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Methodenartikel

Techniken für die Untersuchung von der Anatomie des Sehsystems Ant

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⸱

DOI:

10.3791/56339

⸱

27. November 2017

 ,  , 
1Research School of Biology, Australian National University, 2Department of Biological Sciences, Macquarie University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Techniken in der Licht- und Elektronenmikroskopie, die internen und externen Auge Anatomie von Insekten zu studieren. Dazu gehören mehrere traditionelle Techniken optimiert für Ameise Augen, detaillierte Fehlersuche und Vorschläge für die Optimierung für verschiedene Proben und Regionen von Interesse.

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Techniken in der Lichtmikroskopie (LM) und Elektronenmikroskopie (EM), die verwendet werden können, um die internen und externen Auge Anatomie von Insekten zu studieren. Dazu gehören traditionelle histologische Techniken für die Arbeit an Ant Augen optimiert und angepasst, um im Konzert mit anderen Techniken wie Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) arbeiten. Diese Techniken können zwar enorm nützlich, schwierig für den unerfahrenen Mikroskopierer sein groß geschrieben in diesem Artikel auf Problembehandlung und Optimierung für verschiedene Exemplare. Wir informieren über bildgebende Verfahren für die gesamte Probe (Foto-Mikroskopie und SEM) und ihre vor- und Nachteile zu diskutieren. Wir markieren die Technik zur Ermittlung Objektiv Durchmesser für das gesamte Auge und diskutieren neue Techniken zur Verbesserung. Schließlich diskutieren wir Techniken beteiligt Probenvorbereitung für LM und TEM, schneiden, färben und imaging-diese Proben. Wir diskutieren die Hürden, die man erwarten würde, wenn vorbereiten Proben und wie Sie am besten zu ihnen navigieren.

Einleitung

Vision ist eine wichtige sensorische Modalität für die meisten Tiere. Vision ist besonders wichtig im Zusammenhang mit der Navigation für festlegend Ziele, Schaffung und Einhaltung von Routen und Erlangung Kompass Informationen1,2. Insekten erkennen visuellen Informationen mit ein paar Facettenaugen und in einigen Fällen ein bis drei dorsal platziert einfachere Augen genannt Ozellen3,4,5.

Die Augen von Ameisen sind von besonderem Interesse, weil, während Ameisen wunderbar vielfältig sind, sie einige Schlüsselmerkmale über Artgrenzen sparen. Trotz der dramatischen Veränderung in Anatomie, Größe und Ökologie die überwiegende Mehrheit der Arten sind eusozialen und Leben in Kolonien; Infolgedessen, Herausforderungen verschiedene Arten ähnliche visuelle in Bezug auf einen zentralen Platz und Ressourcen hin und her navigieren. Über Ameisen kann die gleichen grundlegenden Auge Bauplan bei Tieren von 0,5-26 mm Körperlänge, aus ausschließlich tagaktiv, streng nachtaktive Arten und langsam zu Fuß unterirdisch zu springen visuelle Raubtiere6,7beobachtet werden, 8,9,10. All diese erstaunlichen Unterschiede in der Ökologie und Verhalten ergeben sich unzählige Variationen der gleichen grundlegenden Augenstrukturen entsprechend unterschiedlichen Umgebungen, Lebensstile und Körpergrößen11,12. Infolgedessen bietet das Studium der visuellen Ökologie der Ameisen eine wahre Fundgrube an Möglichkeiten, die entschlossen Prüfer.

Das visuelle System der Insekten zu verstehen ist wichtig einen Einblick in ihre Verhaltensstörungen Fähigkeiten zu erlangen. Dies ergibt sich aus integrative Studien, die Anatomie mit Ökologie und Verhalten zu einem großen Erfolg in wenige Insektengruppen (z.B.Referenzen13,14,15,16, schön zu kombinieren 17). Obwohl Bereich Ameise Navigation und Ameise Verhalten im Allgemeinen recht erfolgreich war, wurde sehr wenig Wert auf Ant Vision außerhalb von ein paar ausgewählten Arten gelegt. Hier erarbeiten wir auf die Techniken bei der Untersuchung Auge Design von Ameisen beteiligt. Während wir auf Ameisen Fokus, können diese Techniken werden, mit geringfügigen Änderungen zu anderen Insekten auch angewendet.

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Protokoll

1. die Probenvorbereitung

Hinweis: Es ist notwendig, zuerst die relative Position der Facettenauge und Ozellen zueinander und auf dem Kopf zu verstehen. Dies kann erreicht werden, durch den Erwerb von Bildern der dorsalen Ansicht des Kopfes. Wir empfehlen hierzu Verarbeitung Proben für Mikrofotografie oder SEM-Techniken verwenden. Unten sind die Schritte in beiden Prozessen beteiligt.

  1. Probenentnahme
    1. Sammeln und Speichern von Proben direkt in 70 % igem Ethanol. Unterschiedliche Kasten, wann immer möglich zu sammeln.
    2. Exemplare mit Uhrzeit, Datum, beschriften und sowie alle anderen relevanten Beobachtungen (z.B., gesammelt während der Futtersuche, Paarung Aggregation, nest in einem Zweig usw.)
    3. Sammeln Sie genügend Exemplare um mehrere Wiederholungen in jede Behandlung haben.
  2. Mikrofotografie und Z-Stapeln
    1. Luft-trockenen Exemplare aus und klebe sie auf dreieckigen Punktekarten, Verwendung von wasserlöslichen Leim, und dann auf ein Insekt Pin. Für Details siehe Referenz18.
    2. Bild mit einer hohen Vergrößerung Stereomikroskop mit einem Z-Schrittmotor und ein Farb-Kamera.
    3. Verwenden Sie einen Diffusor, um gleichmäßige Beleuchtung für Proben haben.
    4. Bilder bei verschiedenen fokalen Ebenen erfassen und Speichern von Bildern in eine verlustfreie Dateiformat (z. B. Tiff) und Fokus Stapel mit im Handel erhältlichen Software.
  3. Scanning Electron Mikrographen
    Hinweis: Reinigen Sie alle Werkzeuge und Arbeitsflächen mit Ethanol zur Vermeidung von Kontaminationen der Probe mit Staub und anderen Partikeln gründlich.
    1. Proben in Ethanol über Nacht austrocknen und an der Luft trocknen in einer Petrischale.
    2. Verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge um den Kopf vom Rest des Körpers zu trennen.
    3. Montieren Sie den Kopf in den erforderlichen Blickwinkel (z.B.dorsal nach oben) auf Aluminium Baumstümpfen mit leitfähigen Kohlenstoff Band oder Registerkarten. Schneiden Sie das Carbon-Band in dünne Streifen und Falten Sie es zur Unterstützung der Kopfkapsel.
    4. Verwenden eines Sputter Coater, Gold auf der Oberfläche der Probe für 2 min bei 20 anzuwenden mA mit einem Drehtisch. Die Zeit und Strom müssen angepasst werden, je nach Instrument.
    5. Übertragen Sie Proben auf einen neuen Aluminium-Stub mit frischen Kohlenstoff Klebeband oder Registerkarten.
      Hinweis: Das unbeschichtete Carbon bieten einen schwarzen Hintergrund aber Exemplare übertragen die Goldbeschichtung beschädigen kann.
    6. Überprüfen Sie, dass die Probe Ausrichtung noch einen sezierenden Mikroskop stimmt und nach Bedarf mit einer feinen Pinzette oder ähnliches Werkzeug einstellen. Achten Sie darauf, nicht um die Goldschicht zu kratzen; Griff so wenig wie möglich.
    7. Laden Sie Proben auf die SEM Stub Halter, Kenntnis von der Position des Stubs und Proben relativ zueinander.
      Hinweis: Einige SEMs sind ausgestattet mit einer Bühne Kamera, aber viele sind nicht und es kann schwierig sein, kleine Exemplare bei hoher Vergrößerung zu finden.
    8. Bild der Proben. Verwenden Sie ein niedriger Beschleunigungsspannung, um Laden und einer kleinen Öffnung für gute Schärfentiefe zu vermeiden.
      Hinweis: Einstellungen sind am besten in Absprache mit einem Techniker optimiert spezialisiert auf das jeweilige Instrument verwendet wird.

2. Quantifizierung der Facette Anzahl und Durchmesser

  1. Hornhaut-Repliken
    1. Verwenden Sie Ameisen in Ethanol erhalten oder auf einen Pin für diesen Zweck (Schritt 1.1.1) montiert.
    2. Montieren Sie das Tier auf ein Insekt Pin oder Plastilin. Wenn der Kopf relativ groß ist, können die übrigen Körperteile entfernt werden.
    3. Verwenden Sie ein Insekt Pin oder einem feinen Zahnstocher zu holen einen kleinen Tropfen des farblosen Nagellack trocknet schnell und schnell über das Auge verteilt. Sicherstellen Sie, dass die Pin kratzen nicht das Auge. Der Nagellack sollte das gesamte Auge und einige der umliegenden Kopfkapsel abdecken.
      Hinweis: Es ist wichtig, dass der Nagellack von relativ gleichmäßige Dicke über dem Auge sein.
    4. Lassen Sie den Nagellack bei Raumtemperatur einstellen.
    5. Sobald es vollständig eingerichtet ist, verwenden Sie eine feine Insekt Pin zum Heben Sie vorsichtig des Replikats aus der Kopfkapsel rund um das Auge.
    6. Verwenden Sie einen feinen sauberen Pinzette heben das Replikat, ergreifen Sie den Teil des Replikats, das den Kopf und nicht das Auge bedeckt.
    7. Bewusstsein für die Ausrichtung des Auges zu gewährleisten: die vorderen, hinteren dorsalen und ventralen Region.
    8. Platzieren Sie das Replikat auf einen Objektträger. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Replikat durch sorgfältig entfernen überschüssiges Material rund um das Auge zu trimmen. Verwenden Sie eine Nadel oder ein paar Zangen um zu verhindern, dass das Replikat verschieben.
    9. Wenn das Auge sehr konvex ist, verwenden Sie eine Rasierklinge 3-4 feinen teilweise radiale Einschnitte am Rand zu helfen, das Replikat "flatten" zu machen. Wenn das Auge relativ "flach" ist, gibt es keine Notwendigkeit, solche Einschnitte machen.
    10. Legen Sie ein Deckglas vorsichtig auf das Auge Replikat, um sicherzustellen, dass die Ausrichtung des Replikats bekannt ist. Gelten Sie Druck nicht, wie dies die Hornhaut Eindruck auf den Nagellack beseitigen.
    11. Versiegeln Sie das Deckglas mit sehr wenig Nagellack auf vier Ecken. Wenn der Nagellack zwischen Objektträger und Deckglas fließt, wird das Replikat beschädigt werden.
    12. Bild der Folie auf einem Compound-Mikroskop.
      Hinweis: Wenn nur einige Facetten im Mittelpunkt stehen, schlägt dann dies, dass das Auge Replikat nicht genug abgewickelt wird. Verwerfen Sie und erneut ab Schritt 2.1.3.
    13. Importieren Sie das Bild in frei verfügbaren Programme wie ImageJ/Fidschi, wo die Anzahl der Ommatidien und Größe der einzelnen Ommatidien gemessen werden kann.
      Hinweis: Diese Methode kann verwendet werden, Repliken der Ozellen, vorbereiten. Da es eine einzelne Linse ist, empfiehlt es sich, die Ozellen zusammen in einem Replikat zu halten.

3. Analyse der Struktur des Auges

Hinweis: Um die Anatomie des Auges zu untersuchen erfordert in den meisten Fällen zwei sich ergänzende Techniken von LM und TEM. Die ersten Verarbeitungsschritte erfordern ähnliche Techniken für LM und TEM. Der Unterschied ergibt sich aus der speziellen Bühne ab. Verarbeitung von Proben erfordert die Verwendung von gefährlichen Chemikalien, die mit Sorgfalt behandelt und verantwortungsvoll entsorgt werden müssen. Persönliche Schutzausrüstung verwenden, arbeiten in einer Dampfhaube, immer lesen Sicherheit Daten sheets(SDS) und Risikobewertungen durchzuführen, bevor Sie beginnen.

  1. Dissektion
    1. Betäuben Sie Proben, durch Abkühlung oder durch die Einwirkung von gasförmigen CO2.
      1. CO2 Anästhesie ist sehr schnell (in der Regel unter 1 min) und sollte darauf geachtet werden, um Überbelichtungen zu vermeiden, da dies in den Tod der Probe führen kann. Wenn Trockeneis-Pellets (solid CO2) mit vermeiden Sie direkten Kontakt mit Proben, wie das kalte Verbrennungen verursachen kann.
      2. Kalten Anästhesie ist langsamer; 4 ° C ist ausreichend und kältere Temperaturen sind nicht zu empfehlen. Eine entsprechende Kühlzeit für die Spezies zu etablieren. Große oder Kälte resistent Ameisen wie Bull Ameisen erfordern > 10 min, vollständig immobilisiert werden, während kleinere Arten nur 1-2 min. übermäßige Kühlung benötigen wird die Probe töten (vermeiden Sie direkten Kontakt mit Eis). Proben sollten vorzugsweise im Schaum verschlossen, kleine Kunststoff-Container statt und gelegt in ein Eisschrank, wo sie beobachtet werden kann, und nicht in einen elektrischen Kühlschrank oder Gefrierschrank.
    2. Platzieren Sie Probe auf eine Petrischale zu, und passen Sie für die Anzeige unter dem sezierenden Mikroskop. Schnell arbeiten ist wichtig, Anästhesie zu bewahren und Degeneration des Gewebes zu vermeiden, sobald Einschnitte (diese innerhalb von Sekunden passieren kann) vorgenommen werden.
    3. Entfernen Sie Antennen mit einer Pinzette. Arbeiten mit einem stechenden Insekt ist es ratsam, die Gaster zuerst, um zu vermeiden, gestochen zu amputieren.
    4. Entfernen Sie die Mundwerkzeuge mit einer scharfen Rasierklinge; Zange kann verwendet werden, um die Probe gedrückt. Schnitt durch den vorderen Teil des Auges (große Exemplare) oder möglichst nahe an der Netzhaut der Augen wie möglich (kleine Exemplare) ohne zerrte an das Gehirn als das Herausreißen können.
    5. Bereiten Sie die Kopfkapsel zu öffnen. Winkel der Probekörpers, so dass der erste Schnitt nach oben zeigt; Dies kann entweder unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt werden, halten Sie die Probe in Zange oder unter Sichtkontrolle während die Probe zwischen dem Daumen und Vordergrund Finger halten.
    6. Machen Sie einen queren Schnitt durch den Kopf, um den ventralen Teil des Kopfes zu entfernen; Teil des ventralen Auges kann bei großen Arten, Fixierung und Infiltration zu verbessern entfernt werden. Der Kopf sollte an dieser Stelle noch am Körper befestigt.
    7. Trennen Sie die Kopfkapsel aus dem Körper indem man einen koronalen Schnitt nur posterior, das Facettenauge.
    8. Legen Sie seziert Kopfkapsel mit den Facettenaugen in Eis kalt Fixiermittel: 2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (pH 7,2-7,5).
      Achtung: Fixativ ist ätzend und giftig; angemessenen Schutz zu tragen und arbeiten unter einem Abzug.
      Hinweis: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um die Degeneration von Nervengewebe zu verhaften. Die Präparation sollte in 2 min oder weniger abgeschlossen (effiziente Dissektion erfordern etwas Übung).
      Hinweis: Wenn das Auge hell oder dunkel Gegebenheiten angepasst werden muss, dann setzen Sie zuerst die Tiere zu den erforderlichen Lichtverhältnissen für ein paar Stunden. Führen Sie die Sektionen in den jeweiligen Lichtverhältnissen. Dissektionen können unter rote Ampeln, Dunkelheit zu simulieren durchgeführt werden.
  2. Probe Verarbeitung
    1. Halten Sie die Exemplare in das Fixiermittel bei Raumtemperatur mit Bewegung auf einem Orbitalschüttler für 2 h. große Exemplare längere Fixierung Zeiten erfordern können.
    2. Entfernen Sie das Fixiermittel und entsprechend zu entsorgen. Waschen Sie Proben bei Raumtemperatur Phosphatpuffer (3 mal 5 min jeder) auf den Shaker.
      Hinweis: Der Phosphatpuffer besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na2HPO40,244 g KH2PO4 in 1 L destilliertem H2O (pH 7,2).
    3. Entfernen der Phosphatpuffer und 2 % OsO4. Legen Sie die Präparateglas auf den Shaker in der Dunstabzugshaube für 1-2 h. Dies ist ein Post-Fixierung Schritt, Fette zu beheben und auch Kontrast für TEM.
      Hinweis: Osmium Fixierung Zeiten unterliegen Probengröße; als grobe Faustregel berechnen Sie 1 h Fixierung pro 1 mm3.
    4. Die Osmium-Lösung entfernen und entsorgen Sie es entsprechend. Waschen Sie Proben bei Raumtemperatur Puffer (3 mal 5 min jeder) auf den Shaker.
    5. Die Proben zu entwässern, indem man sie in steigenden Konzentrationen von Ethanol oder Aceton; z. B. 50, 70, 80, und 95 % für 10 Minuten und schließlich 100 % (2 x 15 min pro). Legen Sie die Exemplare auf den Shaker zwischen Lösung Änderungen.
      Hinweis: Falls erforderlich, können Proben in 70 % igem Ethanol über Nacht gespeichert werden.
    6. Das Ethanol abtropfen und 100 % Aceton hinzufügen. Lassen Sie ihn für 20 min auf den Shaker (überspringen Sie diesen Schritt, wenn es in Aceton austrocknen). Ersetzen Sie mit frischem Aceton und lassen Sie es für eine zusätzliche 20 Minuten.
    7. Infiltrieren Sie das Gewebe mit Harz verwenden die folgenden Verhältnisse Aceton um zu Harz: 2:1 (3 h), 1:1 (über Nacht), 1:2 (4 h) und reines Harz (über Nacht). Lassen Sie bei jedem Schritt Exemplare auf den Shaker im Innern der Dampfhaube und Kappe des Containers für alle, aber die letzten beiden Schritte.
      Hinweis: Harz ist zu zäh abgelassen werden, so dass Proben zu einem neuen Einweg-Container bei jedem Schritt bewegt werden müssen.
    8. Bereiten Sie Blöcke, um die Proben zu montieren. Blöcke können speziell durch Schneiden von Acrylglas in kleine rechteckige Blöcke (1,5 x 0,5 x 0,3 cm) angefertigt werden. Blöcke können auch durch Gießen Epoxidharz (es gibt viele kommerzielle Kits erhältlich) in eine Silikon-Form gemacht werden und dann in den Ofen für 12-14 h bei 60 ° c zu heilen
      Achtung: Noch nicht ausgehärteten (Flüssigharz) ist krebserregend und in den Ofen bis vollständig ausgehärtet zurückgegeben werden sollten.
    9. Platzieren Sie den Block vertikal in der Form. Sorgfältig nehmen Sie die Exemplare aus dem flüssigen Harz, lassen Sie überschüssiges Harz abtropfen und legen Sie die Probe auf die Oberseite des Blocks. Eine kleine Menge von zusätzlichen Harz lässt sich die Probe in den Block zu binden.
    10. Beschriften Sie den Block. Die Papieretiketten drucken und Binde sie in den Block oder ein Block Gesicht zuordnen.
    11. Halten Sie die Form mit den eingebetteten Blöcken in den Ofen für 12-14 h bei 60 ° C.
    12. Speichern Sie die Probe-Block in einem sauberen Umschlag. Dies kann auf diese Weise über mehrere Monate bis Jahre gespeichert werden.
    13. Verlassen der gebrauchten Containern, schmutzige Handschuhe und anderen kontaminierten Geräten in der Dunstabzugshaube zu Aceton vollständig verdunsten lassen (mind. 12 h).
    14. Harz im Ofen bevor Sie Einweg-Geräte zu entsorgen oder Schaben Harz aus andere Elemente wie Zangen zu heilen.
  3. -Schnitt
    1. Beobachten Sie den Block unter dem sezierenden Mikroskop um sicherzustellen, dass die Probe-Ausrichtung für die Stationspunkte Flugzeug geeignet ist.
    2. Wenn die Ausrichtung nicht geeignet ist, verwenden Sie einen Juwelier Säge, schneiden Sie die Probe und neu auszurichten, Fragmente von Set Harz und frischen Harz verwenden, um die Probe wieder Sitz. Der Kopf kann auch in zwei Hälften, die beiden Augen separat Abschnitt aufgeteilt werden. Heilen Sie Harz wieder bevor Sie fortfahren.
    3. Montieren Sie den Block auf dem abnehmbaren Mikrotom-Futter. Entfernen Sie das Futter und auf Halter.
    4. Schneiden Sie den Harz-Block mit einer Rasierklinge unter dem sezierenden Mikroskop.
      Achtung: Tun dies nicht, wenn das Futter auf dem Mikrotom Arm montiert ist, wie es den Arm Ruck und die Lager beschädigen kann.
    5. Montieren Sie das Futter auf dem Mikrotom-Arm und Winkel der Probekörpers.
    6. Montieren Sie das Messer auf den Halter an den entsprechenden Winkel (0 ° c für Glas-Messer, siehe Herstellerangaben für Diamant Messer).
      Hinweis: Glas Messer können mit einem Glas Messermacher billig hergestellt werden sondern müssen in regelmäßigen Abständen ausgetauscht werden, da sie seinen Schliff verlieren; hochwertige Diamant Messer können erworben werden, aber sind teuer, erfordern besondere Sorgfalt und sind nicht für Anfänger geeignet.
    7. Füllen Sie das Messer Boot mit destilliertem Wasser mit einer Spritze mit einem Filter (0,45 µm Porengröße) ausgestattet.
    8. Füllen Sie das Boot, bis der Wasserstand die Kante des Messers erreicht; der Meniskus kann in anderen Bereichen des Bootes konvex sein.
    9. Entleeren Sie das Boot, bis der Meniskus sehr leicht konkave ist aber noch den Rand des Messers erreicht. Das Niveau des Wassers kann zu jedem Zeitpunkt aber immer der Schneide des Messers eingestellt werden.
    10. Sorgfältig bringen Sie das Messer auf die Probe zu und richten Sie den Block mit dem Messer. Dies geschieht am besten, langsam, in regelmäßigen Abständen überprüfen die Nähe des Messers durch das Okular und von der Seite.
      Hinweis: Überprüfen Sie das Instrument Handbuch für spezifische Anweisungen, wie Instrumente variieren.
    11. Legen Sie die Schnittdicke am Mikrotom. Auswahl der richtigen Dicke werden je nach Probengröße, Region von Interesse und die Art von Messer verwendet wird.
    12. Wenn eine höhere Einstellung (z.B. 4 µm), mit einem Glas Messer auswählen werden, wenn viel Material entfernt gekürzt werden muss, bevor man den Bereich von Interesse. Wenn ein Diamant-Messer verwendet wird oder wenn die Probe sehr gering ist, kann 1-2 µm besser geeignet sein.
    13. Starten Sie das "schneiden" (kurbeln das Mikrotom-Rad), wenn das Messer nahe ist aber noch nicht in der Probe, den letzten Teil des Ansatzes führen zu schneiden. Abschnitte sollten starten, erscheinen innerhalb von ein paar Drehungen; Falls dies nicht der Fall ist, stoppen und sehr sorgfältig dem Messer ein wenig näher bringen.
    14. Stellen Sie im Abschnitt sammeln Dicke (1 µm für semi-dünne Abschnitte) als Annäherung an die Region von Interesse.
    15. Sammeln Sie alle Abschnitte mit einer Wimper-Tool.
      Hinweis: Wimpern Werkzeuge können mit Wimper montiert auf einem dünnen Stock mit Nagellack erfolgen.
    16. Wenn viel Material entfernt werden muss, können Sie die Abschnitte zu akkumulieren und massenhaft zu entfernen, indem Sie das Messer entfernen und mit Wasser ausspülen. Wenn ein Glas Messer verwenden, kann dies eine angemessene Zeit zu ändern, zu einem neuen Abschnitt des Messers oder ein neues Messer sein.
    17. Eine Reihe von kleinen Tropfen destilliertes Wasser auf einer Folie mit einer Pasteurpipette oder im Idealfall den Filter ausgestattet Spritze.
    18. Schweben Sie sorgfältig gesammelten Abschnitt auf die Wimpern auf den Wassertropfen.
    19. Abschnitte wie folgt zu sammeln, bis es angemessen ist, die Tiefe der Schneiden zu überprüfen.
      Hinweis: Obwohl es langweilig sein kann, empfiehlt es sich, häufig zu überprüfen.
    20. Legen Sie die Folie auf eine Herdplatte setzen auf 60 ° C. Lassen Sie alle Wasser zu verdampfen und der Abschnitt zur Einhaltung der Folie.
    21. Färben mit Toluidin blau für 10-60 s (Färbung Zeit mit Schnittdicke variieren). Den Farbstoff mit einer Spritze, ausgestattet mit einem Filter (siehe oben) zu verzichten.
    22. Geben Sie einen Tropfen des Farbstoffes an einem Ende der Folie und verbreiten Sie es mit der Seite der Nadel ohne berühren oder kratzen in den Abschnitten zu. Legen Sie die Folie auf der Herdplatte für ca. 10-20 s.
    23. Spülen Sie die Folie durch Besprühen mit destilliertem Wasser in einer Waschflasche und legen Sie es auf der Heizplatte, um ihn zu trocknen.
    24. Unter dem Mikroskop Verbindung überprüfen und ihnen Bild.
    25. Wiederholen Sie, bis des Interessenbereichs erreicht ist.
    26. Für ultra-dünne Abschnitte: Legen Sie die Schnittstärke zwischen 40-60 nm, TEM Abschnitte zu sammeln.
    27. Schnitt über 3-5 Abschnitte und Check Dicke mit einer Interferenz-Farbkarte. Abschnitten sollte hellgrau bei einem Betrachtungswinkel widerspiegeln.
      Hinweis: Chloroform Dämpfe können über Abschnitte Falten entspannen pipettiert werden. Dies ist besonders wichtig für erfahrene Anwender und Anfänger brauchen sich keine Sorgen. Zuviel Chloroform veröffentlicht zu nah zum Abschnitt kann Teile beschädigen.
    28. Nehmen Sie ein Formvar beschichtet, Kupfer, Slot-Raster mit der Pinzette mit der Formvar Seite aufgehalten. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Formvar Beschichtung zu durchbohren.
    29. Tauchen Sie das Netz in das Boot meist und Weg von den Abschnitten bringen Sie dann das Gitter sich Parallel zur Oberfläche unter den Abschnitten. Bei Bedarf verwenden Sie die Wimpern, um die Abschnitte über das Netz zu führen.
    30. Tupfen Sie vorsichtig um die Spitze von der Zange mit Filterpapier aufsaugen Wasser gefangen zwischen den Armen. Wenn dies nicht geschieht, kann Wasser Spannung das Netz zwischen den Armen hochziehen oder machen es zu einer Seite zu halten. Dadurch können Verschmutzungen oder Beschädigungen.
    31. Entfernen Sie sorgfältig überschüssiges Wasser aus dem Netz selbst per Dauerauftrag Raster meist auf Filterpapier.
    32. Legen Sie das Raster in einem Gitterhalter.
    33. Wiederholen Sie, bis genügend Abschnitte gesammelt worden sind.
    34. Semi-dünne Abschnitte können direkt mit jeder Verbindung Mikroskop mit einer Kamera ausgerüstet abgebildet werden. Immersionsöl kann direkt auf die Abschnitte platziert werden. Folien sind in einer Folie Box um Verfärbungen zu vermeiden aufzubewahren.
  4. Färbung von ultra-dünnen Abschnitt für TEM-Kontrast
    Hinweis: Die folgenden Schritte sollten unter dem Deckmantel erfolgen, wie die Farbstoffe Licht und CO2 empfindlich sind. Darüber hinaus EM Farbstoffe verwenden Schwermetalle, um Kontrast zu produzieren und sind deshalb gefährlicher Stoffe. Entsprechende Vorsicht ist beim Umgang mit diesen Flecken.
    1. Decken Sie ein paar große Petrischalen mit Alu-Folie, Licht zu blockieren. Unter diesen für die folgenden Schritte funktionieren. Decken Sie teilweise um Arbeitsraum zu ermöglichen, sondern setzen Sie die Abdeckungen wieder auf so bald wie möglich auf.
    2. Schneiden Sie ein Stück Wachs Folie und legen Sie fünf Tropfen 6 % gesättigt Uranyl-Acetat vorsichtig mit einer Pasteurpipette.
      1. Um die Lösung vorzubereiten, mischen Sie 2 g Uranyl Acetat mit 100 mL 50 % Methanol in destilliertem Wasser, und Filtern Sie die Lösung vor der Verwendung. Die Lösung kann nicht gespeichert werden und sollten werden frisch gemacht jedes Mal19.
    3. Holen Sie sorgfältig die TEM-Raster mit Zange und Balance auf Farbstoff Tröpfchen mit dem Abschnitt nach unten. 25 min warten.
    4. Spülen Sie Raster individuell durch sie schnell ein-und destilliertem Wasser eintauchen; Fortschritt durch vier verschiedene Fläschchen mit destilliertem Wasser.
    5. Legen Sie fünf Tropfen von Blei Citrat auf ein frisches Stück Film. Ordnen Sie ein paar NaOH Pellets um die Farbstoff-Tröpfchen (dies absorbiert atmosphärischen CO2 zur Ausfällung von Blei-Karbonat zu verhindern).
      1. Um die Blei-Citrat-Lösung, bereiten Sie Bi-destilliertes Wasser von kochendem destilliertem Wasser für 0,5 h lassen Sie das Wasser abkühlen lassen und in einem verschließbaren Behälter, 100 mL von Bi-destilliertes Wasser 0,3 g Blei Citrat hinzufügen. Fügen Sie 1 mL 10 M NaOH, den Behälter verschließen und schütteln, bis gelösten19.
    6. Legen Sie die Gitter auf die Farbstoff-Tropfen, wie beschrieben in 4.3 und bedecken. Fleck für 5 Minuten.
    7. Spülen Sie mit destilliertem Wasser als vor durch Eintauchen der Raster ein-und destilliertem Wasser 20-Mal. Fortschritt durch drei Schiffe von destilliertem Wasser.
    8. Überschüssiges Wasser mit Filterpapier aufsaugen und die Netze zum Trocknen in eine Gitterbox zu ermöglichen.
    9. Bild in einem TEM bei niedriger Beschleunigungsspannung.

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Ergebnisse

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen detaillierte Untersuchung des einfachen und Facettenaugen der Ameisen. Bildgebung der dorsalen Ansicht des Kopfes mit Z-Stapel Mikrofotografie Techniken erlaubt es, eine Übersicht über das Layout des visuellen Systems (Abbildung 1). Dies ist eine gute Vorbereitung für Sezierungen und strukturierendes Winkel zu bestimmen. Diese Technik eignet sich auch zum Maßnehmen wie Kopfbreite, Auge-Länge und ocellar Objektiv Dur...

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Diskussion

Die Suite der oben beschriebenen Methoden ermöglichen eine effektive Untersuchung über das optische System von Ameisen und anderen Insekten. Diese Techniken informieren Sie unser Verständnis von Abtastauflösung, optische Empfindlichkeit und potenzielle Polarisation Empfindlichkeit des Auges untersucht. Dieses Wissen ist ein wichtiges Fundament für die physiologischen und verhaltensbezogenen Untersuchung ihre visuellen Fähigkeiten. Darüber, während die hier beschriebenen Methoden auf Ant visuelle Systeme konzentriert habe...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir sind dankbar, Jochen Zeil, Paul Cooper und Birgit Greiner für ihre Wissensaustausch im Insekt Anatomie und zur Demonstration verschiedener Techniken, die wir hier beschrieben haben. Wir sind dankbar, die talentierte und unterstützenden Mitarbeiter im Zentrum für Advanced Microscopy bei ANU und der Mikroskopie am MQU. Diese Arbeit wurde durch ein graduate Stipendium für FRE und Zuschüsse von der Australian Research Council (DE120100019, FT140100221, DP150101172) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AmeiseMyrmecia midas
StereomikroskopLeica M205 FA
Sputter CoaterPro Sci Tech
EthanolSigma Aldrich
PetrischaleProSciTech
PräpariermikroskopLeica MZ6
Insect PinProSciTech
Farbloser NagellackOhne Markenzeichen: aus jedem Kosmetikgeschäft
ObjektträgerProSciTech
RasierklingeProSciTech
ForecepsProSciTech
DeckglasProSciTech
VerbundmikroskopLeica DM5000 B
GlutaraldehydSigma Aldrich
ParaformalydehydeSigma Aldrich
Kaliumchlorid (KCl)Sigma Aldrich
di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)Sigma Aldrich
Kaliumdi-Wasserstoffphosphat (KH2PO4)Sigma Aldrich
Natrium Chlorid (NaCl)Sigma Aldrich
Osmium tetroxidSigma Aldrich
AcetonSigma Aldrich
Araldit EpoxidharzSigma Aldrich
Toluidie BlueSigma Aldrich
HotplateRiechert HK120
Pasteur Pipette Sigma Aldrich

Referenzen

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