Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die groß angelegte axenic Isolierung und Sammlung von freischwimmenden Miracidia der menschlichen Blut Egel Schistosoma Mansoni und deren Weiterverarbeitung für Einführung in die in-vitro- Kultur.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Masse isoliert und In-vitro- Kultivierung von Intramolluscan Stadien der menschlichen Blut Fluke Schistosoma Mansoni
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Menschliches Blut Egel, Schistosoma spp., haben einen komplexen Lebenszyklus, der sexuelle und asexuelle Entwicklungsphasen innerhalb einer Schnecke zwischen- und Säugetieren Endwirt, bzw. beinhaltet. Die Fähigkeit, zu isolieren und Aufrechterhaltung der verschiedenen Lebenszyklusphasen unter in-vitro- Kulturbedingungen hat Untersuchungen der zellulären, biochemischen und molekularen Mechanismen zur Regulierung Parasit Wachstum, Entwicklung und Host erheblich erleichtert. Interaktionen. Übertragung von Schistosomiasis erfordert Ungeschlechtliche Fortpflanzung und Entwicklung mehrere Larvenstadien innerhalb der Schnecke Host; von der infektiösen Miracidium, durch primäre und sekundäre Sporocysts zu cercarial Endstufe, die für den Menschen ansteckend ist. In diesem Beitrag präsentieren wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur Masse Schraffur und Isolierung von Schistosoma Mansoni Miracidia von Eizellen aus Lebern von infizierten Mäusen und ihre nachträgliche Einführung in in-vitro- Kultur. Es wird erwartet, dass das ausführliche Protokoll wird neue Forscher zu betreiben und erweitern diese wichtige Forschungsfeld schistosome-zu fördern.
Einleitung
Das menschliche Blut Egel Schistosoma spp., sind die Erreger der Schistosomiasis, eine vernachlässigte tropische Krankheiten leidet schätzungsweise 230 Millionen Menschen weltweit1. Die am weitesten verbreitete Art, Schistosoma Mansoniist in Südamerika, des karibischen Archipels, Nahost und Afrika südlich der Sahara in Afrika2geografisch verteilt. Der Lebenszyklus von S. Mansoniund andere Schistosomen ist komplex, mit einem Säugetier Definitive Host und Süßwasserschnecken der Gattung Biomphalaria , die als obligate Zwischenwirte dienen.
S. Mansoni m....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren wurden durch die institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss der University of Wisconsin-Madison unter Protokoll genehmigt keine. V005717. Das folgende Protokoll beinhaltet Arbeiten in einer Einrichtung Biosafety Level 2 (BSL2) für menschliche Krankheitserreger, obwohl keiner der schistosome-Stufen dargestellt, die in diesem Protokoll ansteckend für Menschen oder andere Säugetiere sind. Institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Risiko-Gruppe 2 (RG2) menschliche Krankheitserreger zu folgen.
Hinweis: Wir verwenden weibliche Swiss-Webster Mäuse (6 - Wochen alten) aufgrund ihrer höhere....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die überwiegende Mehrheit der Miracidia wird in der Regel in den ersten beiden "ernten" gesammelt wurden. Inkubation von isolierten Miracidia in CBSS + löst den Miracidium-Sporocyst Transformationsprozess (Abbildung 4A- C). Innerhalb der ersten Stunde Brunnen folgende Übertragung auf Kultur mit CBSS +, die meisten Miracidia nicht mehr schwimmen (Abb. 4A). Um 6 Uhr in der Kultur Miracidia sind dabei aktiv shedding.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Miracidia von S. Mansoni, isoliert und manipuliert, wie hier beschrieben nur die Schnecke Zwischenwirt infizieren können und daher repräsentieren keine menschliche Biohazard während dieser Phase der Larvalentwicklung. Jedoch um versehentliche Belichtung/Infektion der Schnecken zu vermeiden, sollte darauf geachtet werden, Miracidial Isolationen an einem anderen Ort aus ausführen wo anfällig Biomphalaria Schneckenarten anwesend oder gepflegt werden können. Ein separater Raum, registriert als BSL2 Raum, wi.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
NIH Grant RO1AI015503 finanziert teilweise. Schistosome-infizierten Mäusen lieferten die NIAID Schistosomiasis Resource Center unter Biomedical Research Institute (Rockville, MD) durch NIH-NIAID Vertrag HHSN272201000005I für den Vertrieb über BEI Ressourcen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | Für 1 l Lösung | ||
| >2,8 g Natriumchlorid | Fisher | Scientific S271-3 | Salze auflösen, ausgenommen Calciumchlorid, und |
| 0,15 g Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P5405 | Zucker in 800 mL ddH2O |
| 0,07 g Natriumphosphat, zweibasisch wasserfrei | Fisher | Scientific S374-500 | Calciumchlorid separat in 200 |
| 0,45 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0,53 g Calciumchlorid-Dihydrat | Mallinckrodt | 4160 | Langsam Calciumsoln zum Salz-/Zuckersoln geben mit |
| 0,05 g Natriumbikarbonat | Fisher Scientific | S233-3 | mit konstantem Mischen |
| 1 g Glukose | MP Biomedicals | 152527 | Auf pH 7,2 einstellen und mit einem Filter sterilisieren; |
| 1 g Trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0,22 & Mikro; m Einweg-Flaschenfilter |
| 10 mL 100X Penicillin/Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Fügen Sie gefiltertes Penicillin und Streptomycin Soln Vorverwendung |
| unvollständig Bge Medium (Ibge) | Für 900 mL Lösung | ||
| 220 mL Schneider" s Drosophila medium modifiziert | Lonza | 04-351Q | Schneider's Medium mit 680 mL ddH2O |
| 4,5 g enzymatisches Lactalbumin-Hydrolysat | mischen Sigma-Aldrich | L9010 | Lactalbumin-Hydrolysat und Galaktose |
| 1,3 g Galaktose | Sigma-Aldrich | G0625 | pH 7,2 einstellen und filtrieren Sterilisieren mit einem 0,22 &μ; m vorsterilisierter Einwegfilter mit Flaschenaufsatz |
| Complete Bge-Medium (cBge) | Für 100 mL Lösung | ||
| >90 mL Unvollständiges Bge-Medium | Zur Hitzeinaktivierung von FBS: Inkubieren Sie aufgetautes FBS in | ||
| 9 mL fötales Rinderserum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | Wasserbad bei 60°; C für 1 Std., während sanft |
| 1 mL 100X Penicillin/Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Schwenken der Flasche alle 10 min Aliquot hitzeinaktiviertes FBS in 15-ml-Röhrchen und lagern bei -20°C. Mischen Sie Medium + FBS und Filter, sterilisieren Sie mit einem 0,22 & Mikro; m vorsterilisiert Einweg-Flaschenaufsatzfilter Vor Gebrauch Penicillin und Streptomycin zugeben |
| Teichwasser (Stammlösung) | 1 l Stammlösung | ||
| >12,5 g Calciumcarbonat | Fisher Scientific | C64-500 | Alle Salze in 1 l ddH2O |
| mischen 1,25 g Magnesiumcarbonat | Fisher Scientific | M27-500 | Beachten Sie, dass die Salze nicht vollständig |
| 1,25 g Natriumchlorid | Fisher Scientific | S271-3 | gelöst. Kräftig schütteln, bis es suspendiert ist |
| 0,25 g Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P5405 | Salze vor der Herstellung der Arbeitslösung |
| Teichwasser (Arbeitslösung)< | stark>1,5 l Lösung | ||
| 0,8 ml Stammlösung Teichwasser (vor Gebrauch schütteln) in | Mischen Sie das Material mit ddH2O | ||
| 1500 mL ddH2O | Sterilisieren Sie das Teichwasser durch Autoklavieren (langsam Zyklus) | ||
| 1,5 ml 100X Penicillin/Streptomycin | Hyclone SV30010 | Fügen Sie Penicillin und Streptomycin zu | |
| Kochsalzlösung (1,2 % NaCl) | 1,5 l Lösung | ||
| >18 g Natriumchlorid in 1500 ml ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoklaven-Kochsalzlösung hinzu, um |
| 1,5 ml 100-fache Penicillin/Streptomycin-Hyclone-SV30010 | zu sterilisierenFügen Sie Penicillin und Streptomycin vor Gebrauch hinzu | ||
| Zusätzliche Ausrüstung und Material: | |||
| Nr. V001551 | |||
| CO2Tank und Regler | pathogenfreie | ||
| 24-Well-Gewebekulturplatte | TPP | 92424 | |
| 1-L-Messkolben | |||
| Lichtquelle (150 W) | Chiu Tech Corp | Modell F0-150 | |
| Zentrifuge, gekühlt, schwingender Eimer | Eppendorf | Modell 5810R | |
| Zentrifuge Flaschen (250 ml) | Nalgene | ||
| 15-ml-Zentrifugenröhrchen, steril | Corning | 430053 | |
| Sterile Einweg-Transferpipetten | Fisher | Scientific 1371120 | |
| 0,22 &Mikro; m vorsterilisierter Einweg-Flaschenaufsatzfilter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Edelstahl-Mixer | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Mixbecher, 100 mL Fassungsvermögen | Waring Commercial | ||
| Inverses Mikroskop | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
Referenzen
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
