Masse isoliert und In-vitro- Kultivierung von Intramolluscan Stadien der menschlichen Blut Fluke Schistosoma Mansoni

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die groß angelegte axenic Isolierung und Sammlung von freischwimmenden Miracidia der menschlichen Blut Egel Schistosoma Mansoni und deren Weiterverarbeitung für Einführung in die in-vitro- Kultur.

Zusammenfassung

Menschliches Blut Egel, Schistosoma spp., haben einen komplexen Lebenszyklus, der sexuelle und asexuelle Entwicklungsphasen innerhalb einer Schnecke zwischen- und Säugetieren Endwirt, bzw. beinhaltet. Die Fähigkeit, zu isolieren und Aufrechterhaltung der verschiedenen Lebenszyklusphasen unter in-vitro- Kulturbedingungen hat Untersuchungen der zellulären, biochemischen und molekularen Mechanismen zur Regulierung Parasit Wachstum, Entwicklung und Host erheblich erleichtert. Interaktionen. Übertragung von Schistosomiasis erfordert Ungeschlechtliche Fortpflanzung und Entwicklung mehrere Larvenstadien innerhalb der Schnecke Host; von der infektiösen Miracidium, durch primäre und sekundäre Sporocysts zu cercarial Endstufe, die für den Menschen ansteckend ist. In diesem Beitrag präsentieren wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur Masse Schraffur und Isolierung von Schistosoma Mansoni Miracidia von Eizellen aus Lebern von infizierten Mäusen und ihre nachträgliche Einführung in in-vitro- Kultur. Es wird erwartet, dass das ausführliche Protokoll wird neue Forscher zu betreiben und erweitern diese wichtige Forschungsfeld schistosome-zu fördern.

Einleitung

Das menschliche Blut Egel Schistosoma spp., sind die Erreger der Schistosomiasis, eine vernachlässigte tropische Krankheiten leidet schätzungsweise 230 Millionen Menschen weltweit¹. Die am weitesten verbreitete Art, Schistosoma Mansoniist in Südamerika, des karibischen Archipels, Nahost und Afrika südlich der Sahara in Afrika²geografisch verteilt. Der Lebenszyklus von S. Mansoniund andere Schistosomen ist komplex, mit einem Säugetier Definitive Host und Süßwasserschnecken der Gattung Biomphalaria , die als obligate Zwischenwirte dienen.

S. Mansoni männlichen und weiblichen Erwachsenen Wurm Paare Leben in den hinteren mesenterialen Adern der Säugetier-Wirt reproduzieren, was die Auflösung von embryonierten Eiern (Ova), die in die kleinen Venolen der Darmschleimhaut eingereicht werden. Eiern dann durchbricht die Gefäßwände durch Schleimhaut Wandern, und schließlich geben Sie das Darmlumen, wo sie mit dem Kot storniert werden. Bei Ova Süßwasser und freischwimmenden Larven (Miracidia) schlüpfen müssen, sie in kurzer Zeit eine geeignete Biomphalaria Schnecke zu infizieren, um seinen Lebenszyklus weiter vorkommen. Dieser Infektionsprozess beinhaltet Miracidial Bindung an die Schnecke äußeren Körperoberfläche gefolgt von aktiven eindringen und Eindringen von der Larve in den Host. Bald nach Eintritt beginnt das Miracidium, die Außenlamellen ciliated epidermalen Schuppen, wie es ein Syncytium bildet, die die neue äußere Oberfläche (Schale) des nächsten Larvenstadium, die primäre oder Mutter Sporocyst werden. Durch Ungeschlechtliche Fortpflanzung jede primäre Sporocyst produziert und veröffentlicht eine zweite Generation von Sporocysts, als sekundäre oder Tochter Sporocysts, die wiederum erzeugen und lösen zahlreicher intramolluscan Endphase der Cercaria³ . Bei der Flucht aus der Schnecke Host können Nautiliden Cercariae zuweisen und direkt die Haut eines Menschen oder andere geeignete Säugetier-Hosts durchdringt. Bei der Einreise in ihren neuen Wirt Cercariae auf die parasitären Schistosomula Bühne verwandeln und dringen in das Gefäßsystem. Sie migrieren wiederum an der Lunge und dann an die Lebervene wo sie Reifen zu Erwachsenen Würmer, männliche und weibliche Paare bilden und Reisen zu den mesenterialen Adern um ihren Lebenszyklus zu vervollständigen.

Erfolgreiche intramolluscan oder "Schnecke-Phase" Entwicklung der Larven Schistosomen unbedingt Fortsetzung des Zyklus des menschlichen Host-to-Host-Übertragung. Von entscheidender Bedeutung ist die folgende Posten von der freischwimmenden Miracidium in der Schnecke Host und seine frühen Transformation auf die primäre Sporocyst-Bühne. Abhängig von den physiologischen und immunologischen Kompatibilität zwischen Wirt und Parasit ist es in dieser Phase der Larvalentwicklung dieser anfänglichen Erfolg oder Misserfolg zu Infektionen ist bestimmt^4,5,6 . Nachfolgende Entwicklung der primären Sporocysts asexuell produzieren sekundäre Sporocysts, die dann Menschen infektiöse Cercariae erzeugen, weitere erfordern eine permissive physiologischen Host-Umgebung, die für alle der Parasit Wachstum bereitstellt und reproduktive braucht.

Bisher ist wenig bekannt über die zugrunde liegenden, physiologische, biochemische und molekulare Prozesse schistosome-Schnecke Interaktionen, vor allem die Moleküle und Wege beteiligt zur Regelung der Larvalentwicklung und Reproduktion oder Modulation Host-Immunantworten. Zugriff auf eine große Anzahl dieser Larvenstadien unter in-vitro- Kulturbedingungen, die experimentelle Manipulation zulassen würde erheblich erleichtern die Entdeckung des entwicklungspolitischen Wege und zugrunde liegenden Mechanismen des Zellwachstums, Differenzierung und Reproduktion. Kritischen Parasit Wege oder Mechanismen, identifiziert durch in-vitro- Experimente, könnte dann Larven Wachstum/Reproduktion in der Schnecke Host zu stören oder Schnecke Host Abwehrmechanismen beteiligt Erkennung und Beseitigung von identifizieren verwendet werden Miracidial oder Sporocyst Stufen.

In diesem Artikel und video-Präsentation bieten wir eine detaillierte Beschreibung einer Methode zur Isolierung von freischwimmenden S. Mansoni zahlreicher Miracidia für Einführung in in-vitro- Kultur, die dann mit weiteren experimentellen ausgesetzt sein könnten Manipulation (siehe Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die Protokoll-Workflow). Obwohl ähnliche Verfahren beschrieben wurden bisher^7,8,9, fühlten wir, dass ein detailliertes Protokoll sinnvoll, Forscher, die dieses Modell wäre, um noch offene Fragen im Zusammenhang mit Adresse beschäftigen wollen intramolluscan Larvalentwicklung, Zellproliferation und schistosome-Schnecke immun Interaktionen. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz für die Isolierung von Eiern aus anderen medizinisch wichtigen Trematoden wie Blase-Wohnung S. Haematobium, Leberegel oder Lunge Egel leicht angepasst werden.

Protokoll

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren wurden durch die institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss der University of Wisconsin-Madison unter Protokoll genehmigt keine. V005717. Das folgende Protokoll beinhaltet Arbeiten in einer Einrichtung Biosafety Level 2 (BSL2) für menschliche Krankheitserreger, obwohl keiner der schistosome-Stufen dargestellt, die in diesem Protokoll ansteckend für Menschen oder andere Säugetiere sind. Institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Risiko-Gruppe 2 (RG2) menschliche Krankheitserreger zu folgen.

Hinweis: Wir verwenden weibliche Swiss-Webster Mäuse (6 - Wochen alten) aufgrund ihrer höheren Anfälligkeit zur Infektion¹⁰, damit größere Ei Belastungen nachgeben. Tucker Et Al. beschreiben die Maus und Schnecke Infektion Protokolle in diesem Modell System¹¹verwendet. Die Tabelle der Materialien zeigt eine Liste aller spezifischen Ausrüstung, Materialien, Reagenzien und tierischen Quellen, die zur Durchführung dieser experimentellen Protokolls.

1. Verarbeitung von infizierten Leber

1. Einschläfern Sie Mäuse, 6-7 Wochen nach der Infektion, durch CO₂ ersticken (Rate von 10-30 % von dem Kammervolumen pro Minute). Mäuse für die Einstellung der Atmung und Herzschlag zu überwachen.
   Hinweis: In der Regel können bis zu 20 Mäuse zu einem bestimmten Zeitpunkt verarbeitet werden.
2. Legen Sie nach der Übertragung euthanasierten Mäuse auf eine biologische Kabinett Mäuse auf den Rücken und sprühen Sie ihre ventralen Flächen mit 70 % Ethanol. 1 min. einwirken lassen.
3. Kneifen und ziehen Sie die Haut des Unterleibs und quer durch die Basis der eingeklemmten Haut am nächsten an den Bauch mit sterilen Chirurgische Scheren. Ziehen Sie die geschnittenen Haut anterior (d. h. in Richtung zum Kopf), die Leber zu offenbaren. Beachten Sie, dass die Leber sollte vergrößert und durch eine Ei-induzierte granulomatöse Reaktion (Abbildung 2A gesprenkelt).
4. Entfernen Sie die Leber und legen Sie sie in einen Becher mit 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep.
5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 mit verbleibenden Mäuse.
   Hinweis: Zwanzig Mäuse sind in der Regel in einer einzigen Ernte verarbeitet.
6. Die Leber in eine sterile Petrischale und entfernen Sie-Leber Fett/Bindegewebe mit der sterilen Pinzette.
7. Auf eine sterile 250-mL-Zentrifuge-Flasche mit ~ 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep getrimmt/gereinigt Lebern übertragen.
8. Kräftig schütteln Sie die Flasche mit der Leber, und mit einer sterilen Einweg-Pipette, entfernen Sie die überschüssige Oberfläche Schaum/Treibgut. Langsam die restliche Salzlösung in ein Gefäß abgießen oder Waschbecken mit 1 % Bleichmittel (Desinfektionsmittel).
9. Die Lebern ~ 200 mL frische Kochsalzlösung hinzu, und wiederholen Sie Schritt 1,8 noch dreimal.

2. Leber Extraktion und Miracidial isolation

1. Legen Sie die Leber in einer kleinen sterilen Edelstahl-Mixbecher und ~ 2 mL 1,2 % NaCl-Lösung (Abb. 2 b).
2. Decken Sie die Tasse mit Folie und einer Petrischale zur Verhinderung von Verschmutzungen und Mischung für 1 min durch den Wechsel von niedriger und hoher Geschwindigkeit (20 s niedrige Geschwindigkeit/10 s high-Speed, Wiederholung) (Abbildung 2).
3. Verteilen Sie gleichmäßig die kombinierte Leber Aussetzung in sterilen 250-mL-Zentrifuge Flaschen (für 20 Lebern 4 Flaschen verwenden).
4. ~ 200 mL Gesamt Volumen/Flasche sterile Kochsalzlösung mit Antibiotika hinzufügen. Gewicht/Balance Flaschen vor der Zentrifugation.
5. Zentrifuge gemischt Leber bei 290 X g für 15 min bei 4 ^oC. sanft aus Überstände in einen Behälter mit Bleichmittel vor der Entsorgung zu gießen.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 einmal. Achten Sie darauf, gründlich vor Zentrifugation Leber Sediment aufzuwirbeln.
7. Nach verwerfen die letzten Kochsalzlösung waschen Sie (Schritt 2,6), gebeizte Lebergewebe, schütteln Sediment aufzuwirbeln und übertragen die Aufhängung in eine sterilisierte 1 L volumetrischen Kolben, der komplett mit Aluminium abgedeckt wurde fügen 200 mL sterilem Teichwasser mit Pen/Strep hinzu Folie, mit Ausnahme der Spitze 3 cm des Halses (Abb. 2D).
   Hinweis: Verwenden Sie zwei Flaschen (= 10 Lebern) pro 1-L-Flasche. Teichwasser simuliert die natürliche Süßwassersee Umgebung musste Miracidial schlüpfen aus den Eiern zu stimulieren.
8. Mit sterilem Teichwasser, füllen Sie die Flasche um ca. 3 cm oberhalb der Folie abdecken am Hals. Dann, ohne Verzögerung (wie Miracidia in Kürze beginnen zu schlüpfen), restliche Schaum und Lebergewebe schwimmend an der Oberfläche durch schnell Pipettieren bis ~ 12 mL Teichwasser mit Schutt entfernen und verwerfen es in einem separaten Rohr zu verwerfen. Ersetzen Sie durch frische sterile Teichwasser.
9. Wiederholen Sie die Reinigung Schritt 2.8, drei weitere Zeiten, Überprüfung auf Vorhandensein eines Miracidia in der Röhre verwerfen. Einzustellen Sie Wiederholung der Reinigung Schritt erscheint Miracidia in der Waschlösung.
10. Fügen Sie nach der letzten Wäsche hinzu, langsam ~ 12 mL warmen sterilem Teichwasser (30 ^oC vorgewärmt) um ein Temperaturgradient mit sauberem, sterile warmes Wasser an der Spitze zu schaffen.
    Hinweis: Dies geschieht am besten durch langsam entladen Wasser entlang der Seite des Halses Fläschchen mischen zu vermeiden.
11. Legen Sie eine kleine Petrischale Abdeckung über der Öffnung der Flasche und strahlen ein helles Licht am oberen Rand der Flasche über die Folienabdeckung, die Oberfläche des Wassers zu beleuchten.
    Hinweis: In der Regel innerhalb von 5-10 Minuten, Schwimmen Miracidia, angezogen, das Licht in großer Zahl innerhalb der ersten 2-3 cm Teichwasser (Abbildung 3A) konzentrieren.

3. Miracidial Ernte und Anbau

1. Wenn Miracidia haben nach 10 min an der Oberfläche gesammelt, mit einer sterilen Transferpipette ~ 8 mL Teichwasser und Transfer in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL entfernen. Legen Sie die Röhrchen mit Miracidia auf Eis.
2. Zurück 8 mL warmen sterilem Teichwasser entlang der Innenseite der volumetrischen Küvette hinzufügen und weitere 10 Minuten warten.
3. Mit neuen Röhren jedes Mal, wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 noch dreimal. Halten Sie nach der 4^th -Sammlung das letzte Rohr auf Eis für 10 min erlauben die Miracidia zu begleichen. Dieser Satz von Rohren umfasst die erste Ernte.
4. Zentrifugen-Röhrchen mit Miracidia 290 X g für 1 min bei 4 ^oC in einer vorgekühlten gekühlten Zentrifuge.
5. Umgehend entfernen Sie die meisten des Überstands (~ 7 mL) darauf achten, nicht zu stören das Parasiten-Pellet (Abb. 3 b).
6. Pool der Miracidia aus dieser ersten Ernte zu einem Rohr, dann spülen Sie alle der ursprünglichen Rohre mit ~ 1 mL sterilem Teichwasser und hinzufügen "gepoolte" Rohr.
7. Können Parasiten für ~ 5 min auf Eis zu begleichen, und erneut Zentrifugieren der Parasiten bei 290 X g für 1 min bei 4 ^oC.
8. Sorgfältig entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 6-8 mL sterile Chernin Salzlösung (CBSS +; siehe Tabelle of Materials) enthaltenden Pen/Strep ausgeglichen.
9. Auszusetzen Sie die Miracidia und aliquoten folgte ihnen in eine Kultur 24-Well-Platte (1 mL pro Well), indem das Rohr in 6-8 mL CBSS + Spülung und 1 mL Spülen in jede Vertiefung sanft. Parasiten bei 26 ^oC unter inklusieve Bedingungen auszubrüten. Konzentrationen von isolierten Miracidia schwankt, aber werden in der Regel durchschnittlich ~ 7000/mL.
10. Wenn Parasiten noch auf die Lichtquelle konzentrieren, wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.9 weiterhin Ernte spät-Schlupf Miracidia aber erhöhen Sie das Zeitintervall zwischen Sammlungen auf 15-20 min zu.
    Hinweis: Diese neue Reihe von Röhren steht die zweite Ernte. Jedoch weil die Miracidial Zahlen in der Regel niedrig sind, sind Larven aus allen Rohren in der Regel in einer einzigen Kultur gut mit 2 mL CBSS + gebündelt.
11. 24 h nach der Ernte und Anbau Aufschwemmen Sie sanft Sporocysts in den Brunnen durch pipettieren.
12. Warten Sie ein paar Minuten um Parasiten, sich an der Unterseite der Brunnen zu ermöglichen. Sobald sie sich niedergelassen haben, entfernen Sie vorsichtig den überstand (~1.5 mL), enthalten die meisten der Nasenfunktion epidermalen Platten Schuppen von Miracidia während der larvalen Transformation. Diese "Verwandlung" überstand kann entweder verworfen oder in Folgestudien Larven sekretorischen Produkte integriert.
13. Jeder Brunnen und sanft Pipette zum Sporocysts Aufschwemmen fügen Sie 1,5 mL frische CBSS hinzu +. Wiederholen Sie Schritt 3.12, wenn weitere waschen oder Umstellung auf ein anderes Medium gewünscht wird.

Ergebnisse

Die überwiegende Mehrheit der Miracidia wird in der Regel in den ersten beiden "ernten" gesammelt wurden. Inkubation von isolierten Miracidia in CBSS + löst den Miracidium-Sporocyst Transformationsprozess (Abbildung 4A- C). Innerhalb der ersten Stunde Brunnen folgende Übertragung auf Kultur mit CBSS +, die meisten Miracidia nicht mehr schwimmen (Abb. 4A). Um 6 Uhr in der Kultur Miracidia sind dabei aktiv shedding...

Diskussion

Miracidia von S. Mansoni, isoliert und manipuliert, wie hier beschrieben nur die Schnecke Zwischenwirt infizieren können und daher repräsentieren keine menschliche Biohazard während dieser Phase der Larvalentwicklung. Jedoch um versehentliche Belichtung/Infektion der Schnecken zu vermeiden, sollte darauf geachtet werden, Miracidial Isolationen an einem anderen Ort aus ausführen wo anfällig Biomphalaria Schneckenarten anwesend oder gepflegt werden können. Ein separater Raum, registriert als BSL2 Raum, wi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chernin's balanced salt solution (CBSS+)			Für 1 l Lösung
>2,8 g Natriumchlorid	Fisher	Scientific S271-3	Salze auflösen, ausgenommen Calciumchlorid, und
0,15 g Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P5405	Zucker in 800 mL ddH2O
0,07 g Natriumphosphat, zweibasisch wasserfrei	Fisher	Scientific S374-500	Calciumchlorid separat in 200
0,45 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Sigma-Aldrich	M1880	mL ddH2O
0,53 g Calciumchlorid-Dihydrat	Mallinckrodt	4160	Langsam Calciumsoln zum Salz-/Zuckersoln geben mit
0,05 g Natriumbikarbonat	Fisher Scientific	S233-3	mit konstantem Mischen
1 g Glukose	MP Biomedicals	152527	Auf pH 7,2 einstellen und mit einem Filter sterilisieren;
1 g Trehalose	Sigma-Aldrich	T0167	0,22 & Mikro; m Einweg-Flaschenfilter
10 mL 100X Penicillin/Streptomycin	Hyclone	SV30010	Fügen Sie gefiltertes Penicillin und Streptomycin Soln  Vorverwendung
unvollständig Bge  Medium (Ibge)			Für 900 mL Lösung
220 mL Schneider" s Drosophila medium modifiziert	Lonza	04-351Q	Schneider's Medium mit 680 mL ddH2O
4,5 g enzymatisches Lactalbumin-Hydrolysat	mischen Sigma-Aldrich	L9010	Lactalbumin-Hydrolysat und Galaktose
1,3 g Galaktose	Sigma-Aldrich	G0625	pH 7,2 einstellen und filtrieren Sterilisieren mit einem 0,22 &μ; m vorsterilisierter Einwegfilter mit Flaschenaufsatz
Complete Bge-Medium (cBge)			Für 100 mL Lösung
>90 mL Unvollständiges Bge-Medium			Zur Hitzeinaktivierung von FBS: Inkubieren Sie aufgetautes FBS in
9 mL fötales Rinderserum (FBS) (Optima)	Atlanta Biologicals	S12450	Wasserbad bei 60°; C für 1 Std., während sanft
1 mL 100X Penicillin/Streptomycin	Hyclone	SV30010	Schwenken der Flasche alle 10 min Aliquot hitzeinaktiviertes FBS in 15-ml-Röhrchen  und lagern bei -20°C.  Mischen Sie Medium + FBS und Filter, sterilisieren Sie mit einem 0,22 & Mikro; m vorsterilisiert  Einweg-Flaschenaufsatzfilter  Vor Gebrauch Penicillin und Streptomycin zugeben
Teichwasser (Stammlösung)			1 l Stammlösung
>12,5 g Calciumcarbonat	Fisher Scientific	C64-500	Alle Salze in 1 l ddH2O
mischen 1,25 g Magnesiumcarbonat	Fisher Scientific	M27-500	Beachten Sie, dass die Salze nicht vollständig
1,25 g  Natriumchlorid	Fisher Scientific	S271-3	gelöst.  Kräftig schütteln, bis es suspendiert ist
0,25 g  Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P5405	Salze vor der Herstellung der Arbeitslösung
Teichwasser (Arbeitslösung)<			stark>1,5 l Lösung
0,8 ml Stammlösung Teichwasser (vor Gebrauch schütteln) in			Mischen Sie das Material mit ddH2O
1500 mL ddH2O			Sterilisieren Sie das Teichwasser durch Autoklavieren (langsam  Zyklus)
1,5 ml 100X Penicillin/Streptomycin		Hyclone SV30010	Fügen Sie Penicillin und Streptomycin zu
Kochsalzlösung (1,2 % NaCl)			1,5 l Lösung
>18 g Natriumchlorid in 1500 ml ddH2O	Fisher Scientific	S271-3	Autoklaven-Kochsalzlösung hinzu, um
1,5 ml 100-fache Penicillin/Streptomycin-Hyclone-SV30010			zu sterilisierenFügen Sie Penicillin und Streptomycin vor Gebrauch hinzu
Zusätzliche Ausrüstung und Material:
	Nr. V001551
CO2Tank und Regler			pathogenfreie
24-Well-Gewebekulturplatte	TPP	92424
1-L-Messkolben
Lichtquelle (150 W)	Chiu Tech Corp	Modell F0-150
Zentrifuge, gekühlt, schwingender Eimer	Eppendorf	Modell 5810R
Zentrifuge Flaschen (250 ml)	Nalgene
15-ml-Zentrifugenröhrchen, steril	Corning	430053
Sterile Einweg-Transferpipetten	Fisher	Scientific 1371120
0,22 &Mikro; m vorsterilisierter Einweg-Flaschenaufsatzfilter	EMD Millipore	SCGPS05RE
Edelstahl-Mixer	Waring Commercial	Model 51BL31
Mixbecher, 100 mL Fassungsvermögen	Waring Commercial
Inverses Mikroskop	Nikon Instruments	Eclipse TE300

Auf 7-L Maus-Euthanasiekammer Gemäß dem genehmigten IACUC-Protokoll Mäuse Taconic Biosciences Swiss-Webster, weiblich, 6 Wochen alt, Maus