In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunsystem. Als antigenpräsentierende Zellen (APCs) sie können mit Lymphozyten über beide Antigenpräsentation kommunizieren und Cytokine release^1,2,3. Ihre primäre Funktion ist jedoch als professionelle Phagozyten, Krankheitserreger, gealterten Zellen und Zelltrümmer^1,4löschen. Nach einer Rückenmarksverletzung ("SCI") ist verantwortlich für CNS Axon Myelinisierung⁵Zelltyp erhebliche Mengen von Myelin Schutt von sterbenden Oligodendrozyten generiert. Wir und andere haben gezeigt, dass Clearance von Myelin Schutt in erster Linie die Verantwortung der Infiltration BMDMs^5,6,7. Allerdings wurde in Verletzung des Rückenmarks Websites Engulfment von Myelin Schutt vorgeschlagen, diese normalerweise entzündungshemmenden Zellen auf einer Pro-entzündliche Zustand^5,8,9verschoben. Als wichtige Vermittler von Neuroinflammation im verletzten Rückenmark sind BMDMs wichtige klinische Ziele.

Um den Einfluss der BMDMs im verletzten Rückenmark untersuchen zu helfen, haben wir eine in-Vitro -Modell, um direkt zu studieren, wie BMDMs auf Myelin Schmutz reagieren entwickelt. Zur Verbesserung der biologischen Relevanz sind primären murinen BMDMs und frisch isolierte Myelin Ablagerungen in diesen Untersuchungen verwendet. Als solche, die hier vorgestellten Methoden auch detailliert die Isolation und die Kultur der primären murinen BMDMs und eine modifizierte Saccharose gradient Technik, murine CNS isolieren abgeleitet Myelin Schutt^10,11,12. Myelin Schmutz kann leicht beschriftet werden, mit einem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-), zu verfolgen, die die Internalisierung von BMDMs. CFSE-für diese Anwendung geeignet ist, denn es ist nicht zytotoxisch und seine schmalen Fluoreszenzspektrum Genehmigungen Multiplexen mit anderen fluoreszierende Sonden^13,14. Nach Phagozytose Myelin Schutt Lipide sind durch den Lysosomen transportiert und als neutralen Lipiden in intrazellulären Lipid Tröpfchen⁵verpackt. Um diese intrazellulären Lipid-Ansammlung zu quantifizieren, präsentieren wir ein Öl rot O (ORO) Färbung Methode optimiert für quantitative Bildanalyse. Diese einfache Färbung Methode produziert robuste reproduzierbare Ergebnisse und Quantifizierung¹⁵. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Myelin Schutt Phagozytose und Lipid-Aufbewahrung mit begrenzten Spezialausrüstung.

Die Methoden hier beschrieben und in Abschnitt 2 von der Florida State University institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und folgt die Vorgaben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren,^{8 Auflage} . Alle Tiere, die in diesem in diesem Protokoll verwendeten sind Haus in einem speziellen Labor Tier bis zur Verwendung. Keine in-Vivo -Experimente wurde durchgeführt vor opfern. Tierzahlen beruhten auf experimentelle Notwendigkeit durchschnittliche Zelle und Myelin Sammlungen als Leitfaden verwenden, um die Nutzung zu minimieren.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Generation von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) (Abschnitt 1), die Vorbereitung von Eindringmittel beschrifteten Gehirn abgeleitet Myelin Schutt (Abschnitt 2), das allgemeine Verfahren für die Analyse von Myelin Schutt Phagozytose (Abschnitt 3), und das allgemeine Verfahren für die Analyse der Myelin Schutt Lipid Akkumulation (Abschnitt 4). Reagenz-Vorbereitung, Zelle Ernte und Manipulation, Myelin-Sammlung und Kennzeichnung und Testleistung sollte in einem laminaren Luftstrom Biosafety Kabinett abgeschlossen sein.

1. Generation der primären Knochenmark stammenden Makrophagen

1. Erstellung von kompletten Makrophagen Kulturmedium (CMCM)
   Hinweis: Makrophagen-Generation aus dem Knochenmark erfordert den Einsatz von Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF). Dieses Präparat nutzt L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien als Quelle für M-CSF.
   1. Generieren Sie L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien durch Kultivierung Zellen in 145 mm Schalen mit 50 mL des hohen Glukose (4500 mg/L L-Glukose) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 7 Tage mit 5 % neue geboren Kälberserum (NCS) und Penicillin/Streptomycin ergänzt.
   2. Sammeln Sie Medien aus Kulturen in 50 mL konische Zentrifuge Röhren und Zentrifuge für 30 Minuten bei 3500 X g, 4 ° C.
   3. Filtern Sie Überstände durch einen 0,2 µm Spritze Filter in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL. Konditionierte Medien können bis zu 6 Monaten bei-80 ° C aufbewahrt werden.
   4. Um hohe Glukose DMEM, fügen Sie 5 % Vol/Vol NCS, 15 % Vol/Vol L929 murine Fibroblasten bedingt DMEM und 1 % Penicillin/Streptomycin. Medien können 2-3 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Auf 37 ° C vor dem Gebrauch warm.
2. Sammlung von primären Knochenmark-Zellen und Makrophagen Induktion
   Hinweis: Mit diesem Protokoll eine Maus erzeugt etwa 20 Millionen Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs).
   1. Einschläfern Sie die gewünschte Anzahl von 8-10 Wochen alte Mäusen mit CO₂ Erstickung Standardrichtlinien durch zervikale Dislokation gefolgt.
   2. Desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol (Vol/Vol): H₂O, das Fell zu sättigen.
   3. Schneiden Sie eine kleine Öffnung in den Bauch und ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut um das darunter liegende Gewebe sichtbar zu machen. Achten Sie darauf, keine Punktion der Bauchhöhle.
   4. Entfernen Sie beide Hinterbeine an der Hüfte beginnend und endend am Knöchel. Ort der gesammelten Gewebe in eine 100 mm Petrischale mit 5-10 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin.
      Hinweis: Beim Verarbeiten mehrerer Tiere achten, Gerichte auf Eis, Gewebe Abbau zu begrenzen zu halten.
   5. Entfernen Sie Muskel- und Bindegewebe aus dem Knochen mit einem Skalpell. Nur das Femur und Tibia dienen zur Zellentnahme, die Fibula verworfen werden kann.
   6. Aussetzen des Knochenmark-Hohlraums der gesammelten Knochen durch einen kleinen Ausschnitt von jedem Ende mit einem Skalpell zu trimmen.
   7. Mit einer 25g Nadel, spülen Sie das Knochenmark Hohlräume mit CMCM in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Die Knochen werden weiß angezeigt, sobald sie ausreichend geleert wurden.
   8. Nach Abschluss der Sammlung agitieren Sie Aspiraten mit einer Nadel 18g für 30-90 s erzeugt eine einzelne Zellsuspension.
      Hinweis: Ein optionale Erythrozyten (RBC) Lyse Schritt kann zu diesem Zeitpunkt ausgeführt werden. Es wurde vor kurzem vermutet, dass die intrazelluläre Eisengehalt der Auswirkungen von Myelin Schutt auf Makrophagen Polarisation¹⁶beeinflussen kann. Informationen über die Einbeziehung von RBC Zerstörung Schritt finden Sie unter Trouplin Et Al. ¹⁷.
   9. Filtern Sie die Aussetzung durch eine 70 µm sterile Zelle Sieb in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL.
   10. Samen Zellen gleichmäßig in 145 mm Zelle Kultur Speisen mit 15-20 mL CMCM gesammelt. Verwenden Sie ca. drei Kultur Gerichte per Mausklick geopfert. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂Kulturen.
   11. Nach 72 Stunden Platten einmal mit sterilen PBS waschen, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie dann 15-20mL frische CMCM. Weitere 4 Tage bei 37 ° C, 5 % CO₂inkubieren Sie Kulturen. Nach 7 Tagen der gesamten Kultur werden die blutbildenden Knochenmarkzellen zunächst isoliert Reifen BMDMs (Abbildung 1).

2. Generation von Eindringmittel beschrifteten Brain-Derived Myelin Schutt

Hinweis: Alle Reagenzien können bis zu 1 Monat bei 4 ° C aufbewahrt werden.

1. Vorbereitung von Myelin Schutt Sammlung Reagenzien
   1. Tris· vorbereiten CL-Pufferlösung.
      1. 800mL hinzufügen destilliertem entionisiertem H₂O (DdiH₂O), 20 mL 1 M Tris· CL, pH 7,45 (20 mM Endkonzentration) und 20 mL 100 mm Na₂EDTA (2 mM Endkonzentration).
      2. Stellen Sie ein pH-Wert um 7.45 Uhr. Stellen Sie die Lautstärke auf 1000 mL mit DdiH₂O. Filter-Lösung durch einen 0,2 µm Filtrationseinheit.
   2. Bereiten Sie 1 M Saccharoselösung.
      1. Auf 100 mL Tris· CL Puffer-Lösung, fügen Sie 68,46 g Saccharose. Lautstärke auf 200 mL mit Tris· CL-Pufferlösung. Filtern Sie die Lösung durch eine Filteranlage von 0,2 µm.
   3. Bereiten Sie 200 mL von 0,32 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).
   4. Bereiten Sie 150 mL 0,83 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).
2. Sammlung von Brain-derived Rohöl Myelin Schutt
   Hinweis: Die hier beschriebene Methode der Sammlung ist für die Isolierung von Rohöl Myelin Schutt.
   1. Einschläfern Sie 10-12 Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO₂ Erstickung Standardrichtlinien gefolgt von zervikale Dislokation.
   2. Sezieren Sie die Gehirne zu und legen Sie sie in eine 100 mm Schale mit 10 mL von 0,32 M Saccharoselösung.

(3) Myelin Schutt Phagozytose Assay

Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von Phagozytose Eindringmittel beschrifteten Myelin Schutt. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.

1. Vorbereitung der Behandlung Platten
   1. Für jede Platte 145 mm Reifen BMDMs in eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 5-6 mL 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS) (pH 7,4) sammeln.
      Hinweis: Verwenden Sie Trypsin nicht, da es den Aktivierungsstatus der Zellen¹⁸verändern kann.
   2. Jedes Rohr gesammelt Zellen ein gleiches Volumen des vorgewärmten CMCM hinzufügen.
   3. Zentrifuge bei 180 X g für 8 min bei 20 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
   4. Wieder aussetzen Sie Zellen in CMCM und Count.
   5. Fügen Sie in jede Vertiefung einer 24-Well-Zelle-Kultur-Platte 1 x 10⁵ Zellen in 1 mL der CMCM hinzu.
   6. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 24 h.
2. Myelin Schutt Behandlung und Analyse
   1. Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL CFSE Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration) beschriftet.
   2. 1-3 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO₂inkubieren.
   3. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verschlungen Myelin Ablagerungen zu entfernen.
   4. 400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren
   5. Waschen Sie Platte 2 Mal mit sterilen PBS.
   6. Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT vor Licht geschützt werden.
   7. Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.
   8. Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung, Immunofluoreszenz zu reduzieren.
   9. Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop.
      Hinweis: Die Anregung und Emission Wellenlängen des CFSE-sind 494 nm und 521 nm, beziehungsweise.
   10. Teilen Sie die Anzahl der CFSE-positive Zellen durch die Anzahl der Nukleonen relative Myelin Schutt Aufnahme zu bestimmen.
   11. Pflegen Sie vor der Bildgebung Platten für bis zu 7 Tage bei 4 ° C, vor Licht geschützt.

(4) Quantifizierung der intrazellulären Lipide über Öl Färbung rot-O

Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von intrazellulären Myelin-Schutt-derived Lipide.Die Verwendung von CFSE beschriftet Myelin Schutt empfiehlt sich nicht für fluoreszierende Quantifizierung von ORO Färbung durch spektrale Überlappung. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.

1. Vorbereitung der Färbung Lösungen
   1. 0,5 % Öl rot-O (ORO) Färbelösung vorzubereiten.
      1. Fügen Sie langsam 100 mL 100 % Propylenglykol (1,2-Propandiol) bis 0,5 g Oro (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) unter Rühren.
      2. Erhitzen Sie die Lösung bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis alle große Partikel aufgelöst haben.
         Hinweis: nicht erhitzen über 100 ° C.
      3. Lösung durch ein Stück Filterpapier während noch warm in einen neuen Container zu filtern.
      4. Lassen Sie zu, dass Lösung kühlen über Nacht bei RT-Lösung für bis zu 1 Jahr bei RT aufbewahrt werden können
   2. 85 % Propylenglykol Lösung ansetzen.
      1. 15 mL DdiH₂O. rühren, bis gemischt fügen Sie 85 mL 100 % Propylenglykol hinzu. Lösung kann bis zu 1 Jahr bei RT gelagert werden
2. Vorbereitung der Behandlung Platten
   1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte nach der in Abschnitt 3 beschriebenen Methode.
   2. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 24 h.
3. Myelin Schutt Behandlung
   1. Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration).
   2. 1-3 h bei 37 ° C, 5 % CO₂inkubieren.
   3. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verdaut Myelin Ablagerungen zu entfernen.
      Hinweis: An dieser Stelle Platten können entweder sofortige Fixierung unterziehen oder frische CMCM kann hinzugefügt werden, und Zellen nach Inkubation für zusätzliche Zeitpunkte zurück.
   4. 400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren
   5. Waschen Sie die Platte 2 Mal mit sterilen PBS dann Handlungsschritte zu beflecken.
4. ORO Färbung und Analyse
   1. Waschen Sie feste Platte mit DdiH₂O. 3 Mal
   2. 400 µL 100 % Propylenglykol in jede Vertiefung hinzufügen und 5 min bei RT inkubieren
      Hinweis: Dies reduziert die Übertragung von DdiH₂O.
   3. Aspirieren Sie das Propylenglykol und jedes gut fügen Sie 400 µL ORO-Lösung hinzu.
   4. 8 min bei 60 ° c inkubieren
   5. Aspirieren Sie die ORO-Lösung. Dann fügen Sie 400 µL von 85 % Propylenglykol in jede Vertiefung und 5 Minumintes bei RT inkubieren
   6. Waschen der Platte 3 Mal mit DdiH₂O.
   7. Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT, vor Licht geschützt werden.
   8. Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.
   9. Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung.
   10. Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. ORO kann mit einem standard Texas Red oder DsRed Filtersatz abgebildet werden.
   11. Quantifizieren Sie relative Lipid Aufbewahrung durch Bestimmung der ORO positiven Bereichs in jedem Bildfeld und dividiert sie durch die Anzahl der Nukleonen.
   12. Pflegen Sie Platten für 7 Tage bei 4 ° C vor Licht geschützt.

Behandlung von BMDMs mit CFSE beschriftet Myelin Ablagerungen sollten klare Internalisierung (Abbildung 2) ergeben. Während eine 3-stündigen Interaktionszeit für BMDMs, genügend zusätzlichen Myelin Schutt für robuste nachgelagerten Erkennung phagozytieren ausreicht, kann mit weniger als 1 Stunde von Interaktion intrazelluläre Akkumulation beobachtet werden. Jedoch kann einige Myelin Trümmer nach dem Waschen immer noch auf der Zelloberfläche vorhanden sein. Dies ist möglicherweise aufgrund von nicht genügend Wasch- oder Partikel, die nicht vollständig in den frühen Phasen der Phagozytose verinnerlicht wird.

Während BMDMs Myelin Schmutz schnell verinnerlichen können, lysosomalen Verarbeitung vor ORO färbbaren Lipid Tröpfchen Form erforderlich. Um zu demonstrieren, wurden BMDMs mit Myelin Schutt für 90 Minuten inkubiert, gewaschen und für zusätzliche Mengen an Zeit vor der Fixierung und Färbung (Abbildung 3) kultiviert. Abbildung 4 zeigt, dass es eine Verzögerung zwischen dem Behandlungsbeginn und neutral Lipid aussehen. Anzumerken ist, dass Lipid Aufbewahrung während der Kultur nicht stabil ist. BMDMs startet um kumulierte Lipide bald nach Tropfenbildung zu metabolisieren. Daher empfehlen wir warten nicht länger als 24 Stunden zwischen waschen Weg nicht verschlungen Myelin Schutt und Fixierung.

Quantifizierung der ORO gefärbten Bereich zeigt die Rate der Myelin Fettstoffwechsel in BMDMs (Abbildung 5). Nach einer 90-minütigen Interaktion wurden Zellen nach Inkubation in frischen CMCM zurückgegeben. In der Frühzeit der Chase in frisches Medium verstoffwechseln die BMDMs die phagozytiertes Myelin Schutt Lipidkomponente in neutralen ORO färbbaren Lipide. Eine stetige Zunahme im positiven Bereich ORO ist typisch in den Stunden nach der Interaktion. Nach 24 Stunden jedoch die BMDMs Effluxed haben oder einen erheblichen Teil der intrazellulären Lipide metabolisiert.

Abbildung 1 : Vertreter BMDM Kulturen. Paar adhärente Zellen werden zunächst beobachtet werden. Am 3. Tag werden alle nicht-anhaftende Zellen entfernt. Tag 7 werden Reifen Knochenmark stammenden Makrophagen eingehalten. Skala = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Vertreter Bilder von BMDM Myelin Schutt Phagozytose Assay. Zellen wurden behandelt mit 1mg/mL CFSE beschriftet Myelin Schutt für 1 Stunde vor dem Waschen und Fixierung mit 4 % PFA. Verinnerlichten Myelin Trümmer kann mit standard GFP Filtersätze auf einem Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop visualisiert werden. Skala = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Diagramm der Versuchsplanung Öl rot O (ORO). BMDM sind mit 1mg/mL Myelin Schutt (1: 100 Verdünnung) für 90 Minuten, gefolgt von Wasch- und Kultur in frischem Medium vor Fixierung behandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : ORO Färbung des BMDM nach Myelin Schutt Phagozytose. Folgenden Fixierung mit 4 % PFA zu den angegebenen Zeitpunkten, BMDMs mit ORO und Hoechst 33258 befleckt waren. Repräsentative Bilder für jeden Zeitpunkt angezeigt werden. Skala = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Quantitative Bildanalyse von ORO beflecken. Für die Quantifizierung der ORO Färbung wurden 3 Brunnen bei 20 X mit 5 Bildern pro Bohrloch abgebildet. Alle Bildeinstellungen Erwerb waren identisch. Fehlerbalken = SEM (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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