Methodenartikel

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

DOI:

10.3791/56319

⸱

23. Oktober 2017

 ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typische Methoden für die Aufklärung der Funktion eines bestimmten Gens beinhalten vergleichende phänotypische Analysen der Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem das gen des Interesses gestört wurde. Ein Gen-Störung DNA-Konstrukt mit einer geeigneten Antibiotika-Resistenz-Markergen eignet sich für die Erzeugung von gen gestört Stämme in Bakterien. Jedoch mit herkömmlichen Bauweisen, die Gene Klonen Schritte erfordern, komplexe und zeitraubende Protokolle verbunden. Hier ist eine relativ einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur gezielten gen Störung in Streptococcus Mutans beschrieben. Die Methode nutzt eine 2-stufige Fusion Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Störung Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation zu generieren. Diese Methode erfordert keine enzymatische Reaktion als PCR, und bietet zudem mehr Flexibilität hinsichtlich der Gestaltung des Konstrukts Störung. Beschäftigung von Electroporation erleichtert die Vorbereitung der kompetenten Zellen und verbessert die Transformationseffizienz. Das vorliegende Verfahren kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen Funktionsanalyse umfasst in der Regel einen phänotypische Vergleich zwischen einem Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem ein bestimmtes Gen des Interesses gestört wurde. Diese gen-Störung-Technik ist für die Funktion von Genanalysen in einer Vielzahl von Taxa, von Bakterien bis zu den Säugetieren verwendet worden. Ein Gen-Störung-Konstrukt ist notwendig für die Generation des Stammes gen gestört; Dieses Konstrukt der Desoxyribonukleinsäure (DNA) besteht aus der Antibiotikaresistenz-Marker-gen mit den vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen des Zielgens verschmolzen und ist integriert in das Genom durch homologe Rekombination. Die gen-gestört Belastung kann mithilfe von Selektivmedien mit dem Antibiotikum isoliert sein. Die konventionelle Methode verwendet für den Bau des Stammes gen gestört erfordert komplexe Arbeitsschritte, wie die Verstärkung des Zielgens durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Unterbindung des Gens in eine geeignete Plasmid, Verdauung mit Einschränkung Enzyme und Religation Antibiotikaresistenz-Marker-gen eingefügt. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, die mehrere Tage bis zu mehreren Wochen, je nach Erfolg der einzelnen Schritte. Darüber hinaus ist das Design der Störung Konstrukte der Beschränkungsenzymsites des Zielgens abhängig. Um diese Probleme zu beheben, wurden DNA-PCR-basierter Spleißen Methoden1,2 für die Gestaltung von gen gestört Mutanten von Dictyostelium Discoideum3 und Synechocystis SP. PCC68034 gemeldet. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode entwickelt, um ein Gen gestört Streptokokken Stamm in eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Art und Weise, unter Verwendung einer modifizierten PCR-basierten Methode (2-stufige Fusion PCR bezeichnet) für den Bau der Störung zu erzeugen Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation.

Die 2-stufige Fusion benötigten PCR genomischer DNA, die Antibiotikaresistenz-Marker-gen als Kopiervorlage PCR und vier Paare von angemessen entworfen Oligonukleotid-Primer. Im ersten Schritt (1St PCR), ein 1-kb upstream flankierenden Region des Zielgens, ein 1-kb downstream flankierenden Region des Ziels werden gen und Antibiotikaresistenz-Marker-gen mittels PCR amplifiziert. Die 5' Regionen der rückwärts-Primer und die forward Primer für Verstärkung von den vorgelagerten und nachgelagerten flankierenden Regionen, bzw. gehören 15 Basen komplementär zu den Enden des Markergens. Die 5' Regionen von forward und reverse Primer für Marker-gen-Amplifikation gehören ebenso 15 Basen komplementär zu der unteren Ende der vorgelagerten flankierenden Region des Zielgens und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Region des Zielgens, bzw.. Daher enthalten die drei amplifizierten Fragmente überlappende 30 Basenpaare Regionen auf dem Fusion-Gelände. Im zweiten Schritt (2Nd PCR) ist die PCR mit verschachtelten PCR Primer verwenden die drei Fragmente, die durch die 1St PCR als Vorlagen verstärkt durchgeführt. Die komplementäre Regionen der Vorlagen sind zusätzlich über 2Nd PCR miteinander verbunden. Zu guter Letzt wird das Konstrukt für homologe Rekombination der Wildtyp Stamm durch Elektroporation vorgestellt. Erfolgreiche gen Störung kann durch PCR mit spezifischen Primern verifiziert werden. Obwohl die Störung Konstrukt mit High-Fidelity-DNA-Polymerase verstärkt ist, sind zusätzliche enzymatische Reaktionen, wie DNA-Ligatur oder DNA-Verdauung, nicht notwendig, um das Konstrukt zu erzeugen. Darüber hinaus kann eine gelöschte oder erhaltene Region über das Genom nach besser gekleideteres Design flexibel gewählt werden.

In der vorliegenden Arbeit erfolgte Löschung der gesamten kodierenden Region des Gens GtfC , die Glucosyltransferase in Streptococcus Mutanskodiert, um die schnelle, einfache gen Störung Methode in einer Streptokokken-Spezies zu demonstrieren. Darüber hinaus eine GtfB-gestörten Belastung wurde auf die gleiche Weise erzeugt. Die Glucosyltransferases von GtfC und GtfB kodiert tragen zur kariogenen dentale Biofilm Entwicklung5,6. Die Bildung von Biofilm Fähigkeiten der Wildtyp-Stamm (S. Mutans WT), GtfC-Dehnung (S. Mutans ΔGtfC) und GtfBgestört-gestörten Belastung (S. Mutans ΔGtfB) wurden ausgewertet für vergleichende phänotypische Analysen. Dieses Protokoll erweitert die Anwendung eines zweistufigen Verfahrens zur gen Störung einer zusätzlichen Arten und für Studien der Genfunktion in einem breiteren Spektrum von Taxa geändert werden kann.

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Protokoll

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1. besser gekleideteres Design

  1. Primer für 2-stufige Fusion PCR und Überprüfung der gen Störung vorzubereiten.
    Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt der Primer-Sequenzen, die in diesem Protokoll verwendeten. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der 2-stufigen Fusion PCR Methode zur Erzeugung von S. Mutans Δ GtfC.
    1. Design Primer für den Ersatz der Zielregion im Genom mit Spectinomycin-Resistenz-Gen (Spc R) 7. Dieses Protokoll ersetzt die gesamte kodierende Region des Gens GtfC mit Spc R.
    2. Gehören Komplementär zu den oberen und unteren Enden der Spc R 15 Stützpunkte an der 5 ' Regionen des Up-Reverse und Down-Forward Primer, beziehungsweise. Einfügen, ergänzen das untere Ende der vorgelagerten flankierenden Regionen GtfC und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Regionen GtfC 15 Stützpunkte an der 5 ' Regionen des Spc R-vorwärts und Spc r -Primer, bzw. rückgängig zu machen ( Abbildung 1A).
      Hinweis: Sequenzen von Up-Reverse, Down-Forward, Spc R - vorwärts und Spc R - reverse Primer werden automatisch in Abhängigkeit vom Ort der Gründung des Konstrukts Störung ermittelt.
    3. Design die bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer umfassen > 1-kb upstream und downstream flankierenden Regionen des Gens GtfC bzw.. Legen Sie die Schmelztemperatur (T m) bis nach vorne und nach unten-Reverse Primer im Einklang mit der Schmelztemperatur des Up-Reverse und Down-Forward Primer, bzw. ( Abbildung 1A).
      Hinweis: Finden Sie die folgende Formel zur Bestimmung von T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, wo * N entspricht der Anzahl der Grundierung Nukleotide mit der angegebenen Identität (A, T, C oder G).
    4. Design verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) für die 2 Nd PCR ( Abbildung 1 b).
      Hinweis: Obwohl die äußerste Primerpaar (bis nach vorne und nach unten-Reverse) als Primer für die 2 Nd PCR verwendet werden können, wurden verschachtelte Primer (N_up-vorwärts und N_up-Reverse) in diesem Protokoll entworfen. Verschachtelte Primer sind häufig erforderlich für die 2 Nd PCR, wie beschrieben in den Vertreter Ergebnisse.
    5. Design Primer spezifisch für Spc R. Die Primer dienen zur Kolonie PCR zum Bildschirm für GtfC Störung.
    6. Design-Primer für die Überprüfung der GtfC Störung.
      Hinweis: Die PCR-Produkte verstärkt mit diesen Primer überspannen die Grenze zwischen GtfC oder Spc R und stromaufwärts oder stromabwärts flankierenden Regionen GtfC. Die Primer-Sets ' GtfC bis nach vorne und GtfC Up-Reverse ' und ' GtfC Down-Forward und GtfC Down-Reverse ' sind spezifisch für GtfC und ' GtfC bis nach vorne und Spc R 2 -umgekehrte ' und ' Spc R 2-vorwärts und GtfC Down-Reverse ' sind spezifisch für Spc R.

2. Genomische DNA-Extraktion von S. Mutans

  1. Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte Gehirn Herz Infusion (BHI). Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  2. Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  3. Zentrifuge die bakterielle Zellkultur für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  4. Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS.
  5. Genomischen DNA aus der Suspension mit einem Wulst-Prügel-Base genomische DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
    1. Übertragung der Aussetzung zu einer Probe 2,0 mL Röhrchen mit Glasperlen (im Kit enthalten). Die Zellsuspension 750 µL Lyse-Lösung (im Kit enthalten) hinzufügen.
    2. Kappe fest und setzen die Rohre symmetrisch in den Schlauchhalter der Wulst-schlagende Störung Vorrichtung. Prozess mit der maximalen Geschwindigkeit für 5 Minuten. Zentrifuge die Wulst geschlagen Proben 1 min auf 10.000 × g. übertragen den Überstand zum Spin Filter (im Kit enthalten) in einem 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 7.000 × g .
    3. Fügen Sie 1.200 µL DNA-Bindung Puffer (im Kit enthalten), das Filtrat. Transfer 800 µL der Mischung auf die Spin-Spalte (im Kit enthalten) zu einer 2,0 mL Sammelröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 10.000 × g.
    4. Verwerfen die Durchströmung der Spin Spalte Waschen die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g. verwerfen der durchströmten sowie 500 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) auf den Spin 200 µL Vorwäsche Puffer (im Kit enthalten) hinzufügen. Spalte, waschen Sie die Spalte Matrix und Zentrifugieren für 1 min bei 10.000 × g.
    5. Setzen Sie die Spin-Säule zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Hinzufügen der Spalte Matrix 100 µL der Elution Buffer (im Kit enthalten).
    6. Zentrifuge für 30 s bei 10.000 × g, die genomische DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.

3. PCR-Amplifikation

  1. Perform 1 St PCR mit S. Tetris s WT Genom und das synthetische Spc R gen als PCR-Vorlagen (siehe Tabelle 1). Verstärken der vorgelagerten flankierenden Region des Gens GtfC, der nachgeschalteten flankierenden Region GtfC gen und das Spc-R-gen mit den drei Sätzen von Primer beschrieben ( Abbildung 1A), als pro Tabelle 2 und Tabelle 3.
    Hinweis: PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..
  2. Jeder PCR-Produkt auf einem 1 % Agarose-Gel Fraktionieren und Verbrauchsteuern die entsprechenden Bänder mit einem Gel Band Cutter.
  3. Reinigen jedes amplifizierten DNA-Produkt aus die Gele mit einem Spin Spalte und Silica Gel Membran-basierte Extraktion Kit.
    1. Übertragung Gel Scheiben zu einer sauberen Microcentrifuge Rohr und mischen mit 500 µL Puffer (im Kit enthalten) zu binden. Die Mischung bei 55 ° C für 15 min inkubieren, bis die Gel Scheiben vollständig gelöst sind.
    2. Setzen Sie die Spin-Säule (im Kit enthalten) in ein Sammelrohr (im Kit enthalten), laden Sie die Probe auf die Spin-Säule und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g. Verwerfen der durchströmten, fügen Sie die 600 µL Waschpuffer (im Kit enthalten) der Spin Spalte Waschen die Kieselsäure-Membran und Zentrifugieren für 30 s bei 11.000 × g.
    3. Verwerfen die Durchströmung und Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g Kieselsäure Membran trocknen.
    4. Legen die Spin-Spalte zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, 50 µL Elution Buffer (im Kit enthalten) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 min.
    5. Zentrifuge für 2 min bei 11.000 × g, die amplifizierte DNA eluieren. Schätzen Sie den DNA-Konzentration und Reinheit durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 Nmusing einem Spektrophotometer und bestätigen, dass die A 260/a 280 Verhältnis größer als 1,8 ist.
  4. Perform 2 Nd PCR der 2-stufigen Fusion PCR mit den drei etwa äquimolaren Fragmente als PCR-Vorlagen, gem. Tabelle 2 < RichtlinienintervallRong > und Tabelle 3.
    Hinweis: Diese Fragmente wurden verstärkt und gespleißt mit verschachtelten Primer ' N_up vorwärts- und N_down-Reverse ' oder die äußerste Primer ' bis nach vorne und nach unten-Reverse ' ( Abbildung 1 b). PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.
  5. Laden ein Zehntel der PCR Reaktionsmischung (5 µL) auf einem 0,8 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate ( Abbildung 1).
  6. Konzentrieren, das verbleibende Endprodukt PCR durch Ethanol Fällung ohne Reinigung.
    1. Hinzufügen 55 µL ultrareines Wasser zu den restlichen PCR Mischung die gesamte Lautstärke zu 100 µL.Add ein Zehntel-Volumen von 3 M Natriumacetat (10 µL), pH 5,2, gefolgt von 2,5 Bände von 100 % Ethanol (250 µL). Mischen und Einfrieren für 30 min bei-80 ° c
    2. Zentrifuge für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C, überprüfen Sie, ob die Kugel auf der Unterseite des Schlauches und den Überstand verwerfen. Das Pellet mit 1 mL 70 % Ethanol, Zentrifuge für 5 min bei 15.000 × g bei 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands. Das Pellet für etwa 30 min an der Luft trocknen und mit 10 µL ultrareines Wasser auflösen.

4. Kompetente Zellen Vorbereitung und Zelle Transformation

  1. Streak Lager S. Tetris s UA159 auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  2. Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 5 mL BHI-Bouillon zu impfen. Kultur der S. Tetris über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  3. Kultur der S. Tetris 2 mL auf 50 mL BHI-Bouillon übertragen und inkubieren Sie für 6-8 h bei 37 ° C zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,2-0,4 unter anaeroben Bedingungen.
  4. Die Zellen für 15 min bei 2.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert, überstand verwerfen und waschen die Zellen zweimal mit 40 mL eiskaltes Wasser, gefolgt von 40 mL 10 % Glycerin.
    Hinweis: Reststoffe Einfluss auf nachfolgende Elektroporation.
  5. Aspirieren den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette, wie die Einhaltung des Pellet-Zelle in 10 % Glycerin reduziert wird. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL frisch 10 % Glycerin, 50 µL der Suspension in jeder 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu verzichten und bei-80 ° C bis kurz vor der Verwendung zu speichern.
  6. Mix der 50 µL Aliquote des eiskalten kompetente Zellen mit 5 µL der Störung Konstrukt oben in Abschnitt 3 beschrieben. Fügen Sie die Mischung zur Elektroporation Küvetten (mit einem 0,2 cm Abstand zwischen den Elektroden). Den Staphylococcus Aureus-Modus beschäftigen (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF 1 Impuls) der Elektroporation Vorrichtung, Electroporate.
  7. Unterbrechen die Zellen in 500 µL der BHI-Bouillon unmittelbar nach Electroporation und Spectinomycin-haltigen BHI-Agarplatten 50 µL der Suspension hinzu.
    Hinweis: Zusätzliche Inkubation Zeit nach Elektroporation nicht erforderlich ist. Jedoch kann die Inkubation für 1-2 h nach Electroporation Transformationseffizienz verbessern.
  8. 2-6 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen die Platte inkubieren.
    Hinweis: S. Mutans Δ GtfB ist aufgebaut wie oben beschrieben. Die gesamte kodierende Region des Gens GtfB wird ersetzt mit dem Erythromycin Widerstand gen 8 in S. Mutans Δ GtfB. Jeder Stamm S. Mutans in BHI Brühe bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.

5. Überprüfung der Gene Störung und Lagerung

  1. Wählen Sie zufällige Kolonien und in die PCR Mischung Kolonie PCR gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3 durchführen zu impfen. PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw. zusammengefasst.
  2. Laden die PCR Reaktionsmischung auf einem 1 % Agarosegel, die Spc R zu bestätigen-spezifischen DNA-Band.
  3. Wählen Sie die positiven Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher und Subkultur Zellen in 10 mL Spectinomycin-haltigen BHI Brühe für 2 Tage bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.
  4. Überprüfen die Generation von S. Mutans Δ GtfC.
    1. Teilen die Zellsuspension gleichermaßen. Genomischen DNA aus den Zellen, die oben beschriebenen zu extrahieren (Schritte 2,3., 2.5.5.). Führen Sie PCR mit genomischer DNA als Vorlage für die PCR, mit Primer für die Überprüfung der GtfC Störungen (Tabelle 1) gemäß Tabelle 2 und Tabelle 3.
      Hinweis: Die PCR-Primer, Reagenzien und Verstärkung Zyklen sind zusammengefasst in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3, bzw..
    2. Laden die PCR-Mischung auf einem 2 % Agarose-Gel und vergleichen Sie die verstärkte Bandgröße mit der erwarteten Bandgröße zu bestätigen, die Generierung von entsprechenden Amplifikate .
    3. Zentrifugieren verbleibende Zellsuspension für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° c Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL PBS.
    4. Zentrifuge für 15 min auf 2.000 × g bei 4 ° C. Aufschwemmen die Zelle pellet in 1,5 mL BHI-Bouillon mit 25 % Glycerin und speichern in-80 ° ADR-20 ° C.

6. Phänotypische Analyse

  1. Streifen jedes S. Tetris s Belastung auf eine Agarplatte BHI. Die Platte über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen auszubrüten.
  2. Eine einzige Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher abholen und in 2 mL BHI-Bouillon mit oder ohne entsprechenden Antibiotikum zu impfen. Inkubation über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen.
  3. 20 µL der Nacht Kultur Suspension in 2 mL BHI-Bouillon mit 1 % oder 5 % Saccharose ohne Antibiotika in ein Reagenzglas zu impfen; mit dem Reagenzglas in eine Schräglage über Nacht bei 37 ° C unter anaeroben Bedingungen Kulturzellen.
  4. Vortex das Glas Reagenzgläser für 10 s und dekantieren Kultur Suspensionen. Die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Coomassie Brilliant blau (CBB) um die Biofilme Fleck auf der Rohrwand und inkubieren dann 1 min.
  5. Der Färbelösung zu dekantieren, die Reagenzgläser dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen und trocknen die Reagenzgläser.
  6. Farbdichte und Erweiterung des CBB gebeizt-Biofilms visuell zu bestimmen, die Bildung von Biofilm Fähigkeit in eine phänotypische Analyse bewerten.

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Ergebnisse

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Abbildung 2 zeigt, dass die Größe der einzelnen Produkte von der 1St PCR, war wie auf dem 1 % Agarosegel beobachtet, in guter Übereinstimmung mit der prognostizierten Größe von ca. 1 kb. Abbildung 3 zeigt die Gel-Elektrophorese Analyse der Produkte der 2Nd PCR. Abbildung 4 zeigt S. Mutans Kolonien mit der Störung-Konstrukt und ein Gel-Elektrophorese Analyse der Kolonie-...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll sind die Primer für die 1St PCR auszulegen, um ca. 1 kb upstream und downstream flankierenden Regionen der Zielregion im Genom zu verstärken. Solche lange flankierenden Sequenzen sind notwendig, um die Effizienz der homologen Rekombination.

Die Sequenzen der Primer (Up-Reverse, Down-Forward, SpcR-vorwärts und SpcR-rückwärts) in diesem Protokoll wurden automatisch ermittelt basierend auf dem Gelände der Einbeziehung des Kons...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften [Grant-Nummern 16 K 15860, T.M und 15 K 15777 N.H] unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Streptococus mutansStammstamm im Labor.Wildtyp-Stamm (Stamm UA159)
Genomisches DNA-ExtraktionskitZymo ResearchD6005
Bead-Beating-DisruptionsapparatTaitecGM-01
Synthetische GeneEurofins GenomicsKundenspezifischeSpectinomycin- und Erythromycin-Resistenz-Gene
ThermocyclerAstecPC-708
PCR-PrimerEurofins GenomicsKundenspezifische Bestellung35 Basen in der Länge
DNA-PolymeraseTakaraR045AHigh-Fidelity DNA-Polymerase
Gel-ExtraktionskitNippon GeneticsFG-91202DNA-Extraktion aus Agarose-Gel
Gel-BandschneiderNippon GeneticsFG-830
SpektralphotometerBeckman CoulterDU 800
ElektroporatorBio-rad1652100
ElektroporationsküvetteBio-rad16520860,2 cm Spalt
AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03Anaerobes Kultursystem
Gehirn Herz InfusionsbrüheBecton, Dickinson237500Bakterielle Nährmedien
SpectinomycinWako195-11531Antibiotika
ErythromycinWako057-07151Antibiotika
SaccharoseWako196-00015Für die Biofilmentwicklung
CBB R-250Wako031-17922Für die Biofilmfärbung
mit

Referenzen

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Schlagwörter

Gene DisruptionFusion PCRElectroporationCompetent CellsGenomic DNA ExtractionSpectinomycin ResistanceNested PrimersBHI BrothAnaerobic Conditions

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