Methodenartikel

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

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DOI:

10.3791/56301

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22. November 2017

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1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zellen und zelluläre Energie in Form von ATP zu produzieren. Mitochondriale Dysfunktion trägt zur biologische Alterung und einer Vielzahl von Erkrankungen einschließlich Stoffwechselerkrankungen, vorzeitiges Altern Syndrome und neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD). Erhaltung der mitochondrialen Gesundheit hängt von mitochondrialen Biogenese und die effiziente Abfertigung der dysfunktionalen Mitochondrien durch Mitophagy. Experimentelle Methoden genau Autophagie/Mitophagy, vor allem in Tiermodellen zu erkennen haben, entwickeln streitig gemacht. Jüngste Fortschritte in Richtung auf das Verständnis der molekularen Mechanismen des Mitophagy ermöglichte die Entwicklung von neuartigen Mitophagy Nachweistechniken. Hier stellen wir einige vielseitige Techniken zur Überwachung der Mitophagy in den menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegans (z.B.Rosella und DCT-1 / LGG-1-Stämme), und Mäuse (Mt-Otamegane). Eine Kombination dieser Mitophagy Erkennung Techniken, einschließlich Cross-Arten Bewertung, verbessert die Genauigkeit der Mitophagy Messungen und führen zu einem besseren Verständnis der Rolle der Mitophagy in Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

Mitophagy ist für mitochondriale Wartung unerlässlich. Mitochondrien kreuzen sich mehrere Zelle Signalwege und sind universelle subzellulären Organellen verantwortlich für zelluläre Energieproduktion, Zellstoffwechsel und Kalzium Homöostase1,2,3, 4. Mitochondrien erleben ständig Herausforderungen von endogenen und exogenen Quellen wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und mitochondriale Giftstoffe, bzw. die zu der Generation von "Alter" und dysfunktionale Mitochondrien führen. Ansammlung von Geschädigten Mitochondrien verringert die Effizienz der ATP Produktion bei gleichzeitiger Erhöhung der Menge an schädlichen ROS und altersbedingten Krankheiten wie Stoffwechselerkrankungen, AD, verbunden worden und PD1,5,6 . Zur Vermeidung von Mitochondrien induziert zellulären Dysfunktion bezeichnet Zellen spezifisch erkennen Mitochondrien beschädigt und effizient durch ein zellulärer Prozess zu entfernen müssten mitochondriale Autophagie (Mitophagy). Dies demonstriert Bedeutung von Mitophagy in Gesundheit und Krankheit verdeutlicht die Notwendigkeit für präzise und effiziente Methoden, um Mitophagy zu erkennen in Vitro und in Vivo.

Mitophagy erfolgt in mehreren Schritten mit vielen Proteinen und Protein-komplexe5,7,8. Kurz gesagt, eine beschädigte Mitochondrium zuerst erkannt und verschlungen durch ein Doppel-membraned Phagophore, die von der Plasmamembran, endoplasmatische Retikulum, Golgi-Komplex, Zellkern oder Mitochondrium selbst9,10stammen kann. Die sphärischen Phagophore verlängert und schließlich dichtet die Mitochondrien im Inneren bilden die mitochondriale Autophagosome (Mitophagosome). Die Mitophagosome verschmilzt dann mit den Lysosomen für Abbau, bilden eine Autolysosome, in dem die beschädigten Mitochondrium degradiert und recycelten7,8ist. Große selbstverdauende Proteine, die auch in Mitophagy enthalten: Autophagie Verwandte 7 (ATG7) und Beclin1 (Einleitung), Microtubule-Associated Protein 1A/1 b-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 in C. Munders) und p62 (Komponenten des Phagophore), und lysosomale verbundene Membran Glykoprotein 2 (LAMP2)6,7. Darüber hinaus gibt es mehrere wichtige Proteine für Mitophagy, einschließlich PTEN-induzierte vermeintliche Kinase 1 (Rosa-1), Parkin1, nukleare Dot Protein 52 kDa (NDP52), Optineurin, BCL2 Interaktion Protein 3 wie (NIX/BNIP3L) (DCT-1 in C. Elegans), eindeutig unter anderem5,6,11.

Eine gängige Methode zum Erkennen von Änderungen in Höhe der Autophagie ist durch das Verhältnis der LC3-II/LC3-I oder LC3-II/Aktin. Diese Methode ist jedoch unspezifisch, wie eine Erhöhung dieses Verhältnis entweder eine erhöhte Initiation oder eine beeinträchtigte Mischung aus Mitophagosome, Lysosomen12widerspiegeln kann. Eine weitere Methode ist die NS1 zwischen einer Autophagie Marker (z.B.LC3) und eines mitochondrialen Proteins (z.B.Translocase der äußeren mitochondrialen Membran 20 (TOMM20, die durch Proteasomen beeinträchtigt werden könnte)) zu bewerten. Allerdings können nur Änderungen im gesamten Mitophagy Ebenen anzugeben und nicht unterscheiden, den Schritt an die Verstopfung auftritt. Dies kann mithilfe von lysosomalen Inhibitoren (z. B.E64d + Pepstatin A, EP genannt) parallel dazu führen, dass die Anhäufung von Mitophagosomes geklärt werden. Der Unterschied zwischen der Anzahl der Mitophagosomes an der Basislinie und die Anzahl der Mitophagosomes nach der Behandlung mit EP kann Mitophagy angeben. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung von neuartigen Mitophagy Nachweistechniken aufgefordert. Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung der Mitophagy in einem breiten Spektrum von Erkrankungen des Menschen stellen wir mehrere robuste Mitophagy Erkennungstechniken, die für Forscher nützlich sein können. Wir decken sowohl in Vitro und in Vivo Techniken und empfehlen kombinieren mehrere Techniken, um Änderungen der Mitophagy zu überprüfen.

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Protokoll

Tiere (männlichen und weiblichen Mäusen) geboren und aufgewachsen in einer akkreditierten Tierhaus in Übereinstimmung und Genehmigung des NIH Animal Care und Verwendung. Euthanasie Methoden müssen mit allen nationalen und institutionellen Regelungen übereinstimmen.

1. Erkennung von Mitophagy in menschlichen Zellen

  1. Erkennung von Mitophagy mit Mt-Otamegane plasmid
    Hinweis: Das Otamegane Protein, verschmolzen zu einem Mitochondrien Ziel Signal, als Mt-Otamegane vereinfacht hat für in Vivo Mitophagy Erkennung bewährt. Mt-Otamegane ist ein ratiometrischen pH-Sensitive fluoreszierende Protein das grüne Fluoreszenz (Erregung 458 nm) in basic oder neutralen Bedingungen und rote Fluoreszenz (Erregung 561 nm) unter sauren Bedingungen aufweist. Gesunde Mitochondrien gedeihen in basic oder neutralen Bedingungen (pH 7-8) und sind gekennzeichnet durch grüne Fluoreszenz, wenn mit Mt-Otamegane transfiziert. Wenn Mitochondrien Mitophagy zu unterziehen und mit sauren Lysosomen verschmelzen, der pH-Wert sinkt auf 4,5 und Mitochondrien mit Mt-Otamegane weisen rote Fluoreszenz6,13,14. Wichtig ist, ist Mt-Otamegane resistent gegen lysosomale Proteasen, Bewertung der Mitophagy über einen längeren Zeitraum ermöglicht. Das Protokoll unten ist für 6-Well Platten entwickelt.
    1. Tag 1: Verwenden Sie primären humanen Zellen (z.B. Fibroblasten) oder verewigt menschliche Zellen (z.B. Hela-Zellen oder U2OS Zellen). Samen ca. 0,3-1 × 106 Zellen/gut (abhängig von der Zelle Wachstumsrate damit Zellen 70 % Konfluenz am nächsten Tag zu erreichen) in einem 6-Well-Platte. Halten die Zellen im kompletten Zellkulturmedium (Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Medium ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Lösung von Penicillin-Streptomycin gemischt), und in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C inkubieren (20 % O2, 5 % CO2 ). Fügen Sie 1 mL vollständige Zelle Kulturmedium/Brunnen in einem 6-Well-Platte.
      Hinweis: Gen Überexpression/Zuschlag oder medikamentöse Behandlungen können bei dieser Etappe6erfolgen.
    2. Tag 2: Mix Mt-Otamegane Plasmid DNA6 und DNA-Transfection Reagens (die Mischung für einen Brunnen von einem 6-Well-Platte).
      1. Verdünnen Sie 15 µL DNA Transfection Reagens mit 150 µL serumfreien Medium gemäß Protokoll des Herstellers.
      2. Verdünnen Sie 2-5 µg des Mt-Otamegane Plasmid DNA mit 150 µL serumfreien Medium.
      3. Verdünnte DNA Transfection Reagens, Wirbel für 10 verdünnten Mt-Otamegane Plasmid hinzufügen s, und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
        Hinweis: Optimierung der DNA Transfektion Bedingungen möglicherweise erforderlich, abhängig von der Plattengröße (siehe Hersteller Protokolle für Details).
      4. Fügen Sie DNA/Transfection Reagens Mischung tropfenweise Zellen hinzu, dann schütteln Sie die Platten sanft für 5-10 s, bis die Lösung vollständig vermischt ist.
    3. Tag 3: Wechseln Sie das Medium durch den Austausch von DNA-Transfection Reagens-haltigen Medium mit frischen komplette Zellkulturmedium (1 mL/Na).
    4. Tag 4: Bild mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie6Zellen. Verwenden Sie zwei bildgebende Kanäle: Grünkanal (Erregung 458 nm, Emission 570-695 nm) zu visualisieren, normale Mitochondrien und Rotkanal (Erregung 561 nm, Emission 570-695 nm), Mitochondrien zu visualisieren, die Mitophagy durchmachen. Nach dem Zufallsprinzip 20 Bildbereiche unter 40 X Vergrößerung um insgesamt 100-200 Zellen in jedem gut zu decken.
    5. Datenanalyse. Berechnen Sie die "Mitophagy-Index" (Anteil der Mitochondrien in der Mitophagy), mit Bildanalyse-Software, um die Höhe der Fluoreszenz in der roten und grünen Kanäle zu quantifizieren: nehmen Sie das Verhältnis der rote Fluoreszenz, rote + grüne Fluoreszenz, und multiplizieren mit 1006.
      Hinweis: Alternativen zur Transfektion mit Mt-Otamegane stabil ausgedrückt HeLa-Zelle Linien14enthalten. Da HeLa-Zellen nicht Parkin ausdrücken, muss stabil Parkin ausgedrückt werden, um Parkin-abhängigen Mitophagy in diese Zelllinie zu studieren.
  2. Erkennung von Mitophagy mit dem NS1 zwischen Cytochrom C Oxidase Untereinheit II (COXII) und LAMP2
    Hinweis: COXII ist ein mitochondrialen Genom kodiert innere Membran-Protein. Der Mitophagy-Index entspricht das Verhältnis der COXII colocalized mit LAMP2, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtsumme der COXII.
    1. Saatgut, HeLa-Zellen (oder andere Zellen des Interesses in Schritt 1.1.1 erwähnten) in einer 4-Well-Kammer-Folie (1 bis 5 × 104 Zellen in 1 mL vollständige Zelle Kulturmedium/Brunnen) in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C (20 % O2, 5 % CO2) über Nacht.
    2. Fügen Sie 3.0 µL 10 mM Carbonyl Cyanid - 4-(Trifluormethoxy-) Phenylhydrazone (FCCP) und inkubieren Sie in die Zelle Kultur Inkubator (Schritt 1.2.1) für 3 h.
      Hinweis: Andere Medikamente beeinflussen Mitophagy können verwendet werden.
    3. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer 1 mL-Pipette, waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL/auch von Kälte (0-4 ° C) 1 X PBS. Lassen Sie die Lösung für 10-30 s vor der nächsten Wäsche sitzen. 0,5 mL 3,7 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer in jede Vertiefung geben und inkubieren Sie für 10 min auf Eis, um die Zellen zu beheben.
      Achtung: PFA ist Toxin. Arbeiten Sie in einem Abzug bei der PFA Verwendung.
    4. Entsorgen Sie die PFA-Lösung mit einer 1 mL-Pipette, waschen Sie die Zellen zweimal mit Kälte 1 X PBS (1 mL/Well; lassen Sie Lösung sitzen für 10 s vor der nächsten Wäsche), und permeabilize der Zellen mit 1 mL/auch von 0,25 % Waschmittel (mit 1 X PBS-Puffer) für 10 min auf Eis.
    5. Entsorgen Sie die permeabilizing Puffer, vorsichtig Waschen der Zellen zweimal mit kalten 1 x PBS und entsorgen (lassen Sie die Lösung für 10 sitzen s zwischen den Waschgängen). Blockieren Sie die Zellen mit 1 mL/auch von 5 % FBS mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° c über Nacht Decken Sie die Kammern um Feuchtigkeitsverlust zu verhindern.
    6. Vorbereiten von 0,5 mL/Brunnen von einer gemischten Antikörperlösung mit COXII Antikörper (Maus, Verdünnung 1: 250) und LAMP2-Antikörper (Kaninchen, 01:20-01:50 Verdünnung) mit 1 X PBS-Puffer mit 5 % FBS und Shop auf Eis für 0,5-1 h.
    7. Der 4-Well-Kammer-Folie aus den kalten Raum herausnehmen Sie und entsorgen Sie die blockierende Lösung mit einer 1-mL-Pipette. Vorsichtig waschen die Zellen zweimal mit 1 mL/auch von kalten 1 x PBS und entsorgen (lassen Sie die Lösung für 10 sitzen s zwischen den Waschgängen), dann fügen Sie 0,5 mL/sowie der gemischten Antikörperlösung. Inkubation bei 37 ° C für 1 h auf einem Boston-Shaker mit niedriger Geschwindigkeit.
    8. Der erste Antikörperlösung mit einer 1 mL-Pipette zu verwerfen und sanft die Zellen dreimal mit 1 mL/auch von kalten 1 X PBS waschen und entsorgen. Lassen Sie die Lösung für 10 sitzt s vor der nächsten Wäsche. Fügen Sie 1 mL/Brunnen des fluoreszierenden Sekundärantikörper (z.B. Ziege Anti-Kaninchen mit Wellenlänge 568 nm rot fluoreszierenden Proteins (RFP) für LAMP2; und Ziege-Anti-Maus mit Wellenlänge 488 nm grün fluoreszierendes Protein (GFP) für COXII) in 1: 250 Verdünnung mit 5 % FBS mit 1 X PBS-Puffer. Die 4-Well-Kammer-Folie mit Alufolie abdecken und Inkubation bei 37 ° C für 1 h auf einem Boston-Shaker mit niedriger Geschwindigkeit.
    9. Entsorgen Sie die zweite Antikörperlösung mit einer 1-mL-Pipette. Waschen Sie vorsichtig die Zellen sechsmal mit 1 mL/auch von kalten 1 X PBS. Lassen Sie die Lösung für 1 min vor der nächsten Wäsche sitzen.
    10. Montieren Sie die Zellen mit 50 µL/Well antifade Eindeckmedium mit DAPI und fügen Sie Deckel rutscht hinzu.
    11. Bild der Zellen unter einem confocal Mikroskop mit 66 x Vergrößerung und Immersion Öl (Fliese scannt / Mosaiken können verwendet werden, um die Zahl der Zellen, die durch die Software abgebildet). Verwenden Sie dieselben Einstellungen wie Kanal Belichtungszeit, digitale Verstärkung, digital Offset, etc. in allen bildgebenden Verfahren (siehe Software Anleitung für Details)15.
    12. Verwendung NS1 Analysesoftware, quantitativ zu analysieren, mindestens 20 zufällige Bilder von 100 Zellen15. Die Funktion "Bezier geschlossen" gesamte einzelne Zellen auswählen. Vergleichen Sie die Pearson NS1 Koeffizient der GLP, RFP, gewichtet oder ungewichtet, Mitophagy Ebenen in den analysierten Zellen bestimmen. Pflegen Sie Werte für die horizontale und vertikale Fadenkreuz der NS1-Analyse-Software in der gesamten Analyse. Um genau diese Fadenkreuz eingestellt, bereiten Sie zwei zusätzliche Gruppen von Zellen vor und beschriften Sie eine COXII und die anderen LAMP2. Legen Sie anschließend Fadenkreuz direkt über die Pixelverteilung für jeden Kanal15 (siehe Software Anleitung für Details).
  3. Ein hoher Durchsatz imaging-Messung für Mitophagy-screening
    Hinweis: Die Durchführung von Hochdurchsatz-Bildschirme von Mitophagy Induktion oder Hemmung der Mitophagy Verbindungen aus großen zusammengesetzten Bibliotheken ist technisch anspruchsvoll. Ein bildgebendes Verfahren, basierend auf dem NS1 der Mitochondrien mit Autophagosom ist ein einfacher, aber sehr empfindlich Alternative für Mitophagy screening-16.
    1. Tag 1: Samen Zellen (z.B. menschliche primäre Fibroblasten an 5.000 Zellen/100 mL Zelle Nährmedien/Brunnen) in eine 96-Well-Platte (siehe Schritt 1.1.1).
    2. Tag 2: Behandlung der Zellen ab dem zweiten Tag mit FCCP oder andere Verbindungen des Interesses für die angegebenen Inkubationszeit (siehe Punkt 1.2.2).
    3. Befolgen Sie Schritte 1.2.2-1.2.9 mit dem primären Antikörper für COXII (Maus, 1: 250 Verdünnung mit 5 % FBS mit 1 X PBS-Puffer) und LC3B (Kaninchen, 1: 100-Verdünnung 1: 200 mit 5 % FBS mit 1 X PBS-Puffer). Alternativ können primäre Antikörper für COXII und LAMP2 verwendet werden.
    4. Bild mit einem fluoreszierenden Leser16Zellen. Sammeln Sie Bilder in zufällig platzierte Felder und mit einem minimalen 500 Zellen/gut.
    5. Analysieren Sie Daten mithilfe einer Zelle Analyzer angepasst Protokoll16.

2. Nachweis von Mitophagy in C. elegans

Hinweis: Der Fadenwurm C. Elegans bietet eine Plattform für Mitophagy organismal Ebene bestimmen. Zwei Stämme können verwendet werden, um Mitophagy zu überwachen: (1) Mitochondrien-gezielte Rosella (MtRosella) oder Mitophagy (2) Rezeptor DCT-1 verschmolzen mit GFP zusammen mit Autophagosomal Marker LGG-1 mit Discosoma SP. rot fluoreszierenden Proteins (DsRed)5, verschmolzen 17.

  1. Mitophagy Überwachung mit Rosella biosensor
    Hinweis: Rosella ist eine molekulare Biosensor, der einen pH-unempfindliche DsRed verschmolzen zu einer pH-Sensitive-GFP-Variante kombiniert. Der Rosella Biosensor nutzt die pH-Wert-Unterschiede zwischen der sauren Lysosomen (pH ~ 4,5) und anderen zellulären Kompartimenten. Diese Biosensor wurde zur Mitophagy in Saccharomyces Cerevisiae und einige Säugetier-Zelle Linien, wie z. B. HeLa, HEK293 und HCT11618,19erfolgreich zu überwachen. Wir dieser vielseitige Dual-fluoreszierende Reporter angepasst und generiert transgenen C. Elegans Nematoden Mitochondrien gezielt Rosella (MtRosella) in den Muskelzellen Körperwand zum Ausdruck zu bringen. Mitophagy Induktion wird durch eine reduzierte GLP/DsRed-Verhältnis von MtRosella Fluoreszenz.
    1. Tag 1: Wählen Sie L4-Larven der Würmer, die Mitochondrien gezielt Rosella (MtRosella) in den Muskelzellen der Körperwand auf einen Fadenwurm Wachstum Medien (NGM) Teller ausgesät mit E. Coli (OP50) mit einer Dissektion Mikroskop5zum Ausdruck zu bringen. Mindestens drei 3,5 cm Platten 10-20 Würmer/Platte auflegen. Inkubieren Sie die Nematoden in der standard Temperatur von 20 ° C5.
      Hinweis: Finden Sie unter Referenz für die Wurm-Anatomie, einschließlich Ermittlung der L4-Larven-20und der Weg, um eine Wahl zu machen, die verwendet wird, um die Würmer von einem Ort an einen anderen21übertragen.
    2. 5.Tag: Nematoden durch Auswahl von 15-20 L4 transgenen Larven synchronisieren und übertragen sie auf frisch OP50 ausgesät NGM Platte. Verwenden Sie mindestens fünf Platten pro Versuchsbedingung.
    3. 7. Tag: Bereiten Sie Fahrzeug Platten Mitophagy beeinflussen Drogen oder Positivkontrollen vor.
      1. E. Coli (OP50) Bakterien durch die Aufdeckung NGM Platten für 15 min mit 222 µW/cm2 (Intensität) von UV-Licht zu gewährleisten, dass Mitophagy-induzierende Verbindungen nicht bakteriell metabolisiert werden ausgesät zu töten. Platten müssen mit 2.000 J/m2ausgesetzt werden.
        Hinweis: Sekunden der Exposition erforderlich = 2.000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Fügen Sie widerrufen von Interesse an die Spitze der gesäten NGM-Platten. Fügen Sie eine entsprechende Menge an zusammengesetzten Fahrzeug (Lösungsmittel verwendet, um die Verbindung, wie Dimethyl Sulfoxid (DMSO) auflösen) an den Fahrzeug-Platten als Negativkontrolle. Für positive Kontrolle der Mitophagy Induktion, eine mitochondriale Schlüpfzeit wurde Paraquat (8 mM Endkonzentration) verwendet. Fügen Sie eine Lösung mit 10 µL 8 M Paraquat Lager mit 190 µL DdH2O auf der Oberseite der Agarplatte für die Behandlungsgruppe. Fügen Sie für die Fahrzeuggruppe eine Lösung mit 10 µL von DMSO mit 190 µL DdH2O auf der Oberseite der Agarplatte.
        Hinweis: Die Paraquat-Arbeitslösung kann 1 Monat bei 4 ° c aufbewahrt werden
      3. Sanft die Platten schwenken, bis das Medikament oder Fahrzeug überzieht die gesamte Fläche. Lassen Sie die Platten mit dem Deckel geschlossen bei Zimmertemperatur mindestens 1 h vor der Übertragung der Würmer trocknen.
        Hinweis: Droge Platten können auch vorbereitet werden, durch Hinzufügen von Drogen in der flüssigen NGM, bevor es erstarrt.
    4. 7. Tag: Transfer 10-20 2-Tag-alte Erwachsene transgener Tiere in Schritt 2.1.2 auf Platten mit entweder Paraquat, widerrufen, oder Fahrzeug (DMSO) vorbereitet. 2 Tage inkubieren Sie die transgenen Tiere bei 20 ° C.
    5. 9. Tag: Bereiten Sie 2 % Agarose-Pads (siehe Ergänzendes Material). Dann fügen Sie einen Tropfen (10 µL) von 20 mM Levamisol in M9 Schreibblock. Die transgenen Tiere für die Bildgebung, indem man sie in der Drop-M9-Levamisole zu immobilisieren. Legen Sie ein Deckglas vorsichtig auf der Oberseite.
    6. Erfassen Sie einzelne transgene Tiere verwenden eine Kamera an einem Epifluoreszenz Mikroskop angeschlossen. Erwerben Sie fluoreszierende Bilder des gesamten transgener Nematoden, die mit dem Ausdruck MtRosella in den Muskelzellen der Körperwand bei 10 X Vergrößerung5. Die gesammelten Bilder zu speichern.
    7. Die erworbenen Bilder mit ImageJ-Software verarbeitet. Analysieren Sie die Körperwand Muskelzellen befindet sich in den Kopf des Wurms Autofluoreszenz in das Darmgewebe zu vermeiden. Durchschnittliche Pixel Intensität Wert insgesamt Bereich und für jedes fluoreszierende Bild nur der Kopfbereich eines jeden Tieres zu messen. Analysieren Sie die spezifischen Interessengebiet:
      1. Wählen Sie unter "Bild" und "Farbe" Drop-Down-Menü Bilder konvertieren "split Kanal".
      2. Nutzen Sie das Tool "Freihandauswahl" um die fluoreszierenden Interessengebiet zu erfassen.
      3. Wählen Sie den Befehl "Messung" unter "analysieren" Drop-Down-Menü und eine Pixel Intensität durchzuführen.
      4. Pixel Intensität sollte normalisiert werden, indem man Intensität durch die Gesamtfläche analysiert. Berechnen Sie bei der Normalisierung die GFP DsRed Verhältnis22.
    8. Verwenden Sie statistische Analyse Software entweder führen Student t-Test (Vergleich zwischen beiden Gruppen) oder ANOVA (Vergleich zwischen mehreren Gruppen) für die statistische Analyse mit p < 0,05 als bedeutende5,17 .
  2. Mitophagy mit Co Lokalisierung zwischen DCT-1 und LGG-1 Bewertung
    Hinweis: DCT-1 ist ein äußeren Mitochondrien-Membran-Protein, die als Mitophagy Rezeptor in Reaktion auf stress Bedingungen, ähnlich wie seine vermeintliche Orthologe BNIP3 und NIX/BNIP3L in Säugetieren5wirkt. So wird Mitophagy Einleitung von Co Lokalisierung zwischen DCT-1 Mitophagy-Rezeptor und Autophagosomal Membranprotein LGG-1 (Homolog von Säugetieren LC3) bewertet.
    1. Tag 1: Pick L4-Larven von transgenen Tieren, die mit dem Ausdruck DCT-1::GFP und DsRed::LGG-1 in Körperwand Muskel Zellen5 auf eine OP50 ausgesät NGM Platte. Legen Sie ca. 5-10 Würmer/3.5 cm Platte, und verwenden Sie mindestens drei Platten zu. Die Nematoden bei 20 ° c inkubieren
      Hinweis: Transgene auf separaten Plasmide befinden und sie werden nicht in das Genom integriert. Nematoden, tragen rol-6(su1006) und p-Myo-2 GFP Contransformation Marker abholen. Nur express transgenen Würmer mit beide Contransformation Marker DCT-1::GFP und DsRed::LGG-1 im Körper-Wand Muskelzellen.
    2. Folgen Sie den Schritten von 2.1.2-2.1.5.
    3. Bild einzelne Körperwand Muskelzellen mit eine Kamera an einem confocal Mikroskop5,23angeschlossen. Die Grenzen des gesamten Körperwand Muskelzellen zu erkennen und nehmen Sie Z-Stapel Bilder unter 63 X Vergrößerung. Höherer Vergrößerung kann auch verwendet werden.
    4. Öffnen und Bearbeiten von Bildern mit der konfokalen Software erworben. Einleitung des Mitophagy wird durch Co Lokalisierung des Mitophagy-Rezeptors (DCT-1::GFP) die Autophagosomal-Marker (DsRed::LGG-1). Manuell messen Sie Co Lokalisierung Ereignisse in jedem Stapel der Körperwand Muskel Zelle5. Es ist wichtig, alle Einstellungen von Mikroskop und Kamera (Objektiv und Lupe, Filter, Belichtungszeit, Auflösung, Laserintensität, Gewinn, etc.) Experimente konstant zu halten. Alle Einstellungen sollten beachtet werden.
    5. Verwenden Sie statistische Analyse Software entweder führen Student t-Test (Vergleich zwischen beiden Gruppen) oder ANOVA (Vergleich zwischen mehreren Gruppen) für die statistische Analyse mit p < 0,05 als bedeutende5,17 . Für zwei-Wege-Vergleiche der Student t verwenden-test (p < 0,05 gilt als bedeutende). Verwenden Sie für Mehrfachvergleiche Einzelfaktor (ANOVA)-Varianz-Analyse, durch die post-Hoc Bonferroni Test korrigiert. Es wird empfohlen, mindestens 50-70 Tiere oder 30-50 Körperwand Muskelzellen für jede experimentelle Bedingung zu analysieren. Wiederhole das Experiment mindestens dreimal.

3. Nachweis von Mitophagy bei Mäusen

Hinweis: Bisherige Methoden zur Erkennung von Mitophagy bei Mäusen waren schwerfällig, unempfindlich und schwer zu quantifizieren. Transgenen Mausmodell mitochondriale ausgerichtete Form der fluoreszierenden Reporter Otamegane ausdrücken kann (Mt-Otamegane) jetzt genutzt werden, um Niveaus des Mitophagy in einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen festzusetzen.

  1. Einschläfern Sie Mäuse mit einem Protokoll genehmigt durch das institutionelle Animal Care und Use Committee14.
  2. Sichern Sie die Maus (ventrale Seite nach oben) auf die Arbeitsbühne mit Stiften in den Gliedern. Machen Sie einen Schnitt in den Unterleib mit Mikrochirurgie Schere und Pinzette, um die Leber24verfügbar zu machen. Schneiden Sie ein Stück der Leber (z.B. ein Stück des rechten Lappen 1 × 1 × 1 cm) mit Mikrochirurgie Schere und Zange.
    Hinweis: Nachweis von Mitophagy bei Mäusen ist kompliziert und erfordert Kenntnisse über Maus Anatomie und Umgang mit sehr geschickten Maus und Maus Chirurgie. Dieses Protokoll enthält grundlegende, wichtige Schritte auf diese Methode, und eine genauere Methode ist24.
  3. Legen Sie die Leber Probe auf einer Metallplatte auf dem Eis das Gewebe rasch abkühlen lassen. Halten Sie das Gewebe auf der kalten Metallplatte und bearbeiten Sie so schnell wie möglich. Optimal, innerhalb 1 h nach Dissektion zu nutzen.
  4. Heben Sie die Leber Probe mit gebogenen Pinzette und spülen Sie mit 5 mL eiskaltes 1 X PBS.
  5. Übertragen Sie die Leber auf einer Petrischale (Ø 100 mm) auf Eis mit einem Spatel Löffel Ende.
  6. Die Leber Probe von hand geschnitten Sie in 0,5-1 mm dicke Schichten mit Single-Rand klingen.
  7. Übertragen Sie die Gewebeschnitte auf einer Glasschale unten mit Mikrochirurgie Pinzette sorgfältig.
  8. Legen Sie vorsichtig die Leber Abschnitt mit Zangen, flach auf dem Boden.
  9. Die in Scheiben geschnittene Leber mit 3-5 Tropfen kalten 1 X PBS zu decken.
    Hinweis: DAPI-Färbung wird empfohlen, die Region des Interesses an bestimmten Geweben (z.B. Gehirn)24identifizieren. Um Co Lokalisierung des roten Mt-Otamegane Signals mit den Lysosomen zu validieren, können lysosomale Farbstoffe wie Dextran Kaskade blau und Lysosensor, gebrauchte24sein.
  10. Die Gewebeschnitte unter konfokalen Mikroskopie über zwei sequentielle Erregungen24Bild. Stellen zwei bildgebende Kanäle: "grüne" Mt-Otamegane Kanal (Erregung 458 nm, Emission 570-695-nm-Bereich) und "rot" Mt-Otamegane (Erregung 561 nm, Emission 570-695-nm-Bereich). Pflegen Sie bildgebende Einstellungen zwischen experimentellen Bedingungen. Analysieren Sie für eine effizientere Bildgebung zwei Tiere gleichzeitig.

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Ergebnisse

Erkennung von Mitophagy in menschlichen Zellen:

Bei der hier vorgestellten Verfahren wurden menschliche HeLa-Zellen mit Mt-Otamegane Plasmid transfiziert. Gesunde Zellen zeigten ein gut organisiertes mitochondriale Netz (GFP, 488 nm) mit wenigen Fälle von Mitophagy (RFP, 561 nm). Allerdings Zellen vorbehandelt mit einer mitochondrialen Entkuppler FCCP (30 µM für 3 h) eine tiefgreifende Steigerung im Mitophagy auftreten (

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Diskussion

Genaue Messung des Mitophagy ist technisch anspruchsvoll. Hier haben wir mehrere robuste Techniken vorgestellt, die sowohl qualitativen Nachweis von Mitophagy und Quantifizierung der Mitophagy Ebenen in alle gängigen Labor experimentelle Modelle ermöglichen.

Um reproduzierbare Daten zu erhalten, ist ein experimentelles Design mit mindestens drei biologische Wiederholungen notwendig. Alle Forscher in Experimenten und Analyse beteiligt müssen experimentelle Gruppe Identitäten Blenden zu lassen. ...

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Offenlegungen

Die Bohr-Labor hat CRADA Vereinbarungen mit ChromaDex und GlaxoSmithKline.

Danksagungen

Wir danken Dr. Atsushi Miyawaki und Dr. Richard J. Youle für den Austausch der Mt-Otamegane Plasmid und Mt-Otamegane integriert Hela-Zellen. Raghavendra A. Shamanna und Dr. Deborah L. Croteau danken wir für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Forschung durch den intramuralen Forschungsprogramm des NIH (VAB) unterstützt wurde, Nationales Institut auf Altern sowie ein 2014-2015 und 2016-2017 NIA Intra-Labor (EFF, VAB) gewähren. EFF wurde unterstützt durch das SOR-OST RHF (Projekt Nr.: 2017056) und Research Council of Norway (Projekt-Nr.: 262175).

AUTOR BEITRÄGE:

EFF gestaltet das Manuskript und den Entwurf; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH und ED schrieb verschiedene Abschnitte des Papiers; NT, JP, HN und VAB überarbeitet das Manuskript und Know-how zur Verfügung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
mt-Keima MausJackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA-TransfektionsreagenzThermofisher#11668027
Opti-MEM Medium (Gibco)Thermofisher#31985062serumfreies Medium
mtKemia Plasmid: pCHAC-mt-mKeimaAddgen#72342
COXII Antikörper (Maus)abcam#ab110258
LAMP2 Antikörper (Kaninchen)NOVUS
Ziegen-Anti-Kaninchen mit einer Wellenlänge von 568 nm von rot fluoreszierendem Protein (RFP)Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568 Farbstoff
von Ziege Anti-Maus mit einer Wellenlänge von 488 nm von grün fluoreszierendem Protein (GFP)Thermofisher#Z25002Alexa Fluor 488 Farbstoff
verlängert Gold Antifading mit DAPIInvitrogen#P36931
6-Well-PlatteSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
4-Well-Kammer-ObjektträgerTHermofisher, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F 96-Well-PlatteThermofisher#152038
LC3B Antikörper KaninchenNOVUS#NB100-2220
DNA-AntikörperProgen Biotechnik#anti-DNA Maus monoklonal, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306Antifading-Eindeckmedium mit DAPI
IN Zellanalysator (Fluoreszenz-ReaderGE Healthcare Life Sciences#IN Cell Analyzer 2200
Eclipse TE-2000e KonfokalmikroskopNikon#TE-2000e
ColokalisierungssoftwareVolocity#Volocity alternativZeiss ZEN 2012 Software
IN Cell Investigator SoftwareGE Healthcare Life Sciences#28408974
ZellkulturmediumThermofisher#DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermofisher#15140122
Fötales RinderserumSigma-Aldrich#12003C-1000ML
Zellkultur-InkubatorThermofisher#Thermo Forma 3110 CO2 Inkubator
EpifluoreszenzmikroskopZeissZeiss Axio Imager Z2
KameraOlympusOlympus DP71
KonfokalmikroskopZeissZeiss Axio Observer Z1
KonfokalsoftwareZeissZEN 2012
BildanalysesoftwareImage JKolokalisierungsanalyse uswhttps://imagej.nih.gov/ij/
statistische AnalysesoftwareGraphPad Software Inc., San Diego, USAGraphPad Prism Softwarepaketmaterial
zur Herstellung eines WurmpickersSurepure Chemetals#4655Das Plektrum besteht aus 30 Gauge 90% Platin 10% Iridiumdraht
IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]Materialanfrage an Tavernarakis NektariosHalten Sie transgene Tiere bei 20 & Grad; C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]Materialanfrage an Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::RosellaMaterialanfrage an Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFPMaterialanfrage an Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed:: LGG-1Materialanfrage zu Tavernarakis Nektarios
Paraquat Lösungsiehe ergänzende Daten zur Präparation
M9-Puffersiehe ergänzende Daten zur Präparation
M9-Lekamisol-Puffersiehe ergänzende Daten zur Präparation
Glasmikroskop-Objektträger und DeckgläserFisher Scientific#B9992000
Chirurgische ZangeSTERIS Animal Health19-teiliges Canine Spay Pack Economy
Chirurgische SchereSTERIS Animal Health19-teiliges Canine Spay Pack Economy
1x PBSThermofisher#AM962510x PBS muss mit dem ddH2O-Shaker auf 1x PBS verdünnt
werden Fisher Scientific#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP Tisch-Orbital-Schüttler für kleine Open-Air-Plattformen Paket Ein
2 % Agarose-Padsiehe ergänzende Daten zur Vorbereitung
Vibroslice-KlingenWorld precision instruments#BLADES-2einschneidige Klinge
MetallplatteMSC#788039880,012 Zoll dick x 6 Zoll breit x 12 Zoll lang, 430 Edelstahlblech
Triton X-100Detergens
Methylviologen DichloridhydratSigma-Aldrich#856177Paraquat
Inkubator für NematodenAQUALYTICInkubator zur Aufrechterhaltung von 20 & deg; C
Präparier-StereomikroskopOlympusSMZ645
KonfokalmikroskopZeissAxioObserver Z1Für Nematoden (Schritt 2)
EpifluoreszenzmikroskopZeissAxioImager Z2Für Nematoden (Schritt 2)
UV-VernetzerVilber LourmatBIO-LINK – BLX-E365UV-Lichtquelle; 356 nm
#CD107b ) mit Wassermantel.

Referenzen

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