Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Summary

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Abstract

Pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) ist ein ex-Vivo Lunge Explant und geschlossenen Zellkultursystem, die es Forschern erlaubt, die Biologie der Lunge Besiedlung in Osteosarkom (OS) durch Fluoreszenz-Mikroskopie zu studieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung des Protokolls und erläutert, Beispiele von Bilddaten auf metastasiertem Wachstum mit Weitfeld oder konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen zu erhalten. Die Flexibilität des Modells PuMA erlaubt Forschern, nicht nur das Wachstum von OS-Zellen in der Lunge Mikroumgebung zu studieren, sondern auch die Auswirkungen der anti-metastatischen Therapeutika im Zeitverlauf zu beurteilen. Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine noch nie da gewesenen, hochauflösende Bildgebung von OS-Zell-Interaktionen mit dem Lungenparenchym. Darüber hinaus Wenn das PuMA-Modell mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierende Protein genetische Reporter kombiniert wird, können Forscher die Lunge Mikroumgebung, zellulärer und subzellulärer Strukturen und Genfunktion Promotoraktivität in metastasierenden OS Zellen untersuchen. Das PuMA-Modell bietet ein neues Tool für Osteosarkom-Forscher entdecken neue Metastasen Biologie und die Aktivität der neuartigen anti-metastatischen, gezielte Therapien zu bewerten.

Introduction

Bessere Ergebnisse für pädiatrische Patienten mit metastasierendem Osteosarkom (OS) bleibt noch ein kritischer ungedeckten klinischen Bedarf ¹. Dies unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung neuer molekular zielgerichtete Therapien. Herkömmliche Chemotherapeutika, die Ziel-Tumor-Zell-Proliferation haben nicht als wirksam erwiesen bei der Behandlung von Metastasen und damit neue Strategien muss der metastatischen Prozess selbst ²ausgerichtet. Der aktuelle Artikel beschreibt die praktischen Aspekte der eine relativ neue Art von ex Vivo Lunge Metastasen Modell, entwickelt von Mendoza und Kollegen

Protocol

Alle tierischen Protokolle aus denen Bilddaten stammen wurden mit Genehmigung der Animal Care und Use Committee des National Cancer Institute, National Institutes of Health durchgeführt. Alle tierischen Protokolle diskutiert und dargestellt in dem Artikel video wurden von der University of British Columbia Animal Care Ausschuss genehmigt.

1. Vorbereitung der Tumorzellen für Einspritzung und Materialien für das PuMA-Modell

Hinweis: Die Menge der Lösungen und Zellen werden genug für 1 Maus. Skalieren Sie nach Bedarf, wenn mehr Mäuse in der Studie verwendet werden. Medien-Rezepte finden Sie in Tabelle 1

Results

Low-Vergrößerung Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie

Für Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie von PuMA Lung Slices sind repräsentative Bilder und Quantifizierung Daten in Abbildung 2und Abbildung 4A und Bdargestellt. Die metastatischen Neigungen für hohe und niedrige metastasierendem Zelllinien sind über progressive Zeitpunkten visuel.......

Discussion

Die folgende technischen Artikel beschreibt einige praktische Aspekte des Modells bei der Untersuchung der Lunge Kolonisation in OS PuMA. Im folgenden: einige wichtige Schritte in das Protokoll, wo Forscher besonders vorsichtig nehmen sollte

(a) Kanülierung der Luftröhre. Die Luftröhre kann leicht beschädigt werden, während sie sezieren die umliegenden Muskeln und Bindegewebe. Darüber hinaus kann die Nadel des Katheters leicht durch die Luftröhre gedrückt werden. Achten Sie besonders auf wie d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabelle 2
Zellkulturreagenzien für A-Medien, B-Medien und vollständige Medien
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	hochmetastasierte OS-Zelllinie
HOS	ATCC	CRL-1543	schwach metastasierte OS-Zelllinie
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)	N/A	hochmetastasierte OS-Zelllinie
MG63	ATCC	CRL-1427	schwach metastasierte OS-Zelllinie
10X M199 Medien	Thermofisher	11825015	Basismedien für A-Medien und B-Medien
Destilliertes Wasser (sterilisiert)	Thermofisher	15230-147	Komponente von A-Medien & B-Medien
7,5% Natriumbicarbonat Lösung	Thermofisher	25080094	Bestandteil von A-Medien & B-Medien
Hydrocortison	Sigma-Alrich	H6909	Komponente von A-Medien & B-Medien
Retinolacetat-wasserlöslich	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Komponente von A-Medien & B-Medien
Penicillin/Streptomycin 10X konzentrierte (10000 U/ml) Lösung	Thermofisher	15140122	Komponente von A-Medien & B-Medien, komplette Medien.
Rinderinsulinlösung (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Bestandteil von A-Medien & B-Medien
DMEM, Thermofisher mit hohem Glukosegehalt		11965092	Basismedien des Gesamtmediums
L-Glutamin (200 mM)	Thermofisher	25030081	Bestandteil des Gesamtmediums
Fötales Rinderserum	Thermofisher	16000044	Bestandteil des Gesamtmediums
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Thermofisher	14190144	Wird in Zellkulturen verwendet.
Hank' s Gepufferte Salzlösung, kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot	Thermofisher	14175095	Wird verwendet, um Zellpellets vor der Injektion zu resuspendieren
Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot	Thermofisher	25200114	Wird in Zellkulturen verwendet.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Zur Markierung von Lungenparenchym.
Name	Unternehmen	Katalognummer	>
Tabelle 3
Materialien für PuMA
Zeiss 710 konfokal LSM	Zeiss	N/A	Upright LSM konfokal Mikroskop
Zeiss 780 Konfokales LSM	Zeiss	N/A	Inverses LSM Konfokalmikroskop
SCID Mäuse	Charles River	N/A	NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, weiblich, Alter 6-8 Wochen
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Wird als Stütze für Lungengewebeschnitte verwendet.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Wird bei der Insufflation der Lunge angewendet.
1 ml Spritze mit 27 Gauge Nadel	Fisherscientific	14-826-87	Zur Injektion von Schwanzvenen.
10 ml Spritze	BD	309604	Zur Insufflation der Lunge.
20-Gauge-Katheter	Terumo	SR-OX2032CA	Wird bei der Insufflation der Lunge verwendet.
Abbott IV Verlängerungsset (30", steril)	Medisca	8342	Zur Anwendung bei der Insufflation der Lunge.
Alkoholtupfer	BD	326895	Zum Abwischen der Schwanzvene vor der Injektion
Sterile OP-Handschuhe	Fisherscientific	Variiert je nach Größe	Askeptischer Umgang mit der Lunge von Mäusen
30 cm	Lineal Klammern		Wird zur Insufflation der Lunge verwendet.
Stützständer für Lineal	Pipette.com	HS29022A	Wird zur Insufflation der Lunge verwendet.
35 mm Kulturschale mit Glasboden	Ibidi	81158	Wird bei der Bildgebung von Lungenschnitten verwendet
Saugfähige Unterlagen mit wasserdichter Feuchtigkeitsbarriere	VWR	56617-014	Wird verwendet, um den sterilen Arbeitsbereich in der biologischen Haube auszukleiden.
Catgut Plain Resorbierbares Nahtmaterial	Braun	N/A	Wird zum Abbinden von kanülierter Luftröhre verwendet.
Name	Unternehmen	Katalognummer	strong>Kommentare
Tabelle 4
Chirurgische Instrumente für PuMA
Micro Präparierschere 3,5" Gerade scharf/scharf	Roboz	RS-5910	Zum Schneiden von Lungenabschnitten
4" (10 cm) Lang, gezahnt, gerade, extra zart, 0,5 mm Spitze	Roboz	RS-5132	Zum Manipulieren/Halten von Lungenabschnitten.
4" (10 cm) Lange gezackte leichte Kurve 0,8 mm Spitze	Roboz	RS5135	Zum Manipulieren/Halten von Lungenabschnitten.
Daumen-Verbandzange; Gezahnt; Delikat; 4,5" Länge; 1,3 mm Spitzenbreite	Roboz	RS-8120	Für die allgemeine Dissektion.
Daumen-Abrichtzange 4,5" gezahnt 2,2 mm Spitzenbreite	Roboz	RS-8100	Für die allgemeine Dissektion.
Extra feine Mikro-Präparierschere 3,5" Gerade Scharf/Scharf, 20mm Klinge	Roboz	RS-5880	Für das allgemeine Präparieren.
Knapp Schere; Gerade; Scharf-stumpf; 27 mm Klingenlänge; 4" Gesamtlänge	Roboz	RS-5960	Für die allgemeine Dissektion.