schädel optische Fenster erstellen und 2P Bildgebung neuronaler Aktivität in symmetrischen S1-Regionen.
Prüfung der Netzwerkaktivität in bilateralen S1 Regionen ist ein Beispiel für wie dual kranialen Fenster verwendet werden könnten, lokalen und symmetrische Informationsverarbeitung im erwachsenen Gehirn in Vivozu untersuchen. Diese Methode kann auch verwendet werden, zur Untersuchung der neuronalen Aktivität (z.B. mit Hilfe von Thy1 -GCaMP6s Mäusen) und kortikale Plastizität B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J von intaktem Gewebe der entsprechenden symmetrischen Regionen Erholung nach Deafferentation aufgrund einer einseitigen CNS Verletzung. Die Methode kann auch verwendet werden, kortikale Aktivität als Reaktion auf periphere Stimulation Strategien wie optogenetische, elektrische oder chemische Reize zu untersuchen. Obwohl wir nur die Technik im Bereich S1 zeigen, könnte dieser Ansatz eingesetzt werden, um die Aktivitäten in anderen symmetrischen Gebieten lebenden Gehirn wie der Schicht V Neuronen des primären motorischen Kortex (M1) untersuchen. Bemerkungen zur Reorganisation von Hirnregionen können ein neuronales Substrat für adaptive motor Verhalten liefern, die eine entscheidende Rolle bei der postinjury Wiederherstellung der Funktion spielt. Es ermöglicht auch chronischen Messung der symmetrischen Aktivität genetisch identifizierten Zellen während Verhalten bei Mäusen Kopf fixiert.
Technisch sollten Ermittler sorgfältig auf die Qualität und Konsistenz der dual kranialen Fenster achten. Ausgedünnt-Totenkopf kranialen Fenster Technik 12 empfiehlt sich für Anfänger zum üben. Stacheln sind Kalzium Fächer aufgrund ihrer Morphologie und lokale Zustrom und Extrudieren Mechanismen. In dieser Studie verwendeten wir B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J Mäusen als Beispiel dendritische Wirbelsäule Dynamik in Vivo (Abbildung 4) nachweisen. Eine offenen Schädel Glas Fenster Installation verursachen hohe Wirbelsäule Umsatz und reaktive glialer Reaktionen nach Chirurgie 12. Im Gegensatz dazu können mit verdünnt-Totenkopf Fenstertechnik, Stacheln und Dendriten gut konserviert werden.
Auswahl an Abmessungen und dicken von optischen Fenster werden das gewünschte Sichtfeld, die Krümmung der Schädel, Schädel Dicke und die Art der Bildgebung 13abhängig sein. Zu niedriger Druck des optischen Coverglasses auf die Dura verursachen Verdickung der Dura, Nachwachsen des Schädels, und Gehirn Bewegung erhöht. Im Gegensatz dazu kann übermäßiger Druck des optischen Coverglasses kortikalen Blutfluss behindern.
Für optische Fenster Montage kleben und zusätzliche Schichten von Coverglasses eine zu einem Zeitpunkt mit optischen Kleber und langwellige UV-Licht zu heilen. Zur Stärkung der Klebtechnik warm gefertigte Fenster (50 ° C für 12 h) in einem Inkubator. Optische Fenster Deckglas in Ethanol 70 % (Vol/Vol) aufbewahren und vor der Operation mit steriler Kochsalzlösung durchspülen. Das optische Fenster für Mängel (z. B. einen falschen Betrag des optischen Klebstoff oder ungenaue Ausrichtung) untersucht werden muss unter einem Stereoskop vor Gebrauch, Fehler zu vermeiden. Wenn der optische Klebstoff zu dünn ist, kann Lufträume zerknittert werden die optischen Aberrationen oder Deckglas Ablösung mit der Einnistung führen kann. Im Gegensatz dazu kann zu viel optischen Kleber Überlauf vorbei an den Rändern des kranialen Fensters zu verursachen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, beschreiben wir hier ein experimentelles Verfahren zur Messung von Kalzium Dynamik oder dendritische Morphologie durch kranialen Fenster aus 2 symmetrischen primäre somatosensorische kortikalen Regionen Thy1-GCaMP6s und Thy1- YFP transgene Mäuse, bzw. Verwendung 2P Mikroskopie. Diese Technik kann erheblich erleichtern sezieren die komplexe strukturelle und funktionelle Beziehung neuronaler Netze.

Kalzium und seine Regulierung sind unerlässlich bei der Vermittlung mehrerer physiologischer Prozesse. Überwachung von Kalzium Dynamik ist hilfreich für das Verständnis der normalen Gehirnfunktion sowie pathologische Zustände des Gehirns Störungen 1,2,3,4,5,6 ,7,8. GCaMP6s Fluoreszenz Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Quantifizierung der Spike-Nummern, timing, und Frequenz sowie Ebenen der synaptischen Eingang sowohl in Vitro und in Vivo 9,10,11.
Das Gehirn von Säugetiere weist deutliche Symmetrie in der Sagittalebene. Obwohl neuere neurologische Forschung über die kortikalen Umgestaltung Aufschluss hat und neuronaler Aktivität durch traumatische Gehirn oder Rückenmark Verletzungen 6,7, die Rollen, dass intakte Gewebe der symmetrisch ausgelöst spielen entsprechende Regionen bei der Wiederherstellung sind noch unklar.
In dieser Studie beschreiben wir experimentelle Verfahren zum Erstellen von bilaterale symmetrische optische Fenster für in-Vivo Bildgebung. Mit dieser optischen Fenster, beschreiben wir das Messen von Kalzium Dynamik von primären somatosensorischen Cortex (S1) in GCaMP6s transgene Mäuse mit 2P Mikroskopie. Im Abschnitt "Ergebnisse" zeigen wir auch in Vivo dendritischen Morphologie zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der S1-Region in den EGFP transgenen Mäusen mit 2P Bildgebung. Die Beobachtungsmethode hinsichtlich der Netzwerk-Dynamik in den bilateralen S1-Bereichen ist aber ein erstes Beispiel von wie dual kranialen Fenster Neurowissenschaftler, lokalen und symmetrische Informationsverarbeitung in das Erwachsene Gehirn von Säugetieren in normalen Sonde hilft Bedingungen oder bei anderen Krankheit in VivoModellen.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J</td><td>Jackson</td><td>24275</td><td>Es kann sich um alle Stämme handeln, die durch den genetisch kodierten neuronalen Indikator und Effektor erzeugt werden, der den grün fluoreszierenden Kalziumindikator GCaMP in Untergruppen von exzitatorischen Neuronen im Kortex exprimiert.</td></tr><tr><td>B6. Cg-TG(Thy1-EGFP)ABl.</td><td>Jackson</td><td>7919</td><td>Kann bei allen Stämmen vorkommen, die EGFP in Untergruppen von Neuronen innerhalb bestimmter Populationen im Kortex exprimieren und einen hellen, vitalen Golgi-ähnlichen Farbstoff erzeugen.</td></tr><tr><td>Dumont Nr. 5 Pinzette, Standard, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Dumont Nr. 5SF Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Micro Bead Sterilizer</td><td>Southern Labware</td><td>B1201</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Harishige' s SG-4N Kopfhalter</td> Adapter <td>Tritech Research</td><td>SG-4N</td><td>Kann jede Marke der Wahl sein.</td></tr><tr><td>Ideal Micro-Drill Komplettset</td><td>Harvard Apparat</td><td>72-6065</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Grate für Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Rundes Deckglas, 3 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0720</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Rundes Deckglas, 5 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0700</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Norland Optischer Klebstoff</td><td>Norland Products</td><td>7106</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Loctite flüssiger Sekundenkleber</td><td>WB Mason</td><td>LOC1647358</td><td>Kann jede Marke der Wahl sein.</td></tr><tr><td>Griffzement-Set, Pulver und Lösungsmittel</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>Kann jede beliebige Marke sein. Mischen Sie 5 Teile weißes Zahnzementpulver (Grip Cement) mit einem Teil schwarzer Tempera-Pulverfarbe (zum Schutz vor Licht; einige Benutzer bevorzugen ein Verhältnis von 10:1).</td></tr><tr><td>Gelschaum</td><td>Moore Medical</td><td>2928</td><td>Kann jede Marke der Wahl sein.</td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td>Kann jede beliebige Marke sein.</td></tr><tr><td>Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ASF)</td> <td>-</td><td></td> <td>Der ACSF enthält 125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 und 20 mM Glukose. Blasen Sie den ACSF mit Sauerstoff (95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid) und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Bereiten Sie vor jedem Experiment eine frische ACSF-Lösung vor.</td></tr></tbody></table>

neuronalen aktivität im primären somatosensorischen cortex mit thy1imaging-gcamp6s transgene mäuse

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Das Gehirn von Säugetiere weist deutliche Symmetrie in der Sagittalebene. Detaillierte Beschreibung der neuronalen Dynamik in symmetrischen Gehirnregionen bei erwachsenen Säuger bleibt jedoch schwer. In dieser Studie beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Messung der Kalzium-Dynamik durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P)-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Aufnahmen und Quantifizierungen der neuronalen Aktivität in bilateralen Maus Gehirnregionen eins zu einem Zeitpunkt im gleichen Experiment für einen längeren Zeitraum in Vivo. Schwerpunkte dieser Methode, die innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden können, sind minimal-invasive Chirurgie Verfahren zum Erstellen von dual optische Fenster und die Verwendung der 2P-Bildgebung. Obwohl wir nur die Technik im Bereich S1 zeigen, kann die Methode auf andere Regionen des lebenden Gehirns erleichtern die Aufklärung der strukturellen und funktionellen Komplexität des Gehirns neuronale Netze angewendet werden.

Bilateralen optischen Fenster erhalten wir Ergebnisse aus 2 separaten Experimenten. Das erste Experiment beschäftigt EGFP exprimierenden Mäuse zu Bild dendritischen Krampfadern. Abbildung 4 1-3 zeigt Beispiele für Bilder, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der optischen Fenster Implantation. Beachten Sie, dass die Anzahl und Lage der dendritischen Äste und Dornen bemerkenswert stabil zwischen den 2 Ansichten (Abbildung 4, E, Z-Projektion sind).
Das zweite Experiment beschäftigt Thy1 -GCaMP6s transgene Mäuse zur Messung der intrazellulären Kalziums vorübergehend, so illustriert wie Kalzium Physiologie innerhalb einer einzelnen Nervenzelle in Vivo (Abbildung 6) gemessen werden kann. Diese Technik kann verwendet werden, zu erfassen und zu quantifizieren, spontane Aktivität in den Bevölkerungen der Schicht V pyramidale Neuronen an so tief gelegen wie &gt; 500 µm unterhalb der Pia. Durchschnittliche spontane Reaktionen im Laufe der Zeit (berechnet als die durchschnittliche Antworten zu jedem Zeitpunkt) können in zahlreichen Studien berechnet werden. Die 2P-Technik hat den Vorteil der Erkennung Aktivitäten gleichzeitig in großen und verteilten neuronalen Populationen über einen längeren Zeitraum mit wenig mechanische Störung des Gehirns im Vergleich zu multielectrode Aufnahmen.
Um eine akzeptable durchschnittliche Messung zu generieren, sind 5 – 10 Studien empfohlen. Die Anzahl der Versuche wird der spontane Antworten oder inhärente Variabilität der Reaktionen auf eine bestimmte Stimulation abhängig sein. Wenn alle Schritte genau, wie oben beschrieben befolgt werden, ein Forscher in beiden ausgedünnt-Totenkopf Schädel Fenstertechnik ausgebildet und in Vivo 2P Kalzium Bildgebung sollte in der Lage, Aufnahmen von 100 – 200 Neuronen auf beiden Seiten von 1 – 2 Tiere pro Tag zu erhalten.
Nach der Gipfel-Analyse erhalten Sie eine Auflistung von Ergebnissen wie der tatsächliche Speicherort der Peak, die echten Amplitude, Bereich und die volle Breite am halben Maximum (FWHM) für jede Spitze.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig1.jpg"> Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Komponenten eines kranialen optischen Fensters für die 2-Photonen (2P) Bildgebung. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig2.jpg"> Abbildung 2 : Schematische Zeichnung zeigt wichtige Schritte zur Vorbereitung einer kranialen Fenster. (A) unter dem sezierenden Mikroskop, die Haut über den chirurgischen Bereich mit einer chirurgischen Schere entfernen. (B) Verwendung einer High-Speed-Microdrill eine Rundnut (3 mm Durchmesser) auf den Schädel über die S1-Bereich bis zu den Knochen zu produzieren Klappe innerhalb der Nut wird vom umgebenden Knochen gelöst. (C) entfernen Sie langsam die Knochen-Klappe, die die zugrunde liegende Dura aussetzen. (D) montieren das optische Fenster mit Coverglasses mit 2 unterschiedlichen Durchmessern. Die oberen Deckglas hat einen größeren Durchmesser (5 mm) und die untere Coverglasses (in der Regel 1-3) haben einen kleineren Durchmesser (3 mm). Die Dicke der Coverglasses installiert werden, werden abhängig von der Dicke des Schädels. (E) Ort das Deckglas auf die runde Öffnung des Schädels ein optisches Fenster erstellen. Der untere Teil der Coverglasses sollte innerhalb der kranialen Öffnung passen. Unteren Rand der Coverglasses wenden sanft die Dura. (F) Dichtung Fenster Kanten an den Schädel mit Cyanacrylat-Klebstoff. (G) wenn das Cyanacrylat trocknet, gelten schwarze dental Zement seitlich an die Wand kleben. (H) füllen die kraniale Fenster mit DdH2O und eintauchen in Wasser Ziele für die Bildgebung zu verwenden. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig3.jpg"> Abbildung 3 . Erstellung von bilateralen Windows auf den Schädel. (A) A fotografische Bild zeigt 2 kranialen optischen Fenster auf jeder Seite des Schädels darüberliegenden Bereich S1. (B) hohe Vergrößerung die boxed Region des Bildes (A) Anzeigen von bilateralen optischen Fenstern Freilegung der zugrunde liegenden Dura und Blutgefäße. Maßstabsleiste = 680 µm. (C) der exponierten Schädel. (D) Schaffung einer Rundnut, innerhalb derer eine zentrale Knochen Klappe gesehen wird. Maßstabsleiste = 900 µm. (E) nach dem Entfernen der Knochen-Klappe, die Craniale Eröffnung füllte sich mit künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS). Maßstabsleiste = 720 µm. (F) Einbau der optischen Fenster über den Schädel öffnen und die Dichtkante des Fensters mit Superkleber. Die Dura und Blutgefäße werden durch das optische Fenster sichtbar. Maßstabsleiste = 600 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig4.jpg"> Abbildung 4 : Kalzium und dendritischen Imaging. (A1) Identifizieren der Regionen von Interesse, die mit den Blutgefäßen (BV) als Orientierungspunkte: Thy1-GCaMP6s Mäuse. (A2) Identifizieren Sie die gleichen markierten Zellen (rote Pfeile) im Laufe der Zeit mit dem gleichen Sehenswürdigkeiten und Rekord. (B) Vertreter Z-Projektion von Calcium-Signale in Neuronen (rote Pfeile) des primären somatosensorischen Kortex (S1). Maßstabsleiste = 10 µm. (C1-3) Visualisierung von Dendriten (grün) und ein Blutgefäß in B6 (rot). CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J in unterschiedlichen Tiefen in der Schicht II der S1 Region 1 Tag nach dem optischen Fenster Einbau. (D) Z-Projektion von mehreren Bildern in der gleichen Region 1 Tag. (E) Z-Projektion von mehreren Bildern in der gleichen Region 7 Tage nach der Installation der optischen Fenster. Beachten Sie die bemerkenswerte Stabilität der Anzahl und Lage der Erwachsenen Stacheln und dendritische Verzweigungen zwischen 1 Tag und 7 Tage nach der Installation der optischen Fenster. Maßstabsleiste = C-E 5 µm (C-E). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig5.jpg"> Abbildung 5 : Calcium Signal Ablaufverfolgung. (A, B) Beispiele für importierte t-Serie Filme mit ImageJ zur Datenanalyse von 2 Neuronen (Neuron 1 und Neuron 2, beziehungsweise). (C) A Arbeitsblatt zeigt Daten auf Beleuchtungsstärke von Region von Interesse (ROI; innerhalb der Nervenzelle und 2 separaten nahe gelegenen Regionen als Hintergrundinformation Maßnahmen). (D) Berechnung des Berges: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (die durchschnittliche Fluoreszenz Hintergrund [FB] und die Fluoreszenz-Änderungen von Soma [F] ausgedrückt als ΔF/F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig6.jpg"> Abbildung 6 . Repräsentative Kalzium Bilder. (A-D) Kalzium-Transient (grün) und Blutgefäße (rot) zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb von Sekunden in eine Maus bei 7 Tage nach der Installation der optischen Fenster. Gelber Pfeil: ein relativ weniger aktiv Neuron. Weißer Pfeil: ein spiking Neuronen. (E, F) Z-Projektion ein 3 min Aufzeichnungszeit für rot (Blutgefäße) und grün (Kalzium) Kanäle (E) und Grün-Kanal nur (F). (G) ausgewählte Neuronen und ihre angrenzenden Hintergrundbereiche gekennzeichnet. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir beschreiben ein experimentelles Verfahren zur Messung der neuronalen Aktivität durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P) Mikroskopie in Vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Diese Methode ermöglicht die Erfassung und Quantifizierung der neuronalen Aktivität über die bilateralen kortikalen Regionen der Maus über einen längeren Zeitraum in vivo. Die beiden Photonentechnik hat den Vorteil, dass sie die Aktivität gleichzeitig in großen oder dispergierten neuronalen Populationen über einen längeren Zeitraum erkennt. Die Implikationen dieser Technik erstreckten sich auf die Untersuchung von Aktivitätsmustern in definierten neuronalen Populationen in verschiedenen Regionen des lebenden Gehirns.12 Stunden vor Beginn des Verfahrens, wärmen Sie die optischen Fenster bei 50 Grad Celsius in 70% Ethanol. Ein optisches Fenster besteht aus einem runden Deckelglas mit fünf Millimetern Durchmesser und einem unteren Teil, der ein rundes Deckglas mit drei Millimeterdurchmessern enthält. Bestätigen Sie am Ende der wärmenden Inkubation einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff auf eine anästhesierte 20 bis 25-Gramm 1 1/2 bis 2 1/2 Monate alte Thy1 GCaMP6s Maus, und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, das mit einem sterilen Vorhang bedeckt ist, und verwenden Sie einen Kopfhalter für Mäuse, um den Kopf zu stabilisieren. Rasieren Sie den größten Teil der Kopfhaut mit einem zweischneidigen Rasiermesser, und reinigen Sie die exponierte Haut mit sequenziellen sterilen AlkoholvorbereitungPads und Povidon-Jod-Lösung Peelings. Dann verwenden Sie eine Schere, um eine rechteckige zwei mal drei Millimeter in der Kopfhaut auf der rechten Seite des Schädels geschnitten zu machen.Mit einem Wattestäbchen schieben Sie die Haut zur Seite, um eine Belichtungsfläche von mehr als drei Millimetern Durchmesser zu schaffen, und verwenden Sie eine stumpfe mikrochirurgische Klinge, um das am Schädel befestigte Bindegewebe sanft zu entfernen. Mit einem Zahnbohrer einen Kreis von drei Millimetern Durchmesser um den S1-Bereich sanft markieren. Nachdem Sie einen ähnlichen Kreis auf der linken Seite des Schädels gemacht haben, wenden Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylat-Superkleber auf beide Seiten des Knochens an, um eine Basis für eine zahnärztliche Zementanwendung zu bieten.Verwenden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop einen Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer, um eine kreisförmige Nut in der rechten Seite des Schädels um den S1-Bereich zu verdünnen, um eine glatte Kante zu erzeugen, wobei die Knochenreste bei Bedarf mit einem Vakuum ansaugt werden. Nachdem eine ca. 2/3 Knochentiefe erreicht wurde, die restlichen 1/3 Knochen langsam und vorsichtig ausdünnen, bis eine kreisförmige Knochenklappe vollständig aus dem umgebenden Schädel befreit ist. Verwenden Sie ein Paar 5/45 Zangen, um langsam und vorsichtig das kreisförmige Stück Knochen zu entfernen, um die Dura zu belichten, wobei darauf zu achten ist, dass die Pialgefäße nicht beschädigt werden.Nachdem Sie eine Knochenklappe von der linken Seite des Schädels auf die gleiche Weise entfernt haben, spülen Sie das optische Fenster für die rechte Seite des Schädels mit steriler Saline ab und überprüfen Sie unter einem Stereomikroskop auf Unvollkommenheiten. Installieren Sie das optische Fenster über dem Craniotomie-Bereich mit dem oberen Teil des Fensters, der auf dem Schädel ruht, und dem unteren Teil innerhalb der craniotomisierten Öffnung, die auf der Dura ruht, in Gegenwart von zerebraler Rückenmarksflüssigkeit. Verwenden Sie den Cyanoacrylat-Superkleber, um den oberen Teil der optischen Fensterkante zum Schädel zu versiegeln.Wenn der Kleber getrocknet ist, tragen Sie schwarzen Zahnzement auf den Rand des Glases, den Rest der rechten Seite des freiliegenden Schädels und die Wundränder, um das Licht zu blockieren. Dann installieren Sie das linke optische Fenster und lassen Sie das Tier mit Überwachung bis zur vollen Rekrementigkeit erholen. Sieben bis zehn Tage nach dem Eingriff legen Sie das anästhesierte Tier in den Kopfhalter auf einem Heizkissen unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop und achten darauf, dass das optische Fenster und die rechte Seite des Schädels senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops ausgerichtet sind.Erfassen Sie ein erstes Referenzkartenbild des Schädelfensters mit Hellerfeldbeleuchtung bei der vierfachen Vergrößerung. Nach dem Erfassen mehrerer Bilder derselben Interessensregion, bilde die Kalziumdynamik innerhalb des S1-Bereichs in der linken Hemisphäre ab und kalkuliere die Veränderungen der Fluoreszenz aus jeder Region, die auf beiden Seiten des Schädels von Interesse sei. In diesen repräsentativen Bildern wurden dendriten und ein Blutgefäß innerhalb einer EGFP-exezierenden Maus einen Tag nach der Installation des optischen Fensters in verschiedenen Tiefen in Schicht zwei der S1-Region visualisiert.Die Z-Projektionsbilder wurden an den Tagen eins und sieben nach der optischen Fensterimplantation aufgenommen, was eine bemerkenswert stabile Anzahl und Lage der dendritischen Zweige und Stacheln während des Versuchszeitraums veranschaulicht. Die Messung des intrazellulären Kalziumtransienten in Thy1 GCaMP6s transgenen Mäusen ermöglicht die Quantifizierung der spontanen Kalziumaktivität und der Populationen der Schicht fünf pyramidalen Neuronen, die sich so tief wie 500 Mikrometer unter der Pia befinden, sowie die Berechnung der durchschnittlichen Anzahl spontaner Reaktionen im Laufe der Zeit. Ein Forscher, der sowohl in der Schädelfenstervorbereitung als auch in vivo in zwei photonen calcium-Imaging-Techniken geschult ist, sollte in der Lage sein, Aufnahmen von 100 bis 200 Neuronen auf beiden Seiten des Schädels bei ein bis zwei Tieren pro Tag zu erhalten.Mit einem offenen optischen Fenster auf jeder Seite des Schädels ermöglicht die Methode die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität über symmetrische Säugetierhirnregionen hinweg für eine längere und stabile Kalziumbildgebung in vivo. Diese Methode kann auch verwendet werden, um kortikale Aktivität und Plastizität nach einseitigen Verletzungen des peripheren oder des zentralen Nervensystems zu studieren. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bilaterale Schädelfenster zur Messung der Kalziumdynamik mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in transgenen Thy1 GCaMP6s-Mäusen installieren können.

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität des Gehirns durch ein optisches Fenster in transgenen Mäusen. Die Mäuse exprimieren ein fluoreszierendes Protein, das den Nachweis neuronaler Aktivitäten ermöglicht. Ein kleiner Teil des Schädels wird vorsichtig entfernt, um ein optisches Fenster zu installieren, und der Schädel wird dann mit schwarzem Zement bedeckt, um das Licht vor der Bildgebung zu blockieren.

Installation von optischen Fenstern im Gehirn transgener Mäuse zur Abbildung neuronaler Aktivitäten

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

In diesem Protokoll wird erläutert, wie Multifaserphotometrieaufzeichnungen implementiert und durchgeführt werden, wie Kalzium-unabhängige Artefakte korrigiert werden und wie wichtige Überlegungen für die duale Photometrie-Bildgebung berücksichtigt werden.

Multi-Fiber Photometrie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität bei frei beweglichen Tieren

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Primäre sensorische Areale im Neokortex zeigen während der Entwicklung einzigartige spontane Aktivitäten. In diesem Artikel wird beschrieben, wie einzelne Neuronenaktivitäten und primäre sensorische Areale visualisiert werden können, um bereichsspezifische synchrone Aktivitäten bei neugeborenen Mäusen in vivo zu analysieren.

In vivo Visualisierung der spontanen Aktivität im sensorischen Kortex von Neonatalen Mäusen mit einer Auflösung von einzelnen Neuronen

Das vorliegende Protokoll beschreibt in vivo Calcium-Bildgebung zur Messung der Reaktionen von Ensembles von lumbal-6 DRG-Neuronen auf somatische und viszerale Reize. Neuronen, die auf unterschiedliche Reize reagieren, lassen sich gründlich vergleichen. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Untersuchung von Mechanismen des viszeralen Schmerzes und der somatischen Stimulation, wie z. B. der Akupunktur.

im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung der Reaktion von Neuronen der Spinalganglien auf somatische und viszerale Reize

Diese Studie stellt eine chirurgische Manipulation vor, um das T-DRG in anästhesierten Mäusen für die in vivo Kalziumbildgebung freizulegen, zusammen mit synchronen EKG-Aufzeichnungen. Diese Methode stellt ein hochmodernes Werkzeug dar, um die periphere elektrische Nervenstimulation und die Eingänge der thorakalen viszeralen Organe sowie deren Wechselwirkungen auf der primären sensorischen Ebene zu untersuchen.

In-vivo-Calcium-Bildgebung und EKG-Aufzeichnung von thorakalen dorsalen Wurzelganglien (DRG) zur Untersuchung der peripheren Nervenstimulation

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Erfahren Sie die bilaterale Calcium-Imaging-Methode im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1-GCaMP6s-Mäusen. Diese Technik ermöglicht langzeitige In-vivo-Aufnahmen neuronaler Aktivität mit Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

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