Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Typische Methoden für die Aufklärung der Funktion eines bestimmten Gens beinhalten vergleichende phänotypische Analysen der Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem das gen des Interesses gestört wurde. Ein Gen-Störung DNA-Konstrukt mit einer geeigneten Antibiotika-Resistenz-Markergen eignet sich für die Erzeugung von gen gestört Stämme in Bakterien. Jedoch mit herkömmlichen Bauweisen, die Gene Klonen Schritte erfordern, komplexe und zeitraubende Protokolle verbunden. Hier ist eine relativ einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur gezielten gen Störung in Streptococcus Mutans beschrieben. Die Methode nutzt eine 2-stufige Fusion Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Störung Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation zu generieren. Diese Methode erfordert keine enzymatische Reaktion als PCR, und bietet zudem mehr Flexibilität hinsichtlich der Gestaltung des Konstrukts Störung. Beschäftigung von Electroporation erleichtert die Vorbereitung der kompetenten Zellen und verbessert die Transformationseffizienz. Das vorliegende Verfahren kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.
Einleitung
Gen Funktionsanalyse umfasst in der Regel einen phänotypische Vergleich zwischen einem Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem ein bestimmtes Gen des Interesses gestört wurde. Diese gen-Störung-Technik ist für die Funktion von Genanalysen in einer Vielzahl von Taxa, von Bakterien bis zu den Säugetieren verwendet worden. Ein Gen-Störung-Konstrukt ist notwendig für die Generation des Stammes gen gestört; Dieses Konstrukt der Desoxyribonukleinsäure (DNA) besteht aus der Antibiotikaresistenz-Marker-gen mit den vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen des Zielgens verschmolzen und ist integriert in das Genom durch homologe Rekombination. Die gen-gestört Belastung kann ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. besser gekleideteres Design
- Primer für 2-stufige Fusion PCR und Überprüfung der gen Störung vorzubereiten.
Hinweis: Die Tabelle 1 zeigt der Primer-Sequenzen, die in diesem Protokoll verwendeten. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der 2-stufigen Fusion PCR Methode zur Erzeugung von S. Mutans Δ GtfC.- Design Primer für den Ersatz der Zielregion im Genom mit Spectinomycin-Resistenz-Gen (Spc R) 7. Dieses Protokoll ersetzt die gesamte kodierende Region des Gens GtfC mit Spc R.<....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt, dass die Größe der einzelnen Produkte von der 1St PCR, war wie auf dem 1 % Agarosegel beobachtet, in guter Übereinstimmung mit der prognostizierten Größe von ca. 1 kb. Abbildung 3 zeigt die Gel-Elektrophorese Analyse der Produkte der 2Nd PCR. Abbildung 4 zeigt S. Mutans Kolonien mit der Störung-Konstrukt und ein Gel-Elektrophorese Analyse der Kolonie-.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
In diesem Protokoll sind die Primer für die 1St PCR auszulegen, um ca. 1 kb upstream und downstream flankierenden Regionen der Zielregion im Genom zu verstärken. Solche lange flankierenden Sequenzen sind notwendig, um die Effizienz der homologen Rekombination.
Die Sequenzen der Primer (Up-Reverse, Down-Forward, SpcR-vorwärts und SpcR-rückwärts) in diesem Protokoll wurden automatisch ermittelt basierend auf dem Gelände der Einbeziehung des Kons.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften [Grant-Nummern 16 K 15860, T.M und 15 K 15777 N.H] unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Streptococus mutans | Stammstamm im Labor. | Wildtyp-Stamm (Stamm UA159) | |
| Genomisches DNA-Extraktionskit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-Beating-Disruptionsapparat | Taitec | GM-01 | |
| Synthetische Gene | Eurofins Genomics | Kundenspezifische | Spectinomycin- und Erythromycin-Resistenz-Gene |
| Thermocycler | Astec | PC-708 | |
| PCR-Primer | Eurofins Genomics | Kundenspezifische Bestellung | 35 Basen in der Länge |
| DNA-Polymerase | Takara | R045A | High-Fidelity DNA-Polymerase |
| Gel-Extraktionskit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA-Extraktion aus Agarose-Gel |
| Gel-Bandschneider | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spektralphotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Elektroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Elektroporationsküvette | Bio-rad | 1652086 | 0,2 cm Spalt |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobes Kultursystem |
| Gehirn Herz Infusionsbrühe | Becton, Dickinson | 237500 | Bakterielle Nährmedien |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotika |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotika |
| Saccharose | Wako | 196-00015 | Für die Biofilmentwicklung |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | Für die Biofilmfärbung |
Referenzen
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
