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Methodenartikel

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

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DOI:

10.3791/56332

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12. März 2018

 , 
1Pediatric Oncology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2BC Cancer Agency, Provincial Health Services Authority, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Zusammenfassung

Pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) ist ein ex-Vivo Lunge Explant und geschlossenen Zellkultursystem, die es Forschern erlaubt, die Biologie der Lunge Besiedlung in Osteosarkom (OS) durch Fluoreszenz-Mikroskopie zu studieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung des Protokolls und erläutert, Beispiele von Bilddaten auf metastasiertem Wachstum mit Weitfeld oder konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen zu erhalten. Die Flexibilität des Modells PuMA erlaubt Forschern, nicht nur das Wachstum von OS-Zellen in der Lunge Mikroumgebung zu studieren, sondern auch die Auswirkungen der anti-metastatischen Therapeutika im Zeitverlauf zu beurteilen. Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine noch nie da gewesenen, hochauflösende Bildgebung von OS-Zell-Interaktionen mit dem Lungenparenchym. Darüber hinaus Wenn das PuMA-Modell mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierende Protein genetische Reporter kombiniert wird, können Forscher die Lunge Mikroumgebung, zellulärer und subzellulärer Strukturen und Genfunktion Promotoraktivität in metastasierenden OS Zellen untersuchen. Das PuMA-Modell bietet ein neues Tool für Osteosarkom-Forscher entdecken neue Metastasen Biologie und die Aktivität der neuartigen anti-metastatischen, gezielte Therapien zu bewerten.

Einleitung

Bessere Ergebnisse für pädiatrische Patienten mit metastasierendem Osteosarkom (OS) bleibt noch ein kritischer ungedeckten klinischen Bedarf 1. Dies unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung neuer molekular zielgerichtete Therapien. Herkömmliche Chemotherapeutika, die Ziel-Tumor-Zell-Proliferation haben nicht als wirksam erwiesen bei der Behandlung von Metastasen und damit neue Strategien muss der metastatischen Prozess selbst 2ausgerichtet. Der aktuelle Artikel beschreibt die praktischen Aspekte der eine relativ neue Art von ex Vivo Lunge Metastasen Modell, entwickelt von Mendoza und Kollegen3, wonach ein nützliches Werkzeug bei der Entdeckung neuer pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) molekularen Treiber in der Lunge Metastasen Progression in OS 4,5. Bevor Sie fortfahren, es wäre klug, kurz auf einige aktuelle Modelle von Metastasen zu berühren, und wie das PuMA-Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Tests.

Die meisten experimentelle Modellen genutzt, um Metastasen zu untersuchen umfassen in Vitro und in Vivo -Systeme, die entweder einem bestimmten Schritt oder mehrere Stufen der metastatischen Kaskade zu rekapitulieren. Diese Schritte umfassen: (1) die Migration vom Primärtumor, 2) Intravasation in nahe gelegenen Gefäße (Blut- oder Lymphgefäße) und Transitländern im Umlauf, Tumorzellen (3) verhaften am sekundären Standort, 4) Extravasation und Überleben am sekundären Standort, Bildung (5) Fixierungsprotokoll, und 6) Wachstum in vaskularisierte Metastasen (Abbildung 1). In-vitro- Modelle von Metastasen können 2-dimensionale (2D) Migration und 3-dimensionale (3D) Matrigel Invasion Assays, die in überprüft werden ausführlich an anderer Stelle 6. Für in-Vivo -Modelle, die zwei häufig verwendete Modellsysteme umfassen: 1) das spontane Metastasierung Modell ist wo ein Tumor-Zellen sind Orthotopically, die in einem bestimmten Gewebetyp einen lokalen Tumor bilden, die spontan metastasierende Zellen wirft injiziert an entfernten Standorten; (2) die experimentelle Metastasierung Modell ist wo Tumorzellen in das Blutgefäß stromaufwärts von dem Zielorgan injiziert werden. Zum Beispiel eine Rute Vene Injektion von Tumor-Zellen-Ergebnisse in der Entwicklung Lunge Metastasen5,7,8. Andere experimentelle Metastasen-Modelle verfügen über Injektion von Tumorzellen in die Milz oder mesenterialen Vene führt zu die Entwicklung von Lebermetastasen9,10. Praktische Erwägungen dieser in-Vivo -Modelle werden von Welch 11ausführlich erörtert. Ein weiteres in-Vivo -Modell zur Untersuchung von Metastasen in den pädiatrischen Sarkome ist der Nieren Nieren subkapsuläre Tumor Implantation Modell ergibt sich lokale Tumorbildung und spontane Metastasen in der Lunge 12,13. Eine technisch anspruchsvolle Technik wie intravitalen Videomicroscopy können direkt sichtbar zu machen, in Echtzeit, Wechselwirkungen zwischen metastatischen Krebszellen und den Microvasculature einer metastatischen Website (dh. Lunge oder Leber) wie beschrieben von MacDonald14 und Entenberg15oder Krebs Zelle Extravasation in der chorioallantoic Membrane wie beschrieben durch Kim 16.

Das PuMA-Modell ist ein ex-Vivo, Lunge Gewebe Explant, geschlossenes Kultursystem wo kann das Wachstum von Tumorzellen fluoreszierende längs über Fluoreszenz-Mikroskopie über einen Zeitraum von einem Monat beobachtet werden (siehe Abb. 2A). Dieses Modell rekapituliert die Anfangsphase der Lunge Kolonisation (Schritte 3-5) in der metastasierten Kaskade. Einige große Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Modellen des Modells PuMA sind: 1) Es bietet die Möglichkeit, metastasiertem Krebs Zelle Wachstum in einem 3D Mikroumgebung längs zu messen, die viele Funktionen der Lunge Mikroumgebung behält Vivo 3; (2) PuMA ermöglicht den Forscher zu beurteilen, ob der Zuschlag einer Kandidaten-gen oder Drogenmissbrauch Behandlung Anti-metastatischen Aktivitäten im Zusammenhang mit einem 3D Lunge Mikroumgebung hat; (3) das PuMA-Modell sind flexibel mit vielen Arten von Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen (Abbildung 2 b) wie Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie oder konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, Beispiele für jede Abbildung 2 & Dzeigt, bzw.. Dieser Artikel wird erläutert, wie mithilfe der PuMA-Modell um längs Bilddaten auf metastasiertem Wachstum der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (eGFP) zu erhalten-mit dem Ausdruck, menschliche Ebbe und metastasierendem Osteosarkom Zellen (MNNG und HOS Zellen) mit niedrig-Vergrößerung Weitfeld Fluoreszenz. Beispiele für imaging ein Fluoreszenzfarbstoff, der Lungenparenchyms Etiketten und ein rot-fluoreszierende Protein, die genetische Reporter der Mitochondrien in OS Etiketten im PuMA Modell konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit Zellen werden ebenfalls besprochen.

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Protokoll

Alle tierischen Protokolle aus denen Bilddaten stammen wurden mit Genehmigung der Animal Care und Use Committee des National Cancer Institute, National Institutes of Health durchgeführt. Alle tierischen Protokolle diskutiert und dargestellt in dem Artikel video wurden von der University of British Columbia Animal Care Ausschuss genehmigt.

1. Vorbereitung der Tumorzellen für Einspritzung und Materialien für das PuMA-Modell

Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Medien-Rezepte finden Sie in Tabelle 1 und Tabelle 2.

  1. Wärmen Sie 5 mL A-Media in einem 15 mL konische Rohr in ein Wasserbad 37 oC vor.
  2. Die 1,2 % niedrig schmelzende Agarose Lösung (in sterilem Wasser) unter Verwendung der Lab-Mikrowelle zu schmelzen.
  3. 5 mL flüssige Agarose in ein 15 mL konische Röhrchen zu übertragen, und in einem 37 oC Wasserbad warm halten. Sicherstellen Sie, dass die geschmolzene Agarose 37 oC und Flüssigkeit vor der Lunge Insufflation Schritt ist.
  4. Pre-chill 30 mL der Zellkultur Klasse PBS mit 1 X Pen/Strep in einem Eiskübel ergänzt.
  5. Pre-Einweichen Sie in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte einen Gelatine-Schwamm in 1,5 mL B-Medien. Der Schwamm wird der Support für Anker für die Lunge-Scheiben sein.
  6. Sicherzustellen, dass die OS-Zellen sind etwa 70-90 % konfluierende am Tag des Verfahrens. Verwenden Sie keine Zellen, die übermäßige Zusammenfluss oder wenn das Medium Orange ist bis gelb, da die Zellen in der Regel betont sind und haben zu diesem Zeitpunkt Lebensfähigkeit vermindert. Für das Osteosarkom-Zell-Linien, MNNG und HOS, wird 5 x 105 in einem Volumen von 100 μl zu injizieren in die Vene Tail 1 Maus verwendet werden. Gehobene entsprechend, wenn mehr Mäuse für die Studie verwendet werden.
  7. Ernten Sie die Tumorzellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (3 mL für ein T75-Fläschchen oder 2 mL in einer Kulturschale 10 cm). Wenn Zellen beginnen die Platte abheben, neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA mit kompletten Medien. Spin-down Zellen und einmal mit Zellkultur Grade PBS abspülen. Aufschwemmen Sie Pellet in 5 mL PBS.
  8. Führen Sie eine Zellzahl von Standardmethoden. Es ist am besten, um mehr Zellsuspension als was tatsächlich benötigt wird, da Verlust der Zellsuspension oft während der Nadel erarbeiten tritt und Injektion Versuche scheiterten.
  9. Führen Sie einen Trypan blau-Ausschluss-Assay auf einer Stichprobe von der Zellsuspension auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen. Gehen Sie nur dann, wenn die Zelle 90 % Rentabilität zeigen oder höher.
  10. 5 x 105 Zellen in einem Volumen von 100 μl zu injizieren. Um ein Übermaß an 2 X dieses Betrags vorzubereiten, sollte 1 x 106 Zellen nach unten gedreht und Nukleinsäuretablette in 0,2 mL HBSS.
  11. Stelle die Zellsuspension in einem Eiskübel während du die Mäuse für die Injektion.

(2) tail Vene Einspritzen und Lunge Insufflation

Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen in diesem Abschnitt werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Eine Liste von Geräten, Materialien und chirurgische Instrumente verwendet, die in den folgenden Schritten finden Sie in Tabelle 3 und Tabelle 4.

  1. Wärmen Sie eine weibliche Maus (Alter 6-8 Wochen) unter eine Wärmelampe für 5 min um ihre Rute Vene deutlicher ersichtlich zu machen. Verwenden Sie für murine K7M2 oder K12 Zellen Balb/c Mäuse. Verwenden Sie für menschliche MG63.3, MG63, MNNG und HOS Zellen Severe Combined Immunodeficiency Mäuse.
  2. Sicherstellen Sie, dass die Zellsuspension einheitlich ist, durch das Rohr vorsichtig schütteln. Erarbeiten Sie sorgfältig die Zellsuspension in 1 mL Spritze ohne Nadel. Kappe der Spritze mit einer 27 gauge Nadel. Stellen Sie sicher, dass die Nadel Abschrägung auf der gleichen Seite wie die Volumen-Markierungen auf der Nadel ist.
  3. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Restrainer, und wischen Sie die Rute mit einem Alkohol abwischen.
  4. Gehen Sie zum Durchführen einer Rute Vene Injektion und injizieren die 100 μL der Zellsuspension. 5 min nach der Injektion, platzieren Sie den Mauszeiger in einer CO-2 -Kammer und der Euthanasie Standardarbeitsanweisung (als Umriss Ihres institutionellen Tierpflege-Ausschusses) beginnen. Zervikale Dislokation sollte nicht als Mittel zur Sterbehilfe verwendet werden, da das Verfahren die Luftröhre beschädigt wird.
  5. Sobald die Maus eingeschläfert ist, beginnen Sie die Vorbereitung der Laminar-Flow-Haube für Insufflation der Maus-Lunge mit der Agarose/A-Media-Lösung. Innerhalb der Laminar-Flow-Haube einen Arbeitsbereich mit Ihrem sterilen Pad eingerichtet. Auf diese Unterlage platzieren Sie Ihre sterilisierte Instrumente, IV Katheter IV Erweiterungssatz und Schwerkraft Perfusion Apparat (siehe ergänzende Abbildung1).
  6. Platzieren Sie den Mauszeiger im dorsalen Recumbancy. Sezieren Sie mit sterilen kleine Schere sorgfältig aus dem Brustbein, die Brusthöhle verfügbar zu machen. Achten Sie darauf, nicht die Lunge punktieren, da eine Agarose/A-Media-Lösung verwendet wird, um die Lunge zu insufflieren.
  7. Wenn aus dem Brustbein zu sezieren, zerlegen Sie vorbei an den thorakalen Einlass auf beiden Seiten der Luftröhre. Setzen Sie die Luftröhre durch sezieren entfernt das umliegende Weichgewebe.
  8. Cannulate der Luftröhre mit einem 20 Gauge-IV-Katheter. Verknoten Sie locker chirurgische Verwendung steril Darmsaite Naht um die kanülierte Luftröhre.
  9. Legen Sie ein IV Erweiterungssatz von katheterisiert Luftröhre zu 10 mL Spritze der Schwerkraft Perfusion Vorrichtung.
  10. Kombinieren Sie die vorgewärmte 37 oC Agarose (5 mL) und A-Media (5 mL) in ein 1:1-Gemisch. Gießen Sie die flüssige Agarose/A-Media-Lösung in 10 mL Spritze von der Schwerkraft Perfusion Gerät. Sicherzustellen Sie vor Insufflation der Lungen mit Agarose/A-Media-Lösung, dass die gesamte Länge der Erweiterungssatz mit Agarose/A-Media, damit unbeabsichtigte Insufflation von Proben der Lunge mit Luft zu negieren grundiert worden ist.
  11. Füllen Sie die Lunge die Agarose/A-Media-Lösung, bis die Lunge voll insuffliert wird.
  12. Sobald die Lunge voll insuffliert, entfernen der Kanüle und fest binden Sie den chirurgischen Knoten Auslaufen der Agarase/A-Media-Lösung durch die Luftröhre zu verhindern.
  13. Fahren Sie mit der zupfen (Luftröhre, Herz und Lunge) aus der Brusthöhle zu sezieren. Achten Sie darauf, keine Punktion oder die Oberfläche der Lunge schädigen.
  14. Ort der zupfen (in keine bestimmte Ausrichtung) in die vorgekühlt 30 mL PBS mit 1 X Pen/Strep ergänzt und ermöglichen die Agarose/A-Media für 20 min zu festigen.
  15. Verwendung von feinen Scheren und Pinzetten, Schneide kleine Stücke der Lunge (3 x 1,5 mm), wie in Figur 1Agezeigt. Kleinere Lunge Scheiben können leicht mit einem 2,5 X Objektiv abgebildet werden. Mehrere Scheiben ist in der Regel 4 bis 10 Scheiben pro Gruppe pro Versuchsbedingung, kürzbar.
    Hinweis: Für jede Versuchsgruppe, legen Sie die Lunge Scheiben in einen separaten Brunnen (6-Well-Platte) mit einem 2 x 2 cm Gelatine Schwamm eingeweicht in B-Medien. Die Anzahl der Medien pro Bohrloch sollte 1,5 mL betragen. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Für Medikamentenstudien ist die Häufigkeit der Wechsel der Medien/Droge Benutzer bestimmt.

(3) Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung Lung Slices und Analyse

Hinweis: Für Weitfeld Fluoreszenz sind bildgebende, kleinere Scheiben (3 x 1,5 x 1 mm) geschnitten um die Lunge Abschnitt in 1 Bild mit einem 2,5 X Objektiv passen.

Bildaufnahme auf dem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop:

  1. Lunge-Scheiben werden in der Regel bei 0, 3, 7 und 14 Tage nach der Injektion abgebildet. In der sterilen Umgebung des biologischen Kabinetts sorgfältig übertragen die Lunge Scheiben aus der Gelatine Runde Schwämme zu einem sterilen 35 mm Glasboden Schale. Achten Sie darauf, aus die überschüssige Flüssigkeit aus der Lunge Slice Tupfen, da die überschüssige Flüssigkeit als ein Spiegel fungiert und fluoreszierendes Licht aus der Tumorzellen zu reflektieren.
  2. Ordnen Sie die Lunge Scheiben in ähnlicher Weise dargestellt in Abbildung 1A. Jede Spalte würde eine andere experimentelle Erkrankung darstellen. Achten Sie darauf, nicht Kreuz-die Lungen mit der Pinzette verunreinigen. Mit 70 % Ethanol spülen und trocknen vor dem Umgang mit Lunge Scheiben aus einer anderen experimentellen Gruppe.
  3. Optimieren der bildgebenden Parameter (dh. Gain, Offset, Belichtung Zeit, binning), bietet den besten Kontrast zwischen der fluoreszierenden Tumorzellen und Hintergrund Lungengewebe im Steuerelement (Fahrzeug unbehandelt) Gruppe. Verwenden Sie die gleichen Parameter aus der Kontrollgruppe zu die experimentellen Gruppen Bild. Speichern Sie als TIFF-Bildformat.
  4. Zu Referenzzwecken eine Skala nehmen Sie ein digitales Foto von einem Mikrometer auf das gleiche Ziel.
  5. Da Lunge Auto-Fluoreszenz im Laufe der Zeit ändert, müssen die bildgebenden Parameter jeder bildgebenden Sitzung zu den Lungen Kontrolle angepasst werden. Die bildgebende Parameter für eine Sitzung unbedingt nicht optimal für nachfolgende bildgebende Sitzungen.

Bildanalyse:
Hinweis: Die folgenden Bild-Bearbeitungsschritte erfolgen mit ImageJ 1,51 h Software Paket 17.

  1. Öffnen Sie eine Bilddatei in ImageJ (Abb. 3A).
  2. Subtrahieren Sie Hintergrund: Prozess > subtrahieren Hintergrund > Rolling Ball Radius (Start mit 50 Pixel), deaktivieren Sie die Option "Licht Hintergrund" (Abb. 3 b).
  3. Bild 8-Bit-Format zu konvertieren: Bild > Art > 8 - Bit (Abbildung 3).
  4. Einheiten auf Pixel festgelegt: Bild > Enter "Pixel" Längeneinheit, geben Sie 1 in "Pixelbreite", "Pixelhöhe", "Voxel Tiefe". Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Global" auf nachfolgende Bilder anwenden.
  5. Mit dem Polygon-Auswahl-Werkzeug, skizzieren Sie die Form des gesamten Lung Slices und ermitteln Sie Bereich (Pixel2) des gesamten Lunge Slice. Dieser Wert wird verwendet werden, um die prozentuale Tumorlast der Lunge zu berechnen.
  6. Schwelle Bild: Bild > anpassen > Schwellenwert > Markieren Sie "Standard" und "B & W" > verwenden Sie den Schieberegler Schwelle das Bild so, dass die Mehrheit der Tumorzellen genau hervorgehoben werden. "Apply" drücken führt zu einer schwarz / weiß Bild, wo die Lunge ist ganz schwarz, und die fluoreszierenden Läsionen sind weiß (Abbildung 3D). Ein zweites Drücken der "Übernehmen" wird das Bild invertieren, wo alle fluoreszierende Strukturen jetzt schwarze Formen (Abbildung 3E sind).
  7. Quantifizierung von der Anzahl und Form der Läsionen:
    Analysieren > Messungen festlegen > "Area" zu überprüfen. Deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen.
    Analysieren Sie Partikel > Größe (Pixel2): 0-unendlich repräsentiert den Bereich der Formen, die ImageJ auflisten wird. Bestimmen Sie empirisch die kleinste Läsion, die als eine einzelne Tumorzelle in Tag 0 Fahrzeugbilder gilt. Verwenden Sie den Bereich von diesem einzelnen Tumorzelle als untere Grenze für die restlichen Bilder im Dataset. Für die Arbeit in diesem Papier präsentiert ist 11 Pixel2 als untere Grenze festgelegt. Für die Arbeit in der video-Beispiel vorgestellt ist 24 Pixel2 als untere Grenze festgelegt. Lassen Sie "Rundheit" Palette als 0-1. "Show" auf eingestellt werden "Nichts". Alternativ, wenn "Show" und "Umrisse" ausgewählt ist, wird eine Zeichnung von allen Formkonturen generiert. Suchen Sie ein separates Fenster Messungen Pop-up "Ergebnisse anzeigen". Optional sparen mit "Add to Manager" Kontrollkästchen aktiviert alle Shapes, die quantifiziert mit einem ROI-Manager, die für die spätere Verwendung gespeichert werden können. Nach dem "OK" drücken, erscheint ein Fenster "Ergebnisse" mit allen aufgezählten Formen und Flächenmaße (Abbildung 3F).
  8. Kopieren und Einfügen der Daten aus dem Fenster "Ergebnisse" in eine Tabellenkalkulation. Verwenden Sie die mathematische Summe-Funktion in Excel fassen wir alle Bereiche der metastatischen Läsionen für diesen bestimmten Lunge-Slice. Um die Tumorlast Prozent Lunge Lunge Slice zu bewerten, teilen Sie die Summe der Flächen der metastatischen Läsionen durch die Gesamtfläche des Lung Slices. Dieser Parameter ist auch bekannt als Bereich Bruchteil (einA) die beschrieben wird durch Underwood 18weiter.
    Lunge Tumorlast = Summe der metastatischen Läsion Bereiche/Gesamt Fläche von Lung Slice
  9. Berechnen Sie die Lunge Tumorlast für den Rest der Lunge Abschnitte in Kontrollgruppe und verbleibenden Gruppen. Zeichnen Sie die durchschnittliche Lunge Tumorlast pro Gruppe in 0, 3, 7 und 14 Tagen. Vertreter Weitfeld fluoreszierende Bilder hoch und niedrig metastasierendem menschlicher OS Zellen wachsen in das PuMA-Modell zu progressive Zeitpunkten werden (Abb. 4A) angezeigt. Ein Liniendiagramm zeigt die Falte-Änderung (normiert auf Tag 0) in Prozent metastasierendem Tumorlast im Laufe der Zeit ist (Abbildung 4 b) gezeigt.

4. konfokale Fluoreszenz-Bildgebung des PuMA-Modells

Hinweis: Für die konfokale Bildgebung ist Gewebe Verarbeitung ähnlich wie im vorherigen Abschnitt außer dass größere Lunge Scheiben (komplette Querschnitte, 1-2 mm dick) geschnitten werden, um für mehr ROIs, abgebildet werden können.

Kennzeichnung des Lungenparenchyms mit DAR4M:

  1. Tauchen Sie Lunge Scheiben in 10 μμM DAR4M (in HBSS) für 45 min bei 37 ° C. DAR4M Etiketten reaktivem Stickstoff-Spezies innerhalb der Zellen der Lunge.
  2. Spülen Sie nach 45 min Inkubation die Lunge Scheiben mit frischen HBSS.
  3. Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.
  4. Die bildgebende Parameter für die Beispielbilder, die in Abbildung 5 dargestellten sind in Tabelle 5aufgeführt.
  5. Erwerben Sie einen Z-Stapel für eine Region von Interesse. Verwenden Sie die empfohlene Z Scheibendicke für Nyquist Sampling. In Movie 1 und ergänzende Film 1kostenfrei ein repräsentativen Film eines 3D Stacks zeigt grüne fluoreszierende OS Zellen im Lungengewebe DAR4M beschriftet.

Für die konfokale Beispielbilder in Abbildung 5gezeigt war die bildgebende Session terminal. Wenn längs Bildgebung erforderlich ist, wird die Verwendung eines 2-Photonen oder Multi-Photonen ausgestattete konfokale LSM Mikroskops für die Bildgebung empfohlen, da gibt es weniger lichtbedingten lebenden Gewebe19,20.
Bildgebung Mito-RFP mit dem Ausdruck ihrer MG63 Zellen in das PuMA-Modell:

  1. Führen Sie das PuMA-Protokoll als Gliederung in Schritt 1 und 2 mit MG63 Zellen mit dem Ausdruck der Mito-RFP-Konstrukt.
  2. Legen Sie die Lunge Scheibe in einem 35 mm-Glasboden Runde Schüssel und Bild auf das konfokale Mikroskop.
  3. Die bildgebende Parameter für die in Abbildung 6 gezeigten Beispielbilder sind in Tabelle 6aufgeführt. Einen repräsentativen Film eines 3D Stacks grüne fluoreszierende OS Zellen mit rot fluoreszierende Mitochondrien erfolgt in Movie 2 und zusätzliche Movie 2zeigen.

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Ergebnisse

Low-Vergrößerung Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie

Für Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie von PuMA Lung Slices sind repräsentative Bilder und Quantifizierung Daten in Abbildung 2und Abbildung 4A und Bdargestellt. Die metastatischen Neigungen für hohe und niedrige metastasierendem Zelllinien sind über progressive Zeitpunkten visuel...

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Diskussion

Die folgende technischen Artikel beschreibt einige praktische Aspekte des Modells bei der Untersuchung der Lunge Kolonisation in OS PuMA. Im folgenden: einige wichtige Schritte in das Protokoll, wo Forscher besonders vorsichtig nehmen sollte

(a) Kanülierung der Luftröhre. Die Luftröhre kann leicht beschädigt werden, während sie sezieren die umliegenden Muskeln und Bindegewebe. Darüber hinaus kann die Nadel des Katheters leicht durch die Luftröhre gedrückt werden. Achten Sie besonders auf wie d...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten danken Dr. Arnulfo Mendoza in der PuMA-Technik geschult. Darüber hinaus möchten wir DRS. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) und Sam Aparicio (BC Cancer Agency) für die Nutzung von ihren Mikroskopen im Laufe dieser Studie anerkennen. Diese Forschung wurde von Intramural Research Program des National Institutes of Health, Center for Cancer Research, Pädiatrische Onkologie-Zweig (teilweise) unterstützt. M.M.L. vom nationalen Instituten der Gesundheit intramuralen Besuch Fellow Programm (Award 15335) unterstützt wurde und wird derzeit von einem Joan-Parker-Stipendium in Metastasen Forschung unterstützt. P.H.S. wird von der British Columbia Cancer Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tabelle 2
Zellkulturreagenzien für A-Medien, B-Medien und vollständige Medien
MNNG-HOSATCCCRL-1547hochmetastasierte OS-Zelllinie
HOSATCCCRL-1543schwach metastasierte OS-Zelllinie
MG63.3Amy LeBlanc Laboratory (NCI)N/Ahochmetastasierte OS-Zelllinie
MG63ATCCCRL-1427schwach metastasierte OS-Zelllinie
10X M199 MedienThermofisher11825015Basismedien für A-Medien und B-Medien
Destilliertes Wasser (sterilisiert)Thermofisher15230-147Komponente von A-Medien & B-Medien
7,5% Natriumbicarbonat LösungThermofisher25080094Bestandteil von A-Medien & B-Medien
HydrocortisonSigma-AlrichH6909Komponente von A-Medien & B-Medien
Retinolacetat-wasserlöslichSigma-AlrichR0635-5MGKomponente von A-Medien & B-Medien
Penicillin/Streptomycin 10X konzentrierte (10000 U/ml) LösungThermofisher15140122Komponente von A-Medien & B-Medien, komplette Medien.
Rinderinsulinlösung (10mg/ml)Sigma-AlrichI0516-5MLBestandteil von A-Medien & B-Medien
DMEM, Thermofisher mit hohem Glukosegehalt11965092Basismedien des Gesamtmediums
L-Glutamin (200 mM)Thermofisher25030081Bestandteil des Gesamtmediums
Fötales RinderserumThermofisher16000044Bestandteil des Gesamtmediums
Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermofisher14190144Wird in Zellkulturen verwendet.
Hank' s Gepufferte Salzlösung, kein Kalzium, kein Magnesium, kein PhenolrotThermofisher14175095Wird verwendet, um Zellpellets vor der Injektion zu resuspendieren
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotThermofisher25200114Wird in Zellkulturen verwendet.
DAR4MEnzoALX-620-069-M001Zur Markierung von Lungenparenchym.
NameUnternehmenKatalognummer>
Tabelle 3
Materialien für PuMA
Zeiss 710 konfokal LSMZeissN/AUpright LSM konfokal Mikroskop
Zeiss 780 Konfokales LSMZeissN/AInverses LSM Konfokalmikroskop
SCID MäuseCharles RiverN/ANOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, weiblich, Alter 6-8 Wochen
GelFoamHarvard Apparatus59-9863Wird als Stütze für Lungengewebeschnitte verwendet.
SeaPlaque AgaroseLonza50100Wird bei der Insufflation der Lunge angewendet.
1 ml Spritze mit 27 Gauge NadelFisherscientific14-826-87Zur Injektion von Schwanzvenen.
10 ml SpritzeBD309604Zur Insufflation der Lunge.
20-Gauge-KatheterTerumoSR-OX2032CAWird bei der Insufflation der Lunge verwendet.
Abbott IV Verlängerungsset (30", steril)Medisca8342Zur Anwendung bei der Insufflation der Lunge.
AlkoholtupferBD326895Zum Abwischen der Schwanzvene vor der Injektion
Sterile OP-HandschuheFisherscientificVariiert je nach GrößeAskeptischer Umgang mit der Lunge von Mäusen
30 cmLineal KlammernWird zur Insufflation der Lunge verwendet.
Stützständer für LinealPipette.comHS29022AWird zur Insufflation der Lunge verwendet.
35 mm Kulturschale mit GlasbodenIbidi81158Wird bei der Bildgebung von Lungenschnitten verwendet
Saugfähige Unterlagen mit wasserdichter FeuchtigkeitsbarriereVWR56617-014Wird verwendet, um den sterilen Arbeitsbereich in der biologischen Haube auszukleiden.
Catgut Plain Resorbierbares NahtmaterialBraunN/AWird zum Abbinden von kanülierter Luftröhre verwendet.
NameUnternehmenKatalognummerstrong>Kommentare
Tabelle 4
Chirurgische Instrumente für PuMA
Micro Präparierschere 3,5" Gerade scharf/scharfRobozRS-5910Zum Schneiden von Lungenabschnitten
4" (10 cm) Lang, gezahnt, gerade, extra zart, 0,5 mm SpitzeRobozRS-5132Zum Manipulieren/Halten von Lungenabschnitten.
4" (10 cm) Lange gezackte leichte Kurve 0,8 mm SpitzeRobozRS5135Zum Manipulieren/Halten von Lungenabschnitten.
Daumen-Verbandzange; Gezahnt; Delikat; 4,5" Länge; 1,3 mm SpitzenbreiteRobozRS-8120Für die allgemeine Dissektion.
Daumen-Abrichtzange 4,5" gezahnt 2,2 mm SpitzenbreiteRobozRS-8100Für die allgemeine Dissektion.
Extra feine Mikro-Präparierschere 3,5" Gerade Scharf/Scharf, 20mm KlingeRobozRS-5880Für das allgemeine Präparieren.
Knapp Schere; Gerade; Scharf-stumpf; 27 mm Klingenlänge; 4" GesamtlängeRobozRS-5960Für die allgemeine Dissektion.
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Referenzen

  1. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
  2. Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
  3. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  4. Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
  5. Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
  6. Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
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