Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Embryonale Stammzellen (ES) haben das Potenzial, sich in eines der drei mikrobeschichten (Entoderm, Mesoderm und Ektoderm) differenzieren und erzeugen viele Linien für die regenerative Medizin. ES Zelle Kultur in Vitro seit langem Gegenstand weit verbreitete Bedenken. Klassisch, Maus-ES-Zellen in Serum und Leukämie hemmenden Faktor (LIF) gepflegt werden-Medium enthält. Allerdings Bedingungen Serum/LIF Zellen zeigen Heterogenität in Morphologie und das Expressionsprofil von Pluripotenz-Genen und sind meist in einem metastabilen Zustand. Darüber hinaus kultivierte ES-Zellen zeigen globale Hypermethylation, aber naiv ES-Zellen der inneren Zellmasse (ICM) und primordialen Keimzellen (PGCs) sind in einem Zustand der globalen Hypomethylierung. Der hypomethyliert Zustand des ICM und PGCs ist eng verbunden mit ihrer Pluripotenz. Zur Verbesserung der Maus-ES Zelle Kulturmethoden entwickelten wir vor kurzem eine neue Methode basiert auf der gezielt kombinierte Nutzung von zwei kleine Molekül-Verbindungen, die DNA-hypomethyliert und pluripotenten Zustand zu halten. Hier präsentieren wir die Mitbehandlung von Vitamin C (Vc) und PD0325901 können etwa 90 % der 5-Methylcytosine (5mC) an 5 Tagen in ES-Zellen löschen. Der generierte 5mC Inhalt ist vergleichbar mit dem in PGCs. Die mechanistische Untersuchung zeigt, dass PD0325901 bis Prdm14 Ausdruck Dnmt3b unterdrücken regelt (de Novo DNA-Methyltransferase) und Dnmt3l (der Cofaktor von Dnmt3b), durch die Reduzierung 5mC- de-Novo -Synthese. VC erleichtert die Umstellung der 5mC auf 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) katalysiert hauptsächlich durch Tet1 und Tet2, zeigt die Einbindung der passiven und aktiven DNA-Demethylations. Darüber hinaus zeigen ES-Zellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen, homogene Morphologie und pluripotenten Zustand. Gemeinsam schlagen wir eine neuartige und Chemikalie-Synergie-Kultur-Methode für DNA-Hypomethylierung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Maus-ES-Zellen zu erreichen. Die kleine Molekül chemisch-abhängige Methode überwindet die größten Schwächen der Serum-Kultur und hält Versprechen, homogene Embryonaler Stammzellen für weitere klinische Anwendungen und Forschungen zu generieren.
Einleitung
ES-Zellen stammen vom ICM einer Blastozyste1. Die Zellen sind in einem Zustand der Pluripotenz und alle somatischen Abstammungen und Germline Zellen2bilden können. Einrichtung von ES-Zellen bietet die Möglichkeit zur Entwicklung zu untersuchen in-vitro- Verfahren und medizinische Relevanz für die regenerative Medizin, basierend auf ihre Pluripotenz3Zellen zu generieren.
Zwei Gruppen seminally der Maus-ES-Zell-Linien im Jahr 1981 gegründet und wenn Zellen aus der frühen Maus-Embryo im fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert wurden-mit Medium mit Maus embryonalen F....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Vorbereitungen
-
Bereiten Sie eine Lösung von 1,0 mM PD0325901 (MEK-Inhibitor) und 3,0 mM CHIR99021 (GSK3-Hemmer).
- Wiegen Sie 2 mg PD0325901 und 4,15 mL DMSO in eine Braunglas-Fläschchen.
- Wiegen Sie 2 mg CHIR99021 und 1,43 mL DMSO in eine Braunglas-Fläschchen.
- Folgende Wiederherstellung speichern Aliquote (50 µL/Rohr in 200 µL PCR-Röhrchen) bei-20 ° C und vor Licht geschützt werden. Ein Röhrchen mit den gefrorenen bestand aus einem Gefrierschrank und Auftauen bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu entfernen.
- 0,0176 g Vc in ein Zentrifugenröhrchen 1 mL wiegen und mit 1 mL sterilem Wasse....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
VC/PD0325901 induzierte synergistisch globale Löschung von ES-Zellen. Maus Embryonische Stammzellen im Serum weisen DNA Hypermethylation, während ICM pluripotenten Zellen und PGCs globale Löschung der DNA-Methylierung zeigen und der hypomethyliert Staat eng verbunden mit ihrer Pluripotenz9,10 ist.
Zuvor fanden wir und andere, dass Vc Tet-vermittelten 5mC Demethylierung
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
In der Arbeit haben wir eine neuartige Methode der Kombination von Vc und PD0325901 um Maus-ES-Zellen in einem undifferenzierten und hypomethyliert Zustand aufrecht zu erhalten, die durch eine synergistische Wirkung der Förderung der DNA Demethylierung von Vc und unterdrücken de Novo DNA erreicht wurde gezeigt. Methylierung von PD0325901. Darüber hinaus zeigte ES-Zellen große Morphologie unter dem Vc/PD0325901-Kultur-System.
Um besser den Zustand der Maus-ES-Zellen in das Vc/PD0325901.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (21435008 und 21327006, h.w.) und die strategische Priorität Forschungsprogramm von der chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB14030200, HW).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| fötales Rinderserum Australien Quelle | Corning | 35-076-CV | Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus |
| DMEM/hoher Glukosegehalt | Hyclone | SH30022 | Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus |
| nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) | Gibco | Bestandteil des ES-Zellmediums | |
| Natriumpyruvat | Gibco | Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030081 | Bestandteil des Medium der ES-Zelle der Maus |
| Penicillin Streptomycin Lösung | Gibco | 15140122 | Bestandteil des ES-Zellmediums der Maus |
| PBS | Sigma | P5493 | Zellen spülen |
| Trypsin-Hyklon | SH30042 | Zelldissoziation | |
| Gelatine | Sigma | 48722 | Schalenbeschichtung |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | niedermolekulare Chemikalie für die Zellkultur |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | niedermolekulare Chemikalie für die Zellkultur |
| Vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | XW00508171 | niedermolekulare Chemikalie für die Zellkultur |
| Ultra Bioscience Wasseraufbereitungssystem | Purelab | Ultra | Ultra Wasser |
| DMSO Sigma | D8418 | des Zellgefriermediums | |
| Eppendorf | 5427R | DNA- und Proteinextraktion | |
| Proteaseinhibitor-Cocktail | Sigma | P8340 | Bestandteil des RIPA-Puffers |
| PMSF Proteaseinhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Bestandteil des RIPA-Puffers |
| DTT | Sigma | 43815 | Bestandteil des RIPA-Puffers |
| EGTA | Sigma | E3889 | Bestandteil des RIPA-Puffers |
| Aufreinigungskit für genomische DNA | Promega | A1125 | Genomische DNA-Extraktion |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Bestimmung der DNA-Konzentration |
| Kälberdarmphosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA-Verdau |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA-Verdau |
| Schlangengift Phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA-Aufschluss |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | Filtration von verdauter DNA |
| 1290 UHPLC-System | Agilent | 1290 | UHPLC-Trennung |
| G6410B Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer | Agilent | G6410B | MS/MS-Analyse |
| Zorbax Eclipse Plus C18 Säule | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | Säule für UHPLC-Abscheidung |
| 5-Methylcytosin | Solarbio Life Sciences | SM8900 | Standard 5mC |
| 5-Hydroxymethylcytosin (Standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | Standard 5hmC |
| Prdm14 Antikörper | Bioworld | BS7634 | Western-Blot-Analyse-Primärantikörper |
| Dnmt3a-Antikörper | Bioworld | BS6587 | Western-Blot-Analyse-Primärantikörper |
| Dnmt3b-Antikörper | abcam | ab13604 | Western-Blot-Analyse-Primärantikörper |
| Dnmt3l Antikörper | abcam | ab3493 | Western-Blot-Analyse-Primärantikörper |
| Dnmt1 Antikörper | abcam | ab13537 | Western-Blot-Analyse-Primärantikörper |
| β-Tubulin-Antikörper | Bioworld | BS1482MH | Western-Blot-Analyse-Primärantikörper |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG | abcam ab6721 | Western-Blot-Analyse-Sekundärantikörper | |
| Anti-Maus-IgG-Abcam | ab6789 | Western-Blot-Analyse-Sekundärantikörper | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA-Extraktion |
| Reverse-Transkriptionssystem | Promega | A3500 | RNA-Reverse-Transkription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG Färbung und Aktivität Assay-Kit für alkalische Phosphatase | Zellen Biolabs, Inc. | CBA-302 | Analyse der alkalischen Phosphatase-Färbung |
| ES-Zellen der Maus: WT, 129 SvEv | Zur Verfügung gestellt von Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | Zellstamm von ES-Zellen der Maus | |
| Mikroskop | Zeiss | LSM510 | Zellbeobachtung |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | Statistische Auswertung |
Referenzen
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
- Murry, C. E., Keller, ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
