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Methodenartikel

Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

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DOI:

10.3791/56325

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12. Oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

Zusammenfassung

Niedrige High-density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C) Ebenen sind einer der leistungsstärksten unabhängigen negative Prädiktoren für arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Struktur und Funktion von HDL statt HDL-C können Arteriosklerose genauer vorherzusagen. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. HDL-Funktion richtet sich normalerweise nach zellbasierte Assays wie Cholesterin-Efflux-Assay, aber diese Tests haben zahlreiche Nachteile fehlende Standardisierung. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. HDL-Oxidation beeinträchtigt HDL-Funktion. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Lipid-Sonde Interaktionen sollten als Interpretation der Ergebnisse der nicht-enzymatische Fluoreszenz Tests zur Messung der Lipid oxidativen Status berücksichtigt werden. Dies hat uns motiviert, entwickeln eine zellfreie biochemische enzymatische Methode zur HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox) zu ermitteln, die zur HDL Dysfunktion beiträgt. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-c quantifizieren kann Hier ist ein Protokoll Describedfor Bestimmung des HDL-Lipid Peroxidation verwenden das Fluorochrom-Reagenz. Assay-Variabilität kann durch strikte Standardisierung der experimentellen Bedingungen reduziert werden. Höhere HDLox Werte sind verringerte HDL antioxidative Funktion zugeordnet. Das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen von kardiovaskulären Erkrankungen, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen. Dieser technische Ansatz ist eine robuste Methode zur HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beurteilen, wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose haben).

Einleitung

Arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) ist die führende Ursache des Todes weltweit1,2. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass geringe Mengen an High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterin in der Regel umgekehrt das Risiko für die Entwicklung von Atherosklerose1,2zugeordnet sind. Obwohl einige Studien eine Atheroprotective Rolle für HDL1,2unterstützen, ist der Mechanismus, mit dem HDL die Initiierung und Progression der Atherosklerose dämpft, komplex 3,4. So wurde vermutet, dass die komplexe Struktur und Funktion des HDL statt absolute Ebene Atherosklerose 5,6,7,8genauer vorhersagen können. Mehreren Veränderungen HDL Protein- und Lipid kompositorischen, die HDL-Funktion beeinträchtigen in entzündlichen Zuständen wie Arteriosklerose. Diese i) reduzieren seinen Cholesterin Efflux potenzielle 9, Ii) verringern Sie anti-entzündliche und Erhöhung der HDL-assoziierten entzündungsfördernde Proteine 6,7, (Iii) Abnahme Antioxidans Faktorstufen und Aktivität und HDLs Fähigkeit zur Hemmung der Oxidation von Low Density Lipoprotein (LDLox)10 und iv) Lipid Hydroperoxid Inhalt und Redox-Aktivität (HDLox)9,11zu erhöhen. Robust-Assays, die die Pleotropic Funktionen des HDL (z. B. Cholesterin Efflux, antioxidative Funktion) auswerten können Bestimmung des HDL-HDL-C in der Klinik ergänzen.

HDL-Funktion wird in der Regel durch Zell-basierte Methoden wie das Cholesterin Efflux Assay8,12,13,14bewertet. Diese Methoden haben wesentliche Einschränkungen einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende Standardisierung und verwirrende Effekte von Triglyceriden 7,15. Diese Nachteile aufwerfen Schwierigkeiten für große klinische Studien16. Zellfreie Assays können robustere Maßnahmen der HDL-Funktion im Vergleich zu zellbasierte Assays geben. Der Cholesterin-Efflux ist eine der wichtigsten Funktionen von HDL, aber es kann nur durch zellbasierte Assays ermittelt werden. Andere Ansätze zur HDL-Funktion wie Proteomics17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen, 24 und zellbasierte Monocyte Chemotaxis-Assays HDL Funktion 17,22,25 nicht standardisiert wurden und nicht in großem Maßstab Studien am Menschen verwendet werden.

HDL hat bedeutende antioxidative Atheroprotective Effekt5,6,7,8. Die antioxidative Funktion von HDL wurde im Beisein von LDL in vorherigen Zelle frei fluorometrischen Assays 26bestimmt. Diese biochemischen fluorometrischen Methoden der HDL antioxidative Funktion wurden ursprünglich von Mohamad Navab und Alan Fogelman und ihre Kollegen26entwickelt. Obwohl viele Studien am Menschen diese Methoden verwendet haben, um festzustellen, HDL Funktion 17,18,19,20,21,22,23 ,24, Lipid (HDL)-Lipid (LDL) und Lipid-Fluorochrom Interaktionen begrenzen Reproduzierbarkeit dieser Zelle frei nicht-enzymatische biochemischen Assays HDL Funktion27,28.

Vor kurzem Interesse konzentriert sich auf die funktionellen Konsequenzen der HDL-Oxidation, die das Ergebnis der Oxidation von Lipiden und Proteinen innerhalb von HDL 27,29,30. Frühere Studien haben gezeigt, dass Oxidation von HDL HDL Funktion 27,29,30beeinträchtigt. HDL hat eine Hauptrolle in Lipid Peroxid Transport und hohes Maß an Lipid-Peroxide bezieht sich auf abnormale HDL-Funktion. Somit kann HDL Lipid Peroxid Inhalte zur Bestimmung der HDL-Funktion 9,17,20,31 und angesichts der bekannten Grenzen der vorherige Assays von HDL-Funktion7, 15,27,32, wir entwickelt alternatives fluorometrisch Verfahren, das HDL Lipid Peroxid Inhalt (HDLox) 32quantifiziert. Diese Methode basiert auf der Enzym-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Fluorochrom Amplex Red, die (ohne Cholesterin Oxidase) Peroxid Fettgehalt pro mg von HDL-C 32quantifizieren können. Die biochemische Prinzip des Tests ist in Abbildung 1dargestellt. Wir haben gezeigt, dass diese Fluoreszenz basierenden Ansatz nicht die Grenzen der vorherige HDL Funktion Assays27,28. Dieser Assay wurden weiter verfeinert und in unserem Labor standardisiert, so dass es in großem Maßstab Studien am Menschen selbst mit kryokonservierten Plasma 32,33,34, zuverlässig genutzt werden kann 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. das Auslesen dieser Assay ist verbunden mit Anzeigen von validierten zellbasierte Assays, Surrogat Maßnahmen der Herz-Kreislauf-Krankheit, systemische Entzündung, Immun-Dysfunktion und damit verbundene Risiko für Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen Phänotypen 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. hier beschreiben wir diese einfache, aber robuste Methode zur Messung der HDL Peroxid Lipidgehalt (HDLox). Dieser Assay kann als Werkzeug verwendet werden, um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit zu beantworten wo systemische Entzündung, oxidativer Stress und oxidierten Lipide haben eine wichtige Rolle (z.B. Arteriosklerose)32.

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Protokoll

alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik an der Universität von Kalifornien-Los Angeles, Los Angeles und der Alfred Hospital menschliche Ethik-Kommission, Melbourne durchgeführt.

Hinweis: Es gibt viele Variationen der Fluorochrom HDL-Funktion Assay (siehe Diskussion) 32. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll, das die beständigsten und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Eine Übersicht des Tests ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Probe Verarbeitung

  1. Verwendung frischer, nicht hämolysiert Serum (in Serum Separator Rohre gesammelt werden können) oder Citrat-Plasma nach 12-14 Stunden Fasten erhalten. Wenn kryokonservierte Proben verwenden, enthalten entsprechende Steuerung, wie in diesem Protokoll beschrieben.

2. Tag 0-Vorbereitung auf den Test

  1. Prepare arbeiten Layout des Experiments mit den entsprechenden Kontrollen, Proben und repliziert. Führen Sie jede Probe mindestens im Triplicates. Eine Vertreter 96 gut Layout ist in Abbildung 3 dargestellten.
  2. Berechnen alle Bände der Reagenzien, die für den Assay, basierend auf der Anzahl von Mustern und Wiederholungen verwendet werden.
    Hinweis: Enthalten ein zusätzliches Volumen von 10 % in jede Aktie arbeiten, stellen Sie sicher, es gibt genügend Volumen für jedes Reagens für das spezifische Experiment.
  3. Beschriften Sie alle erforderlichen Rohre für alle Stufen des Assays z. B. für die Trennung von HDL, Messung von HDL-C (optional) und die Fluorochromeassay.

3. Tag 1-Vorbereitung von Steuerelementen

  1. Vorbereitung der studienspezifischen gepoolten Kontrolle
    1. Erstellen einer Kontrollprobe von gepoolten Plasma oder Serum alle Studie Proben. Wenn 20 Proben in jede Platte in dreifacher Ausfertigung ausgeführt, kombinieren Sie 10 µL von jeder Probe in ein Steuerelement 200 µL gebündelt. Geben Sie eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor den HDL-C-Wert dieses Steuerelements bestimmen.
      Hinweis: Verwenden Sie dieses gebündelte Steuerelement Assays zu standardisieren und alle möglichen bekannten entfallen (z.B. Art des Matrix-Serum im Vergleich zu Plasma, Frost-Tau-wechseln, Kryokonservierung) und unbekannte Störfaktoren, die experimentelle Variabilität beeinträchtigen 27 , 28.
  2. Vorbereitung der Labor-spezifische Qualitätskontrolle (QCs)
    1. bereiten einen großen Vorrat an HDL in jedem Labor (z. B. HDL von 5 mL Plasma von 10 gesunden Spendern isoliert) und mehrere Aliquote das Tiefgefrieren Lager, Frost-Tau-Wechseln zu minimieren.
    2. Nutzung von mindestens 10 verschiedenen repliziert aus diesem Bestand den Durchschnittswert des HDLox zu bestimmen. Ein akzeptablen Bereich des gemessenen HDLox Werte für jede QC-Probe in jedem Assay enthalten innerhalb ist < 15 % von der Variationskoeffizient der durchschnittlichen Wert.
    3. Geben eine separate Aliquot der gepoolten Kontrolle im klinischen Labor, HDL-C-Wert dieses Steuerelements (z.B. 40 mg/dL) zu bestimmen.
      Hinweis: Eine detaillierte Vorgehensweise wie Blut von Blutbanken verwenden, um diese Steuerelemente erstellen beschrieben 27 , 28 , 32 bislang. Bei Bedarf zusätzliche QCs verwenden (z.B. eine eines gesunden Spenders bekannt, normale HDL-Funktion und einer von einem Spender bekannt, weitgehend abnormale HDL-Funktion haben.
  3. Optimierung von Hintergrundsignal und leere Werte (optional)
    1. um Hintergrund zu minimieren, fügen Sie die entsprechende Menge an Katalase (1-4 U/mL) Inkubation Mittel-und rasch gebildeten H 2 O entfernen 2 durch spontane Luftoxidation der Puffer.
      Hinweis: Da die Werte aus den leeren Brunnen (keine HDL) die Werte der HDL Proben abgezogen wird sind und die Ergebnisse werden berichtet relativ zu einem gepoolten Steuerelement (das in der gleichen 96-well-Platte enthalten ist), fanden wir, dass dieser Schritt nicht praktisch Affec tut t die Ergebnisse. So kann Optimierung der Hintergrundsignal mit Katalase verzichtet werden, wenn erforderlich.

4. Tag 1-Trennung von HDL-Cholesterin HDL Niederschlag mit

Hinweis: verwenden Sie ein handelsübliches standardisierte HDL-Cholesterin auslösenden Reagenz ApoB erschöpft Serum nach Angaben des Herstellers zu isolieren ' s Anweisungen. Diese Reagenzien sind weit verbreitet in farbmetrischen Assays, um HDL-Cholesterin-Werte zu bestimmen.

  1. Plasma oder Serum Probe frisch verwenden (oder Auftauen).
  2. Mix gleiche Volumina (z.B. 80 µL) Plasma und HDL-Cholesterin Fällung Reagenz (20 % w/V Polyethylenglykol in Glycin Puffer bei pH 10,0 (25 ° C)).
  3. Mix gut von oben und unten pipettieren.
  4. Zentrifugieren bei 1000-2000 x g für 10 min.
  5. Aspirieren den überstand (HDL Bruch).
  6. Verwenden Sie isolierte HDL im Idealfall sofort für die Fluorochromeassay der Lipidperoxidation HDL. Jedoch wenn mehrere Proben am selben Tag ausgeführt werden und andere Schritte wie Messung der Konzentration von HDL-Cholesterin sind auch getan, dann die isolierte HDL bei 4 ° C lagern und verwenden Sie es am nächsten Tag für die FluorochromeHDL-Funktion Test.

5. Tag 1-Bestimmung des HDL-C in isolierte HDL

Hinweis: dieser Schritt ist optional, wenn der Wert des HDL-C aus dem klinischen Labor verwendet wird, um HDLox zu normalisieren von HDL-C-Menge.

  1. Quantify das HDL-Cholesterin aus dem Plasma, mit Standard-farbmetrische assays 27. 50 µL Reagenz Cholesterin in jede Vertiefung hinzufügen und bestimmen, Cholesterin-Konzentration mit einer kolorimetrischen Platte-Leser und eine Cholesterin-standard in jedem Kit zur Verfügung gestellt.

6. Tag 2-Vorbereitung der Reagenzien

  1. bereiten HRP und Cholesterin-Lösungen von HRP 5 U/mL Lösung (Bereich 1-10 U/mL).
  2. 20 mM bereiten Fluorochrom (z. B. Amplex Red) Lösungen: ein Fläschchen Fluorochrom Reagenz und DMSO auf Zimmertemperatur auftauen. Vor dem Gebrauch lösen Sie Fluorochrom Reagenz (1 mg) in 200 µL von DMSO auf. Speichern-Stammlösung auf eingefroren ≤-20 ° C, vor Licht geschützt werden.
  3. Bereiten Sie positive und negative Kontrollen: benutzen Sie 1 X ' Reaktion Puffer ' Cholesterin und 20 mM H 2 O 2 arbeiten ohne Lösung als negative und positive Kontrolle bzw..

7. Tag 2-Fluorochrom Assay

  1. hinzufügen 50 µL 1 x Reaktion Puffer als Leerzeichen (Negativkontrolle).
  2. Optional: positiv-Kontrolle in jeder Platte 20 mM Arbeitslösung von H 2 O 2 Agrega.
  3. Experimentelle Variabilität zu minimieren und sicherzustellen, dass Zusatz von Reagenzien und Proben werden konsequent durchgeführt und in einer fristgerechten Weise, führen alle Ergänzungen der Proben in einer separaten 96 gut Rundboden, klar, Polystyrol oder Polypropylen Platte (Platte 1). Verwenden Sie dann eine Mehrkanal-Pipette übertragen bestimmte Volumes in 3 96-Well-Platten (Platten 2-4: Polypropylen, flache BotTom, schwarz) (das haben identische Layout) ( Abbildung 2, Abbildung 3).
    1. Z. B. zunächst 160 µL isolierte HDL in jede gut/Probe der Platte 1 hinzufügen und dann mit dem Einsatz von Mehrkanal-Pipette übertragen 50 µL des HDL-Cholesterins von jeder gut/Probe in der schwarzen 96-Well Platten. Tipps zwischen jeder Zeile/Spalte ändern und verwenden Sie ungefilterte Tipps für alle Transfers.
  4. Proben in den Brunnen zu verlassen. Nicht wegwerfen. Es gibt keine Wäsche-Stufen zwischen Zugabe von Reagenzien.
  5. Fügen Sie 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) in jede Vertiefung.
    Hinweis: Verwenden Sie HRP vor der Zugabe des Reagenz Fluorochrom.
  6. 30 min bei 37 ° c inkubieren Entsorgen Sie Proben nicht nach der Inkubation (keine Wäsche Schritte zwischen Ergänzungen von Reagenzien).
  7. Fügen Sie 50 µL des Fluorochromereagent für eine Endkonzentration von 300 µM. Zu diesem Zeitpunkt insgesamt Reaktionsvolumen beträgt 150 µL. gut mischen und vor Licht schützen.
  8. Bewerten das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) jede Minute mehr als 120 min bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (530/590 nm-Filter).
    Hinweis: Verwenden Sie ein kürzeres 60-Minuten-Intervall mit frische Proben. Wir haben festgestellt, dass 120-Minuten-Test gibt mehr reproduzierbaren Daten mit der Verwendung von kryokonservierten Proben.
  9. Daten, die mittels geeigneter Software.

8. Tag 3-Datenanalyse

  1. Fluoreszenz Einheiten (willkürliche Einheiten) 120 Minuten nach Zugabe von Fluorochrom Reagenz für alle Proben einschließlich leere Brunnen aufnehmen und alle Steuerelemente.
  2. Berechnen Sie den Mittelwert der Fluoreszenz-Einheiten (basierend auf mindestens triplicates) (HDL Ox_sample). Nehmen Sie nicht Ausreißer (> 2 SDs vom Mittelwert) in Betracht.
  3. Subtrahieren die Hintergrundfluoreszenz mithilfe der folgenden Formel:
    figure-protocol-1
  4. Normalisierung für HDL-Cholesterin-Betrag (HDL-C): Normalisierung den HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (einschließlich der gepoolten Kontrolle) von HDL-C) (mg/dl). In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als n (HDL-C) HDLox Maßnahme entsprechend der Einstellung für HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-2
  5. die Expression von HDLox Lipid Peroxidation Wert jeder einzelnen Probe gegen den Wert eines Steuerelements gepoolten zu standardisieren. N (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert für jede Probe (bereinigt um HDL-C) von n (HDL-C) HDLox Lipid Peroxidation Wert des Steuerelements gebündelt zu normalisieren. In dem Abschnitt "Ergebnisse" präsentiert sich HDL Ochsen als nHDL Ochsen Maßnahme entsprechend der Einstellung für experimentelle Variabilität und HDL-C. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-3
    Hinweis: dieser Ansatz ist ähnlich zu anderen etablierten experimentellen Ansätzen, wie experimentelle Variabilität von Messungen zu reduzieren International normalized Ratio (INR) 44 , 45. Dieser Ansatz wurde in klinischen Studien 32 , 33 , 34 , 35 , 36 validiert , 37 , 38 , 39.
  6. Qualitätskontrolle von Versuchsergebnissen mit standard Qualitätskontrolle Proben durchführen. Jedes Labor sollte eigene Qualitätskontrollen (QCs) festlegen. Im Idealfall gibt es einen QC für nHDLox aus einer Stichprobe mit bekannten dysfunktionalen HDL und QC für nHDLox aus einer Stichprobe von gesunden Spendern [z.B. Verwendung gepoolten Probe von jungen Erwachsenen, die etablierten Blutbank Geber und haben keine bekannten Komorbidität und Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich Rauchen]. Die letztere Kontrolle standardisiert Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Die Durchschnittswerte der diese QCs sind etablierte basierend auf mindestens 5 Wiederholungen (in der Regel verwenden wir für diesen wichtigen Schritt 10 Wiederholungen).
    1. Check ob gemessene QCs in jeder Probe haben innerhalb des erwarteten Bereichs der Werte schätzt. Angenommen, eine akzeptable maximale experimentelle Variabilität von 15 %, sollten alle experimentellen Messwerte in 15 % der bekannten durchschnittliche Werte von etablierten QC fallen. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      Hinweis: Wenn entweder die inklusive Qualitätskontrolle Proben ( Normal im Vergleich zu dysfunktionalen HDL) HDLox Werte außerhalb der erwarteten Bereich (gegründet in jedem Labor) gibt, dann wiederholen Sie den Versuch.
  7. Durchführen Qualitätskontrolle der experimentellen Ergebnisse mit den Variationskoeffizienten (CV), um experimentelle Variabilität zu quantifizieren: wiederholen Sie alle Proben mit CV % > 15 %. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-6
    Hinweis: eine typische Intra-Assay (innerhalb der gleichen Platte) und Inter-Assay (unter verschiedenen Platten) experimentelle Variabilität ist < 15 %. 2) ein typisches Intra-Assay-Lebenslauf ist zwischen 1-7 % und eine typische Interassay Lebenslauf zwischen 3-10 ist %.

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Ergebnisse

50 µL jeder HDL-Probe werden in jedem Brunnen wie in Schritt 7.3 hinzugefügt. 50 µL HRP-Lösung 5 U/mL (0,25 U) werden dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,5 hinzugefügt. Proben sind für 30 min bei 37 ° C wie in Schritt 7.6 inkubiert. 50 µL Reagenz Fluorochrom sind dann in jedem Brunnen wie in Schritt 7,7 (Endkonzentration von 300 µM) hinzugefügt. Das fluoreszierende auslesen (im Dunkeln) wird dann jede Minute mehr als 120 Minuten bei 37 ° C mit einem fluoreszierenden Platte-Lesegerät (5...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet ein robustes Werkzeug um wichtige Forschungsfragen bezüglich der Rolle von HDL-Funktion bei Arteriosklerose und menschliche Krankheit zu beantworten. Der Assay quantifiziert den HDL Lipid Peroxid Inhalt pro mg HDL-C enzymatische Verstärkung (HRP). Dieser Ansatz vermeidet bekannte Einschränkungen der vorherige HDL-Funktion-Assays (z. B. Cholesterin-Efflux-Assay) einschließlich erhebliche Heterogenität in Bezug auf Arten der verwendeten Zellen, Art der Anzeige gemeldet, fehlende Stand...

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Offenlegungen

Dieses Protokoll und Test sind relevant für das patent PCT/US2015/018147.

Danksagungen

Die Autoren erkennen dankbar die Arbeit von Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman und Srinivasa Reddy für ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung der früheren Iterationen dieses Modells. T.A.A. wird unterstützt durch eine RMIT University Vice-Chancellor Postdoctoral Fellowship. AJ und AH werden durch NHMRC Projekt Grant 1108792 unterstützt. TK stützt sich auf NIH gewährt NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Experimentelle Reagenzien
HDL PEG (Polyethylenglykol) FällungsreagenzPointe ScientificH7511
Amplex Red Reagenz.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin.
• ≤ – 20°; C & Bulle; Trockenmittel
& Bulle Vor leichtem
DMSO schützen.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin.
• ≤ – 20°; C & Bulle; Trockenmittel
& Bulle Vor leichter
Meerrettichperoxidase (HRP) schützenLifeTechnologies, Grand Island, NYA12216Amplex Rotes Cholesterin-Assay-Kit.
• ≤ – 20°; C & Bulle; Trockenmittel
& Bulle Vor leichter
Cholesterinesterase schützen.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin.
• ≤ – 20°; C & Bulle; Trockenmittel
& Bulle Schutz vor Licht
Cholesterin-ReferenzstandardLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Rotes Cholesterin-Assay-Kit.
• ≤ – 20°; C & Bulle; Trockenmittel
& Bulle Schutz vor Licht
Resorufin-Fluoreszenz-ReferenzstandardLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤ – 20°; C & Bulle; Trockenmittel
& Bulle Vor Licht schützen
5x Reaktionspuffer.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Assay-Kit für rotes Cholesterin.
• ≤ – 20°; C & Bulle; Trockenmittel
& Bulle Vor Licht schützen
HDL-Cholesterin Automatisiertes ReagenzThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.TR39601
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Plasticware
96-Well-Platten (Polypropylen, flacher Boden, klar).Sigma AldrichM0687
96-Well-Platten (Polypropylen, flacher Boden, schwarz).Sigma AldrichM9936
1,5 mL Eppendorf RöhrchenEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, sterilThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.14-488-058
Thermo Scientific Mehrkanalpipetten, 8 Kanäle, 125 ThermoFisher Scientific Co., San Jose, Kalifornien, USA.  14-387--955<
strong>NameCompanyKatalognummer<strong>Kommentare<
strong>Software
Gen5 2.01 SoftwareBiotek, Vermont, USANA
strong>Name CompanyKatalognummerKommentare
Ausrüstung
Gen5 PlattenleserBiotek, Vermont, USANA
<

Referenzen

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