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Methodenartikel

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

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DOI:

10.3791/56302

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4. Oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Biochemische und strukturelle Analysen des glykosylierten Proteinen erfordern relativ große Mengen an homogenen Proben. Hier präsentieren wir Ihnen eine effiziente chemische Methode für standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen durch gezielte reaktive Cys Thiole von Bakterien gereinigt.

Zusammenfassung

Stromale Interaktion Molekül-1 (STIM1) ist eine Art-ich transmembranen Protein im endoplasmatischen Retikulum (ER) und die Plasmamembranen (PM) gelegen. ER-Resident STIM1 reguliert die Aktivität der PM Orai1 Kanäle in einem Prozeß bekannt als betriebenen Kalzium (Ca2 +) Eintrag zu speichern, die die wichtigsten Ca2 + Signalisierung erfolgt, die die Immunantwort antreibt. STIM1 erfährt post-translationalen N- Glykosylierung an zwei luminalen Asn-Standorten innerhalb der Ca2 + Fernerkundung Domäne des Moleküls. Aber die biochemische, biophysikalische, und Struktur biologischen Wirkungen von N- glykosylierten STIM1 waren schlecht verstanden, bis vor kurzem aufgrund einer Unfähigkeit, ohne weiteres hohes Maß an homogenen N- glykosyliertes Protein zu erhalten. Hier beschreiben wir die Umsetzung eines in-vitro- chemische Ansatzes, das Glukose Moieties spezifisches Protein Websites anwendbar zum Verständnis der zugrunde liegenden Auswirkungen der N- Glykosylierung auf Protein-Struktur und Mechanismus beimisst. Mit magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie Lösung bewerten wir sowohl Effizienz der Änderung sowie die strukturellen Konsequenzen der Glukose-Anlage mit einer einzigen Probe. Dieser Ansatz kann leicht angepasst werden, um die unzähligen glycosylierten Proteine in der Natur zu studieren.

Einleitung

Speichern betriebenen Kalzium (Ca2 +) Eintrag (SOCE) ist der große Weg durch die Immunzellen Ca2 + aus dem extrazellulären Raum in das Zytosol nehmen. In T-Lymphozyten binden T-Zell-Rezeptoren auf der Plasmamembran (PM) Antigene die Protein-Tyrosin-Kinasen (rezensiert in 1,2,3) aktivieren. Eine Phosphorylierung Kaskade führt zur Aktivierung der Phospholipase-γ (PLCγ), die anschließend die Hydrolyse von Membran Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate (PIP2) in Diacylglycerol und Inositol-1,4,5-Trisphosphate (IP-3 vermittelt ). IP-3 ist ein kleines diffusiblem Bote die IP3 an Rezeptoren (IP-3R) auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER bindet) damit dieser Rezeptor-Kanal öffnen und schönem Ca2 + nach unten das Konzentrationsgefälle aus der Notaufnahme fortgesetzt Lumen zu dem Zytosol (rezensiert in 4). Rezeptor Signalisierung von G-Protein gekoppelt und Tyrosin-Kinase-Rezeptoren in einer Vielzahl von anderen erregbaren und nicht erregbaren Zelle Arten führen die gleiche Produktion von IP-3 und Aktivierung von IP3Rs.

Aufgrund der endlichen Ca2 + Speicherkapazität von der Notaufnahme, die IP-3-vermittelte Freisetzung und daraus resultierende Erhöhung der cytosolischen Ca2 + ist nur vorübergehend; diese Erschöpfung des ER luminalen Ca2 + Effekte jedoch zutiefst Stromazellen Interaktion Molekül-1 (STIM1), eine Art-ich transmembranen (TM) Protein meist zu finden, auf die ER Membran 5,6,7. STIM1 enthält eine Lumen-orientierte Ca2 + Fernerkundung Domäne bestehend aus ein paar EF-Hand und sterile α-Motiv (EFSAM). Drei cytosolische orientierten coiled-Coil-Domänen sind von EFSAM durch die TM-Einzeldomäne (rezensiert in 8) getrennt. Auf ER luminalen Ca2 + Erschöpfung erfährt EFSAM eine Destabilisierung gekoppelt Oligomerisierung 7,9 wodurch strukturelle Umstellungen der TM und coiled-Coil-Domänen 10. Diese strukturellen Veränderungen münden in ein Überfüllen des STIM1 bei ER-PM Kreuzungen 11,12,13,14 durch Interaktionen mit PM Phosphoinositides 15, 16 und Orai1 Untereinheiten 17,18. Orai1 Proteine sind die PM-Untereinheiten die Form Ca2 + Kanäle 19,20,21,22montieren. Die STIM1-Orai1-Interaktionen an ER-PM Kreuzungen erleichtern eine offene Ca2 + Freigabe aktiviert Ca2 + (CRAC) Kanal Konformation ermöglicht die Bewegung von Ca2 + in der Zellflüssigkeit aus den hohen Konzentrationen von der Extrazellulärraum. In Immunzellen, die nachhaltige cytosolischen Ca2 + Höhen CRAC Dienstweg induzieren die Ca2 +- Calmodulin/Calcineurin abhängigen Dephosphorylation des nuklearen Faktors der aktivierten T-Zellen die Folge den Kern tritt und transkriptionelle Regulierung der Gene, die Förderung der T-Zell-Aktivierung 1,3beginnt. Der Prozess der CRAC Kanal Aktivierung durch STIM1 23,24 über Agonist-induzierte ER luminalen Ca2 + Erschöpfung und die daraus resultierende nachhaltige cytosolischen Ca2 + Höhe wird Kollektiv SOCE 25bezeichnet. Die entscheidende Rolle der SOCE in T-Zellen ist offensichtlich durch Studien, die zeigen, dass vererbbare Mutationen in STIM1 und Orai1 dazu führen, Severe Combined Immunodeficiency Syndrome 3,19,26, dass können 27. EFSAM initiiert SOCE nach sensing ER luminalen Ca2 + Erschöpfung über den Verlust von Ca2 + Koordinierung auf die kanonische EF-Hand, letztlich zu der Destabilisierung gekoppelt Selbstassoziation 7, 28,29.

Glykosylierung ist die kovalente Bindung und Verarbeitung von Oligosaccharid Strukturen, auch bekannt als Glykane, durch verschiedene biosynthetischen Schritte in der ER und Golgi (rezensiert in 30,32,33). Es gibt zwei vorherrschende Arten der Glykosylierung in Eukaryoten: N-verknüpften und O-verbunden, abhängig von der spezifischen Aminosäure und Atom überbrücken die Verknüpfung. In N- Glykosylierung Glykane Seite Kette Amid von Asn befestigt sind und in den meisten Fällen die Einleitung Schritt erfolgt in der Notaufnahme als das Polypeptid Kette bewegt sich in das Lumen- 34. Der erste Schritt der N- Glykosylierung ist die Übertragung einer vierzehn-Zucker Kern-Struktur, bestehend aus Glukose (Glc), Mannose (Mann) und N- Acetylglucosamin (GlcNAc) (d. h. Glc3Man9GlcNAc-2) aus einem ER Membran-Lipid durch eine Oligosaccharyltransferase 35,36. Weitere Schritte, wie Dekolleté oder Übertragung von Glukose Rückstände sind in der Notaufnahme von spezifischen Glycosidases und Glycosyltransferases katalysiert. Einige Proteine, die ER verlassen und bewegen in die Golgi können weiter verarbeiteten 37sein. O- Glykosylierung bezieht sich auf die Zugabe von Glykoproteinen, in der Regel auf der Seite Kette Hydroxylgruppe des Ser oder Thr Rückstände, und diese Änderung tritt ganz in die Golgi-Komplex 33,34. Gibt es mehrere O- Glykan-Strukturen, die von N- Acetylglucosamin, Fucose, Galaktose gebildet werden können, und Sialinsäure Säure mit jeder Monosaccharid hinzugefügt sequenziell 33.

Während keine bestimmte Reihenfolge als Voraussetzung für viele Arten von O- Glykosylierung identifiziert wurde eine gemeinsame Konsensussequenz Nzugeordnet wurde-Änderung verbunden: Asn-X-Ser/Thr/Cys, wo X kann jede Aminosäure sein mit Ausnahme von Pro- 33. STIM1 EFSAM enthält zwei dieser Konsens N- Glykosylierung Seiten: Asn131-Trp132-Thr133 und Asn171-Thr172-Thr173. In der Tat haben frühere Studien gezeigt, dass EFSAM N- glykosylierten in Säugerzellen bei Asn131 und Asn171 38,39,40,41sein kann. Jedoch frühere Studien der Folgen der N- Glykosylierung auf SOCE inkongruent gewesen, unterdrückt was darauf hindeutet, potenzierte oder keinen Einfluss durch diese Post-translationale Modifikation am SOCE Aktivierung 38,= "Xref" > 39,40,41. Forschung über die zugrunde liegenden biophysikalischen, biochemischen und strukturelle Folgen der EFSAM N- Glykosylierung unbedingt so verstehen die rechtlichen Auswirkungen dieser Änderung. Aufgrund der Voraussetzung für hohe homogene Proteine in diesen in-vitro- Experimenten wurde eine Website selektiv kovalent Glukose Moieties EFSAM beimessen angewendet. Interessant ist, verursacht Asn131 und Asn171 Glycosylation Strukturveränderungen, die innerhalb des EFSAM Kerns konvergieren und verbessern die biophysikalischen Eigenschaften, die STIM1-vermittelten SOCE 42zu fördern.

Die chemische Befestigung der a1 Gruppen mit Cys Thiole hat durch eine Samen-Arbeit etabliert, die die Nützlichkeit dieser enzymfreien Ansatz zum Verständnis der standortspezifischen Auswirkungen der Glykosylierung auf Protein-Funktion 43 erstmals nachgewiesen , 44. jüngerer Zeit und in Bezug auf STIM1, die Asn131 und Asn171 Rückstände waren, Cys mutiert und glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] wurde verwendet, um Glukose kovalent mit kostenlosen Thiole 42zu verknüpfen. Hier beschreiben wir dieses Konzept bei dem nicht nur Mutagenese benutzt Website bestimmte Cys Rückstände für Änderung zu integrieren, sondern gilt auch Lösung Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie schnell Änderung Effizienz und strukturelle bewerten Störungen durch die Glykosylierung. Insbesondere diese allgemeine Methodik ist leicht anpassbar Studie zu den Auswirkungen der beiden O- oder N- Glykosylierung eines rekombinant Protein produziert.

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Protokoll

1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-vermittelte Site-verwiesene Mutagenese für die Einbeziehung der Cys in eine bakterielle Haustier-28a Expressionsvektor.

  1. Bestimmen die Konzentration des pET-28a Vektors (d.h. doppelte stranded DNA) mit einem ultravioletten (UV) Aussterben Koeffizienten von 0.020 (μg/mL) cm -1 bei 260 nm.
  2. Synthetisieren ein paar ergänzende mutagene Zündkapseln für jede Cys Mutation die ich) gibt es ein Minimum von 15 Nukleotide komplementär zu der Vorlage, bevor das erste Base Missverhältnis und 15 Nukleotide komplementär zu der Vorlage nach der endgültige Basis Missverhältnis, Ii) total Grundierung Länge nicht mehr als 45 Nukleotiden und Iii) ein Guanin und Cytosin befindet sich an der ersten und letzten Nukleotid Position jedes Primers (Tabelle 1). Primer-Synthese erfolgt mit Hilfe einer 0,025 μmol Skala und Patrone Reinigung zu gewährleisten.
  3. Mit einem High-Fidelity DNA-Polymerase, zwei 20 µL PCR Reaktionsgemischen eingerichtet: eine mit der forward Primer und die zweite mit der rückwärts-Primer. Bereiten Sie jede Mischung Endkonzentrationen von 1 X PCR-Puffer mit 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μM Grundierung, 0.4 μl DMSO enthalten 1.25 ng/μl Schablone DNA, 0,02 U/μl High Fidelity DNA Polymerase.
  4. Zyklus thermisch getrennte Mischungen mit einem drei-Stufen-Protokoll: 98 ° C für 30 s (Denaturierung), 53-56 ° C für 30 s (Tempern), 72 ° C für 30 s kilobase(kb) -1 (Erweiterung) der DNA-Vorlage. Wiederholen Sie das Temperaturprogramm für 5 Zyklen und fügen Sie eine endgültige 72 ° C Erweiterung Schritt für 7,5 min.
  5. Nach der ersten PCR mit vorwärts- und Grundierungen in getrennten Röhren, kombinieren Sie die Produkte in einer einzigen Röhre (d. h. insgesamt 40 μl) und die PCR-Reaktion für eine zusätzliche 20 Zyklen mit den gleichen Radsport Parametern, wie unter Punkt 1.4 beschrieben.
  6. Electrophorese 15 μl des PCR Reaktionsgemisches auf einem 1 % (w/V) Agarose-Gel mit 0,5 X Tris, Essigsäure, Ethylen Diamin Tetra Acetic Acid (EDTA) Puffer (TAE) ausgeführt. Als Steuerelemente electrophorese eine äquivalente Menge an Schablone DNA, die nicht durch PCR verstärkt worden und eine aliquote Referenz DNA-Leiter enthält Marker Bands sowohl größer und kleiner als die erwartete PCR Produktgröße.
  7. Nach Elektrophorese bei 120 V 40 min, Tauchen Sie das Gel in Wasser mit 0,5 μg/mL Interkalation Bromid und schütteln für 30 min bei Raumtemperatur. Bestätigen Sie die Full-length Vorlage hat wurde verstärkt durch die mutagenen Primer als Erhöhung in der relativen Interkalation Bromid Fluoreszenz Intensität der verstärkten Band im Vergleich zur Vorlage Kontrollbande unter UV-Licht (302 nm).
    1. Wenn keine Verstärkung ersichtlich ist, wiederholen Sie die PCR bereinigt Anlasstemperatur in Schritten von 0,5 ° C zwischen 53-56 ° C Temperaturbereich.
  8. Nach der Bestätigung der Verstärkung der Vorlage durch die mutagenen Primer, behandeln die restlichen ~ 25 μL des Reaktionsgemisches PCR mit dem Restriktionsenzym DpnI methylierte Schablone DNA zu verdauen. Verwenden Sie DpnI 0,5 µL (10 Einheiten) pro 25 μL PCR Reaktionsmischung und eine Endkonzentration von 1 × DpnI Reaktion Puffer. 2,5 h bei 37 ° c inkubieren
  9. Nach Vorlage Verdauung, ~ 5-10 μL der verdauten Mischung zu 100 µL der Hitze Schock kompetente DH5α Esherichia coli Zellen in einem 1,75 mL Microcentrifuge Schlauch hinzufügen. Inkubieren Sie die Zelle-DNA-Mischung auf Eis für 60 min.
  10. Hitzeschock Zelle-DNA-Gemisch in den Microcentrifuge Schlauch bei 42 ° C für 45 s auf einen Block, trockene Hitze. Nach Inkubation der Mischung für 3 min auf Eis, 900 μl Raumtemperatur Luria-Bertani Brühe (LB) zu den Zellen und übertragen die gesamte Zellsuspension in ein steriles 14 mL Rundboden Röhrchen.
  11. Die Zellsuspension bei 37 ° C für 90 min mit konstanter Schütteln bei 190 u/min inkubieren.
  12. Anschließend die Zellsuspension zurück auf ein 1,75 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur überweisen.
  13. Nach der Zentrifugation 900 μl des Überstands zu entfernen und erneut die Bakterienzellen durch sanfte Pipettieren in die restlichen 100 μL lb
  14. Übertragen die resultierende konzentrierte Zellsuspension auf eine LB-Agar-Platte mit Antibiotikum, das selektiv für den Ausdruck Vektor (d. h. 60 μg/mLKanamycin). Aseptisch verbreiten die Suspension gleichmäßig auf der Agarplatte und inkubieren ~ 16 h bei 37 ° c
  15. Am Folgetag impfen eine einzige Kolonie von der Platte in 5 mL liquid LB mit dem Antibiotikum Selektionsdruck (d. h. 60 μg/mL Kanamycin). Wachsen die Flüssigkultur über Nacht bei 37 ° C mit konstanter Schütteln bei 37 ° c
  16. Isolieren und reinigen das propagierte Plasmid aus den E. Coli-Zellen mit einem kommerziell erhältlichen Kit basiert auf der alkalischen Lyse Verfahren 45.
  17. Bestätigen die Mutation von Interesse ist vorhanden und in den richtigen Leseraster durch Sanger-Sequenzierung von Plasmid 46.

2. Einheitliche 15 N-markierten Protein-Expression in BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Hinweis: verschiedene rekombinante Proteine erfordern unterschiedliche Ausdruck Bedingungen. Im folgenden finden Sie das optimierte Verfahren zur Expression des menschlichen Proteins STIM1 EFSAM.

  1. Dem Expressionsvektor beherbergen die Cys-Mutationen (d. h. Tier-28a-EFSAM) in BL21 ΔE3 Codon (+) Hitze Schock kompetente Zellen verwandeln und Platte auf LB-Agar-Platten mit der antibiotische Selektionsdruck wie 1,9-1.14 beschrieben) mit der folgende Änderungen: Platte direkt eine 150 μL aliquoten aus insgesamt ~ 1.000 μl Zellsuspension auf der LB-Agar-Platte ohne die Notwendigkeit für die Konzentration der Zellen in einem Microcentrifuge Schlauch durch Zentrifugation.
  2. Am Folgetag aseptisch übertragen eine einzige Kolonie in einen 200-mL-Erlenmeyerkolben mit 20 mL LB ergänzt mit dem entsprechenden Antibiotikum (d. h. 60 μg/mL Kanamycin für Haustier-28a-EFSAM). Wachsen diese flüssige Starterkultur über Nacht (d.h. ~ 16 h) bei 37 ° C mit konstanter Schütteln bei ~ 190 u/min.
  3. Am selben Tag als Schritt 2.2 vorbereiten M9 Medium für 15 N beschriftet Proteinexpression durch Autoklavieren Puffer 1 L M9 Salze (42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH 2 PO 4, 8,6 mM NaCl, pH 7,4) in einem 4 L-Erlenmeyer-Kolben. Nach dem Abkühlen Filtern eine Mischung von 20 % (w/V) D-Glucose, 1 M CaCl 2, 1 M Thiamin, 1 M MgSO 4, 1 mg/mL Biotin und 0,2 g/mL 15 N-NH 4 Cl durch einen 0,2 μm sterile Spritze Filter in der 1 L sterile M9 Salzlösung so dass die Endkonzentrationen dieser Komponenten sind 0,2 % (w/V) D-Glucose, 100 μM CaCl 2, 50 μm Thiamin, 1 mM MgSO 4, 1 μg/mL Biotin und 1 mg/mL 15 N-NH 4 Kl.
  4. Am nächsten Tag, aseptisch übertragen die 20 mL über Nacht flüssige Starterkultur in ein 50 mL sterile konischem Rohr und Zentrifuge bei 2.400 × g für 15 min auf die Zellen pellet.
  5. Nach der LB-Medium dekantieren, Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in 10 mL M9 minimaler Medium und übertragen Sie die resuspendierte Pellet-Mischung in 1 L des M9 minimaler Medium mit Antibiotikum (d. h. 60 μg/mL Kanamycin).
  6. Wachsen die 1 L des M9 minimal die bakterielle Starterkultur bei 37 ° C und ~ 190 u/min konstant schütteln bis die Extinktion bei 600 nm (OD600) erreicht-haltigem Medium ~0.6-0.8.
  7. Wenn der Specfified OD600-Bereich erreicht ist, fügen Sie 200 μM Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) induzieren Proteinexpression.
  8. Nach IPTG hinaus weiter Inkubation der Zellen für die Proteinexpression bei Raumtemperatur mit konstanter Schütteln bei ~ 190 u/min für ~ 16 h (d.h. über Nacht).
  9. Am nächsten Tag ernten die Bakterien durch Zentrifugation bei ~ 10.000 × g, 4 ° C für 30 min.
  10. Dekantieren die LB und die Zelle Pellet in ein 50 mL konische Röhrchen zu übertragen. Speichern Sie die Pellets bei-80 ° C bis Reinigung.

3. Reinigung von rekombinanten Proteinen aus E. Coli.

Hinweis: verschiedene rekombinante Proteine erfordern unterschiedliche Reinigung Verfahren. Im folgenden finden Sie das Protokoll für 6 & #215; Sein-tagged EFSAM Reinigung von Einschlusskörperchen von pET-28a Konstrukt ausgedrückt.

  1. Homogenisieren manuell das gefrorene Bakterienzelle Pellet in 6 M Guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) und 5 mM β-Mercaptoethanol mit einer motorisierten 10 mL-Transfer-Pipette. Fügen Sie ca. 40 mL Guanidin-HCl pro 5 mL Nasszelle Pellet für diesen Schritt.
  2. Folgenden ein 90 min Inkubation bei Raumtemperatur mit konstanter Rotation in einem Ofen Hybridisierung Zentrifugieren die Mischung ~ 15.000 × g, 8 ° C für 40 min. das lösliche Protein die unlöslichen Zellenrückstand (d. h. Pellet) getrennt Mischung (d.h. überstand).
  3. Fügen Sie 750 µL von 50 % (V/V) Ni 2 +-Nitrilotriacetic Säure Agarose bead Gülle, die geklärte lysate und weitere 90 min bei Raumtemperatur mit Inversion in einem Ofen Hybridisierung inkubieren.
  4. Erfassen Sie anschließend 6 × sein-tagged Proteins gebunden an die Ni 2 + durch das Sammeln der Agarose-Perlen in einer Schwerkraft fließen Protein Reinigung Spalte. Ermöglichen die lysate durchfließen der Spalte vollständig vor seinem Umzug nach Schritt 3.5.
  5. Waschen die gesammelten Perlen dreimal mit 10 mL 6 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl pH 8 und 5 mM β-Mercaptoethanol. Sicherzustellen, dass die gesamte 10 mL die Spalte vor jeder nachfolgenden 10 mL durchläuft Wash
  6. Eluieren die Proteine in einer Reihe von 2 mL Fraktionen mit 6 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM Imidazol und 5 mM β-Mercaptoethanol mit einer 90 s Inkubationszeit zwischen Brüchen. Sicherzustellen, dass die gesamte 2 mL der Spalte vor jedem nachfolgenden Elution Schritt durchläuft.
  7. Zu diesem Zeitpunkt bestätigen das Protein des Interesses in der eluierten Bruchteile von Coomassie Blau gefärbten Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit der Methode von Laemmli 47 vorliegt. Bewerten der Proteingröße, Menge und Reinheit im Vergleich gegen standard Molekulargewicht Marker-Bands, die beide sind kleiner als und größer als die erwarteten Molekulargewicht des Proteins des Interesses.
  8. Der eluierten Proteinfraktionen in eine Dialysemembran mit einem 3.500 Da Molekulargewicht cutoff zu bündeln und in 1 L Umfaltung Puffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DVB-t, 5 mM CaCl 2, pH 8) bei 4 ° C inkubieren Übernachtung während der Puffer ist durch eine Magneti gerührt wird C Rührer.
  9. Nach ~ 16 h Umfaltung Zeit ~ 1 U Thrombin pro mg Protein direkt an die Dialyse-Tasche und inkubieren Sie bei 4 ° C für eine zusätzliche ~ 24 h.
  10. Überprüfen Sie dem Ausmaß der 6 × seiner Tag Spaltung von Coomassie blaue Färbung von ~ 15 μl Protein Aliquote entnommen die Dialyse-Tasche vor und nach der Inkubation mit Thrombin die auf denaturierenden Polyacrylamid-Gele (SDS-PAGE) mit electrophoresed sind die Methode von Laemmli 47. Wenn eine ~ 2 kDa-Verschiebung in der Migration beobachtet wird, entspricht das Molekulargewicht des gespalten 6 × seinen Tag fahren Sie mit Schritt 3.11; Wenn ein Bruchteil der unverdaute Eiweiß bleibt, die nachweisbar durch Coomassie blaue Färbung ist, fügen ~0.2 U Thrombin pro mg Protein direkt um die Dialyse-Tasche und inkubieren Sie bei 4 ° C für eine zusätzliche ~ 24 h
  11. Einsatz Größe Ausgrenzung oder Ionenaustausch-Chromatographie, das Protein weiter zu reinigen. Anion-Austausch-Chromatographie von EFSAM, entfernen Sie die Proteinlösung aus der Dialyse-Tasche und Konzentrat ~ 10-divisibel mit einer Ultrafiltration zentrifugale Konzentrator mit einem 10.000 Da Molekulargewicht cutoff. Anschließend wieder Verdünnen der Lösung ~ 20-fold in einem NaCl-freie Puffer (20 mM Tris, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8).
  12. Equilibrate eine abgepackte Anion Austausch Spalte mit 10 Spalte Bände der NaCl-freie Puffer im Schritt 3.11 beschrieben. Equilibrate mit Puffer geladen in einen Luer-Lock-Spritze enthält keine Luftblasen durch Drücken der Lösung durch die Säule in gewissem Sinne tropfenweise und Vermeidung von Spritze Drücke die stetige Ströme von Lösung verlassen die Spalte verursachen. Verwenden Sie ein starkes Anion Exchanger (z.B. vernetzte Agarose mit quaternären Ammonium Funktionsgruppen).
  13. Laden die Proteinlösung verdünnt in NaCl-freie Puffer (Schritt 3.11) auf die Säule, wie unter Schritt 3.12.
  14. Der Proteine in einem Farbverlauf eluieren [d.h. 0 - 60 % (V/V)] der Erhöhung der NaCl-Puffer (20 mM Tris, 1 M NaCl 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8) mit einem zwei-Pumpen schnell Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System. Legen Sie das FPLC System ~1-1.5 mL Fraktionen zu sammeln und das Protein Elution Monitorprofil mit UV-280 nm Absorption und ein Durchfluss 0,5 mL/min
  15. Identifizieren die Elution Spitzen und Brüche, enthält das Protein des Interesses sowie Protein Reinheit von Coomassie Blau gefärbten SDS-PAGE Gelen mit der Methode von Laemmli 47.
  16. Pool Brüche zeigen > 95 % (d. h. als Brüche, die nur eine einziges Protein Band auf Coomassie-Blau gefärbten Gele zeigen genommen) in eine Dialyse Tasche und Austausch in experimentellen Puffer des Interesses durch Dialyse wie unter Schritt 3.8.

4. Chemische Befestigung des Glukose-5-MTS an Protein durch Dialyse.

  1. Prepare a 55 mM Stammlösung der N-(β-D-glucopyranosyl)-N '-[2-methanethiosulfonyl) Ethyl] Harnstoff (Glukose-5-MTS) von 10 mg der Verbindung im 500 μl von 100 % (V/V) DMSO auflösen. Speichern Sie nicht verwendete Glucose-5-MTS solubilisiert in DMSO bei-20 ° c
  2. Bereiten die Protein-Probe für die Modifikation von dialyzing 1,5 mL ~ 60 μM Protein in 1 L der Änderung Puffer bestehend aus 20 mM MOPS, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 und 0,1 mM DÄMMUND, pH 8,3. Verwenden Sie eine Dialyse Membran Molekulargewicht Cutoff, die kleiner ist als die Größe des Proteins geändert wird (z.B. Nutzung einem 3.500 Da Cutoff für ~ 17.500 Da EFSAM).
  3. Nach 24 h bei 4 ° C, die Probe von der Dialyse-Tasche zu einem Microcentrifuge Schlauch übertragen. Fügen Sie das DMSO solubilisiert Glukose-5-MTS, eine Endkonzentration von 2 mM.
  4. Inkubieren Sie die Probe in der Dunkelheit für 1 h bei Raumtemperatur. Während der Inkubationszeit 1 h, mischen Sie die Lösung durch sanftes Antippen des Rohres alle 10 min.
  5. Anschließend wieder tauschen das Protein in den endgültigen experimentelle Puffer enthält keine Reduktionsmittel durch Dialyse bei 4 ° C, wie in Schritt 4.2 oder durch zentrifugale Ultrafiltration beschrieben. Für die Ultrafiltration Verfahren konzentrieren die ~1.5 mL Protein Probe < 0,5 mL und anschließend in der gleichen Konzentrator mit dem experimentellen Puffer verdünnen. Wiederholen Sie diesen Schritt Konzentration-Verdünnung zwei weitere Male, so dass der gesamte Austausch ein Minimum von 30 × 30 × 30 ist = 27,000-fold. Verwenden Sie für EFSAM, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7.5 als experimentelle Puffer.
  6. Die Probe vorbereiten Electrospray Ionisierung Massenspektrometrie durch Dialyse oder Ultrafiltration Austausch wie in 4.2 und 4.5, bzw. in Ammonium Bicarbonat 25 mM oder 25 mM Ammoniumacetat beschrieben. Wenn Dialyse verwenden, stellen Sie sicher, Sie tauschen mindestens dreimal um jede verbleibende NaCl und CaCl 2 Salze zu entfernen.
  7. Bestimmen die genaue Masse (d. h. ± 1 Da) des Proteins des Interesses mit Electrospray Ionisierung mass Spectrometry 48 , 49. Erwarten, dass jeder kovalenten Traubenzucker zusätzlich zu einem Cys Thiol über die Methanethiosulfonate chemische 281.3 Da das Protein hinzu Masse (d.h. 360.4 Da für die Glukose-5-MTS addieren und Subtrahieren von 79,1 Da für die CH 3, also 2 verlassen während kovalente Gruppe Attachement).

5. Lösung NMR Bewertung der modifEffizienz und strukturelle Störungen Ication.

  1. Stellen Sie sicher die Konzentration der geänderten Protein ist > 100 μM nach dem Glukose-Anlage und der letzte Buffer Tausch. Für EFSAM, schätzen die Proteinkonzentration mit einem UV-Aussterben-Koeffizienten bei 280 nm von 1,54 (mg mL – 1) cm – 1.
  2. Ergänzung der Proteinlösung mit 60 μM 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic Säure (DSS) für Shims und Puls Kalibrierung und 10 % (V/V) D 2 O für die Signal-Sperre. Für hohen Signal-Rausch-Einsatz 600 μL Proben in Frequenz abgestimmt 5 mm NMR Röhrchen, eingefügt in eine mindestens 600 MHz-Spektrometer mit einer dreifachen Resonanz HCN Kryo-Sonde ausgestattet.
  3. Standard 1 H - 15 N HSQC-Spektren wie zuvor detaillierte 50 , 51 auf Temperatur, 1 H und 15 N Sweep breiten, Transient und Inkrement zu sammeln Einstellungen für die jeweiligen Probe. Für EFSAM Spektren, Verwendung 20 ° C, 256 1 H Transienten, 64 15 N Dimension Schritten und 1 H und 15 N fegen breiten bis 8.000 und 1.800 Hz "bzw." festgelegt.
  4. Nach der Übernahme des glykosylierten Proteinen Spektrums hinzufügen Dithiothreitol (DTT) NMR-Probe aus einem 1 M bestand, eine Endkonzentration von 15 mM. Die DVB-t-Glukose glyko-entzieht das Protein durch Reduktion der Disulfid-vermittelten Anlage.
  5. Erwerben eine zweite 1 H - 15 N HSQC-unter diesen reduziert/unverändert bietet ein Referenzspektrum um Änderung Effizienz und strukturelle Störungen verursacht durch die Glukose-Anlage zu bewerten.
  6. Mit NMRPipe wie bisher 52 detaillierte NMR Daten verarbeiten. Sicherzustellen, dass die Verarbeitung minimal Datenkonvertierung, Ausstieg, solvent Unterdrückung, Fourier-Transformation und erste Visualisierung der Spektren umfasst.
  7. Assess Modifikation Effizienz durch Messen der Amid Peak Intensitäten und chemischen Verschiebungswerte in den veränderten und reduzierte Spektren mit dem NEASY-Plugin auf CARA 53. Sicherstellen Sie, dass die Peak-Intensität der Cys Amid bewerten sowohl in Glukose befestigt und reduziert Spektren. Wenn der Cys Amid in beiden Spektren nicht zuverlässig gefunden werden kann, verwenden die Intensitäten der Rückstände, die neben der Cys als ein auslesen.
  8. Berechnen die Effizienz als die Intensität der Amid aus dem Cys-modifizierte Spektrum durch die Intensität der Amid aus dem Cys reduziert (d. h. DTT-behandelt) Spektrum geteilt, multipliziert mit 100:
    figure-protocol-1, wo ich bin die Intensität der Amid im Cys-modifizierte Spektrum ist und I R die Intensität der Amid im Cys verringert Spektrum ist. Alternativ, bewerten die mittlere Effizienz über mehrere Amid-Gipfel:
    figure-protocol-2, wo Effizienz i der getrennt ermittelten Effizienz berechnet für jede Rückstände, i, und n ist die Gesamtzahl der Rückstände in der Berechnung verwendet.
  9. Chemische Verschiebung Störungen (CSP) durch die chemische Verschiebung-Unterschiede zwischen den beiden Spektren in 15 N und 1 H Abmessungen der einzelnen Gipfel beobachtet und Normalisierung für die größeren 15 N chemische Verschiebung mit unterschiedlichen berechnen die folgende Gleichung:
    figure-protocol-3, wo ΔH die ppm-Änderung in der Proton-Dimension ist und ΔN die ppm-Änderung in der Stickstoff-Dimension ist.

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Ergebnisse

Der erste Schritt dieses Ansatzes erfordert die Mutagenese der Kandidat Glykosylierung Rückstände Cys Rückstände die modifizierbar mit Glukose-5-m EFSAM sein können hat keine endogenen Cys-Rückstände, also keine besonderen Überlegungen vor dem vorgenommen werden müssen die Mutagenese. Allerdings müssen native Cys Rückstände nicht veränderbaren Rückstände vor der Durchführung der beschriebenen Chemie mutiert werden. Um die native Struktur minimal zu bewirken, empfiehlt sich die Durchführun...

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Diskussion

Protein Glycosylation ist eine Post-translationale Modifikation wo Zucker kovalent an Polypeptide in erster Linie durch Verbindungen zu den Aminosäure-Seitenketten befestigt sind. Mehr als 50 % der Säugetiere Proteine sind glykosylierten 54, wo der glycosylierten Proteine anschließend haben können vielfältige Effekte von biomolekularen Bindungsaffinität zu verändern, Protein Falten, Channel-Aktivität verändern, gezielt zu beeinflussen Moleküle für Abbau und zellulären Menschenhandel, to name a Few...

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Danksagungen

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (05239, B.P.S), kanadische Stiftung für Innovation/Ontario Research Fund (zu B.P.S), Prostata Krebs kämpfen Foundation - Telus Ride für Papa (zu B.P.S) und Ontario Graduate Stipendium (für Y.J.C. und N.S.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Phusion DNA-PolymeraseThermo Fisher ScientificF530SVerwendung in Schritt 1.3.
Generuler 1kb DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1163Verwendung in Schritt 1.6.
DpnI-Restriktionsenzym NewEngland Biolabs, Inc.R0176In Schritt 1.8 verwenden.
Presto Mini-Plasmid-KitGeneAid, Inc.PDH300Verwendung in Schritt 1.16.
BL21 DE3 Codon (+) E. coliAgilent Technologies, Inc.230280In Schritt 2.1 verwenden.
DH5a E. coliInvitrogen, Inc.18265017In Schritt 1.9 verwenden.
0,22 mm SpritzenvorsatzfilterMillipore, Inc.SLGV033RSIn Schritt 2.3 verwenden.
HisPur Ni2+-NTA Agarose-HarzThermo Fisher Scientific88221In Schritt 3.3 verwenden.
3.500 von MWCO DialyseschläucheBioDesign, Inc.D306Verwendung in Schritt 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 und 4.6.
RinderthrombinBioPharm Laboratories, Inc.SKU91-055In Schritt 3.9 verwenden.
5 mL HiTrap Q FF Anionenaustauscher-SäuleGE Healthcare, Inc.17-5156-01In Schritt 3.11 verwenden.
Glukose-5-MTSToronto Research Chemicals, Inc.G441000In Schritt 4.1 verwenden.
Vivaspin 20 Zentrifugalkonzentratoren für UltrafiltrationSartorius, Inc.VS2001Verwendung in den Schritten 3.11, 4.2, 4.5 und 4.6.
PageRuler Ungefärbte breite ProteinleiterThermo Fisher Scientific26630Verwendung in den Schritten 3.7, 3.10 und 3.15
HiTrap Q FF Anionenaustauscher-SäuleGE Healthcare, Inc.17-5053-01In Schritt 3.12 verwenden.
AKTA Reines schnelles Protein-Flüssigchromatrographie-SystemGE Healthcare, Inc.29018224In Schritt 3.14 verwenden.
600 MHz Varian Inova NMR-SpektrometerAgilent Technologies, Inc.In Schritt 5.2 und 5.5 verwenden.

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