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Methodenartikel

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

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DOI:

10.3791/56411

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9. November 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Zusammenfassung

Chemotaxis oder Migration eine Steigung von einem Lockstoffgradient ist die am besten verstanden gerichtete Migration. Studien über soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum ergab, dass ein komplexes Signal Transduction Netzwerk von parallelen Bahnen die Reaktion auf Chemoattractants verstärkt und zu voreingenommen Aktin-Polymerisation und Vorwölbung des Pseudopod in führt der Richtung eines Verlaufs. Im Gegensatz dazu sind die molekulare Mechanismen fahren andere Arten von gerichtete Migration, z. B. durch Einwirkung von Strom oder elektrische Felder, Scheren nicht bekannt. Viele Regulatoren der Chemotaxis Lokalisierung am führenden oder rückständigen Rand einer wandernden Zelle aufweisen, sowie vorübergehende Änderungen in Lokalisierung oder Aktivierung nach globalen Stimulation mit einer Lockstoffgradient zu zeigen. Um zu verstehen, die molekularen Mechanismen der anderen Arten von gerichtete Migration entwickelten wir eine Methode, die Untersuchung der zellulären Reaktion auf akute mechanische Stimulation basierend auf kurze (2 bis 5 s) Exposition, Flow zu scheren ermöglichen. Diese Stimulation kann in einem Kanal geliefert werden, während der Bildgebung Zellen Eindringmittel beschriftet Biosensoren untersuchen einzelne Zelle Verhalten zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus kann Zellpopulation angeregt werden, in einen Teller, lysiert, und Immunoblotted mit Antikörpern, die aktive Versionen der interessierenden Proteine erkennen. Durch die Kombination beider Assays, kann man eine Vielzahl von Molekülen, die durch Veränderungen der subzellulären Lokalisierung und/oder Phosphorylierung aktiviert untersuchen. Mit dieser Methode haben wir festgestellt, dass akute mechanische Stimulation Aktivierung der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netze auslöst. Die Möglichkeit zu prüfen, zelluläre Reaktionen auf akute mechanische Stimulation ist wichtig für das Verständnis der auslösenden Ereignisse notwendig für Scherung strömungsinduzierte Motilität. Dieser Ansatz bietet auch eine Tool für das Studium der chemotaktische Signal Transduction Netzwerk ohne verwirrende Einfluss des Lockstoffgradient-Rezeptors.

Einleitung

Migration von eukaryotischen Zellen ist durch unterschiedliche chemische und physikalische Hinweise in der Umgebung, einschließlich Steigungen von löslichen oder Substrat gebunden Chemoattractants, variabler Steifigkeit der Substrate, elektrische Felder oder Schubfluss vorgespannt. Zwar gab es viele Fortschritte in unserem Verständnis der molekularen Mechanismen fahren Chemotaxis, weniger ist bekannt über andere Arten von gerichtete Migration und wie diese vielfältigen Signale auf zellulärer Ebene zu einer einheitlichen produzieren integriert sind wandernde Antwort.

Migration in Richtung einer zunehmenden Konzentration von einem Lockstoffgradient umfasst drei Verhaltens Komponenten gerichtet: Motilität, direktionale sensing und Polarität1. Motilität bezieht sich auf zufällige Bewegung der Zellen durch Pseudopod Vorsprung erreicht. Gerichtete Sensorik ist die Fähigkeit einer Zelle, die Ursache für eine Lockstoffgradient zu ermitteln, die auftreten können, auch in Zellen immobilisiert. Polarität bezieht sich auf die stabiler asymmetrische Verteilung der intrazellulären Komponenten zwischen den führenden und rückständigen Rand einer Zelle, führt zu erhöhten Persistenz in Bewegung.

Zelluläre Reaktion auf eine Lockstoffgradient hängt von der Aktivität von vier konzeptionell definierte Regulationsnetzwerke: Rezeptor / G Protein, Signaltransduktion, Aktin-Zytoskelett und Polarität1. Lockstoffgradient Bindung an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor überträgt das Signal über Heterotrimeric G Proteine α und βγ auf die nachgeschalteten Signaltransduktion Netzwerk, das die Richtungs-Signal verstärkt. Mehrere Wege innerhalb des Netzwerks Signal Transduction parallel agieren und fließen in das Aktin Zytoskelett Netzwerk Bias Aktin-Polymerisation und konsequente Pseudopod Vorsprung, in die Richtung des Farbverlaufs. Unter wichtige Regulatoren der Chemotaxis sind Ras GTPase, TorC2, Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K), Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) und Guanylyl Cyclase. Feedback-Mechanismen innerhalb des Signal-Transduktion-Netzwerks und zwischen der Signaltransduktion und Aktin-Zytoskelett-Netzwerke weiter verstärken die Reaktion. Schließlich, das schlecht definierte Polarität Netzwerk erhält Eingaben aus dem Aktin-Zytoskelett und weitere Vorurteile Signal Transduction Netzwerk zur Förderung der anhaltenden Migration in die Richtung des Farbverlaufs.

Ein Großteil unserer mechanistisches Verständnis der Chemotaxis wurde aufgrund der Entwicklung von Eindringmittel getaggt Biosensoren für verschiedene Komponenten des regulatorischen Netzwerken ermöglicht. Viele Chemotaxis Regulatoren haben eine asymmetrische Verteilung der regulatorischen Molekül selbst oder seine Tätigkeit. Z. B. Biosensoren, die erkennen aktiviert Versionen von kleinen GTPases Ras und Rap1-Ras-bindende Domänen von Raf1 (bezeichnet als RBD hier) und RalGDS, bzw. – zu lokalisieren, an der Vorderkante der Chemotaxing Zelle2,3. In ähnlicher Weise PI3K und seine Produkt Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphate (PIP3), anerkannt durch eine Pleckstrin Homologie (PH) Domäne zeigen auch Lokalisierung an der Vorderseite der Zelle4,5. Im Gegensatz dazu eine 3-Phosphatase PTEN, wandelt die PIP3 zurück zu Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate, lokalisiert an den rückständigen Rand der Zelle6. Wichtig ist, ändern Sie diese Biosensoren ihrer Lokalisation in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient. Vorderkante Marker, die cytosolische oder relocalize an den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zelle zum Kortex, während Rand Marker, hinkt die kortikalen Lokalisierung und Fehlen von den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zellen werden nach der cytosolischen die Stimulation. Analyse der Biosensor Verteilung in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient minimiert den Beitrag der Motilität und Polarität, die oft die Beobachtungen zu verwirren. Global oder gleichmäßige Stimulation eine Zellsuspension mit einem Lockstoffgradient ist auch als Werkzeug zur bevölkerungsweite Veränderungen in Protein-Aktivierung, oft röntgenologisch Protein Phosphorylierung7,8,9 . Diese biochemischen Assay dient vor allem zeitliche Informationen zu während Mikroskopie verwendet wird, um zeitliche und räumliche Informationen über das Verhalten der verschiedenen Komponenten des regulatorischen Netzwerken zu sammeln.

Das Signal Transduction Netzwerk enthält Merkmale eines erregbar System10,11. Reaktionen auf supra-Schwelle chemotaktische Reize sind "verdeutlichen" und feuerfeste Perioden anzeigen. Antworten sind auch stochastisch ausgelöst und oszillierenden Verhalten zeigen können. Signal-Transduktion Ereignisse sind in Regionen des Cortex lokalisiert, die wie Wellen12,13,14,15zu propagieren. Vorne, zurück, Marker zu rekrutieren oder distanziert, die aktiven Zonen der propagierende Wellen. Aufgrund der feuerfesten Region hinter der aktiven Zone vernichten die entgegengesetzt gerichteten Wellen treffen. Die verbreitende Signal Transduction Wellen unterliegen die zelluläre Vorsprünge, die Zelle Migration10vermitteln.

Viele der genannten Informationen über Chemotaxis kam aus den Studien auf die soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum, obwohl ähnliche Regulationsmechanismen auch auf Neutrophilen und andere Säugetier-Zelle Arten16 anwendbar sind . Dictyostelium ist ein gut etabliertes Modellorganismus, der hat eine robuste chemotaktische Reaktion während der Hungersnot, wenn Tausende von einzelnen Zellen in einer Aggregation Mitte, schließlich bildet eine vielzellige Fruchtkörper mit Sporen migrieren. Chemotaxis ist auch während der einzelligen Wachstumsphase dieses Organismus zur Ortung von bakteriellen Nahrungsmittelquellen wichtig. Wichtig ist, ist die Migration von Einzelzellen Dictyostelium bemerkenswert ähnlich wie die Migration von Säugetieren Neutrophile oder metastatischen Krebszellen, die sehr schnelle amöboiden Typ Migration zu unterziehen. In der Tat sind sowohl die allgemeine Topologie der regulatorischen Netzwerke, sowie viele der einzelnen Transduktion Signalwege beteiligt Chemotaxis zwischen Dictyostelium und Säugetieren Leukozyten17konserviert. Darüber hinaus nutzen andere Zellen, wie Fibroblasten, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) anstelle von GPCRs; jedoch kann RTKs in ähnliche Netze einspeisen.

Im Gegensatz zur Chemotaxis fehlt gründliches Verständnis der Signalisierung Mechanismen, die verschiedenen Verkehrsträger gerichtete Migration zu fahren. In ähnlicher Weise auf Zellen in einem Lockstoffgradient Verlauf migrieren mehrere Studien haben berichtet Aktivierung und/oder Lokalisierung von typischen Vorderkante Markierungen, einschließlich Aktin-Polymerisation, PIP3 und/oder extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) 1/2, bei der Vorderseite der Zellen gerichtet Migration als Reaktion auf Flow oder Änderungen in elektrischen Feldern18,19,20,21zu scheren. Führte jedoch in diesen Studien Dauerbelastung auf den Stimulus auch Zellwanderung, lassen offen die Frage, ob beispielsweise die Vorderkante Marker speziell in Reaktion auf einen Reiz zu lokalisieren, oder wenn sie einfach an der Vorderkante zu lokalisieren aufgrund erhöhten Anzahl von Scheinfüßchen an der Vorderseite des eine wandernde Zelle.

Wir entwickelten Assays, die uns erlauben, die Reaktion der Zellen auf akute mechanische Störung geliefert als Schubfluss sowohl auf Bevölkerungsebene sowie Einzelzellen22zu beobachten. Ähnlich wie bei globalen Stimulation mit einem Lockstoffgradient, akute stimulaTion mit Schubfluss ermöglicht die Studie eine zelluläre Reaktion auf einen mechanischen Reiz ohne verwirrende Beitrag von Motilität oder Polarität. Kombinieren diese mikroskopische und biochemische Tests mit genetischen oder pharmakologische Störungen ermöglicht es uns, erfahren über wie mechanische Reize wahrgenommen werden und übermittelt werden. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz auch eine neuartige Methode zur Erschließung des Systems unterhalb des Lockstoffgradient-Rezeptors in Ermangelung eines Lockstoffgradient, damit das Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netzwerke aus dem Rezeptor/G zu isolieren Protein-Netzwerk.

Mit den Techniken, die wir kürzlich beschriebenen demonstrierte, dass akute Scherbeanspruchung führt zu Aktivierung mehrerer Komponenten der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke22. Durch die Anwendung des akute mechanischen Reizes in unterschiedlichen Abständen, haben wir bewiesen, dass in ähnlicher Weise zu Chemoattractants, Reaktion auf mechanische Reize auch bietet eine erregbare Systems, einschließlich das verdeutlichen Verhalten die Reaktion unter Ausstellungen Bedingungen und das Vorhandensein von einer Refraktärzeit zu sättigen. Durch die Kombination von mechanischen und chemischen Stimulation haben wir schließlich gezeigt, dass die beiden Reize teilen Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke, die wahrscheinlich für die Integration von mehreren reizen, Bias Zellwanderung ermöglichen.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Lösungen

  1. bereiten HL-5 Medien mithilfe der folgenden: 10 g/L Traubenzucker, 10 g/L Proteose Pepton, 5 g/L Hefeextrakt, 0,965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 PO-4, und, sofern nicht anders angegeben, 0,03 g/L Streptomycin in entionisiertem Wasser. Autoklaven Medium und bei Raumtemperatur lagern.
    Hinweis: Aufgrund der Unterschiede zwischen Proteose Pepton und Hefe-Extrakt von verschiedenen Anbietern erworben sowie zwischen einzelnen Chargen, pH-Wert des Mediums müssen möglicherweise auf die typische Reichweite von 6,4 bis 6,7 eingestellt werden.
    2. Vorbereitung SM Platten unter Verwendung der folgenden
  2. : 10 g/L Traubenzucker, 10 g/L Pepton, 1 g/L Hefe-Extrakt, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 und 20 g/L Agar in entionisiertem Wasser. Autoklaven, abkühlen und gießen Sie 30 mL der Agar-Lösung pro 10 cm Petrischale. Sobald der Agar erstarrt, speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
  3. Vorbereitung 10 x Phosphat-Puffer (PB) mit 13,4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O und 6,8 g/L KH 2 PO 4 in entionisiertem Wasser. Speichern den 10-fach bestand bei 4 ° C. verdünnt, 1 X mit entionisiertem Wasser für den Gebrauch.
  4. Bereiten DB Puffer durch die Ergänzung 1 X PB mit 2 mM MgSO 4 und 0,2 mM CaCl 2.
  5. Vorbereiten 100 mM Koffein in entionisiertem Wasser. Lagerung bei − 20 ° c
  6. Vorbereiten 100 mM Lager Stammlösung durch cAMP Natrium-Salz-Monohydrat in entionisiertem Wasser auflösen. Bereiten Sie eine 1 mM Lager in entionisiertem Wasser arbeiten. Speichern sowohl Stammlösungen bei − 20 ° C. Prepare endgültige cAMP Lösung auf die gewünschte Konzentration in DB am Tag des Experiments.
    Bemerkung: Stock Solutions kann einfrieren aufgetaut einigemal.
  7. Vorbereiten 25 mM Folsäure 1 x PB. Fügen Sie einige Tropfen von 1 N NaOH, bis das Pulver vollständig auflöst. Lagerung bei − 20 ° c
  8. 3 X Probenpuffer unter Verwendung der folgenden vorbereiten: 187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 30 % Glycerin, 126 mM Dithiothreitol und 0,03 % (w/V) Bromophenol blue. Aliquoten und Shop unter − 20 ° c
    1. Vor zu verwenden, in einem 37 ° C Wasserbad Auftauen und fahren mit Probenpuffer mit Protease und Phosphatase-Hemmer durch Verdünnen 3 x Probenpuffer auf 1 X, und Hinzufügen von 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 25 mM Natrium Pyrophosphat und 1 X vorbereiten komplette EDTA-freie Protease-Inhibitor cocktail in entionisiertem Wasser. Hinzufügen die Inhibitoren sofort vor dem Start der Prozedur beschriebenen Schritte 3.1.2-3.1.3.
  9. 5 mM Latrunculin A Lösung in DMSO vorzubereiten. Aliquoten und Shop unter − 20 ° c

2. Vorbereitung von D. Discoideum Zellen

Hinweis: Erhaltung D. Discoideum Zellen in HL-5 Medien entweder in Gewebekultur Teller oder in einer Suspension Kultur wie oben beschrieben 23. Im Bedarfsfall Zellen Transformation mit Gewebekulturen beschriftet Biosensoren entsprechend standard Elektroporation Protokolle 24. Verschiedene Stämme von D. Discoideum sowie Plasmide Codierung Biosensoren oder andere Gene von Interesse erhalten Sie von der Dicty Stock Center (dictybase.org).

  1. Wachstum und Auflistung der vegetativen D. Discoideum Zellen
    1. für die Analyse der vegetativen Zellen wachsen Zellen in Anwesenheit von Bakterien zu reduzieren Sie die Anzahl der Macropinosomes, die in der Regel in zu beobachten sind axenically gewachsen Zellen 25.
      1. Bereiten Sie eine Kultur der Klebsiella Aerogenes von einer kleinen Anzahl von Zellen aus einem Glycerin-bestand oder aus einer früheren Kultur in das gewünschte Volumen der HL-5 Medium ohne Antibiotika zu impfen. Inkubieren Bakterienkultur auf einem Orbitalschüttler bei 200 u/min (0,42 x g) bei Zimmertemperatur (20-22 ° C) für 16-18 h
        Hinweis: Die K. hier verwendete Aerogenes-Stamm ist nicht-pathogenen (siehe die Tabelle of Materials).
    2. D. Discoideum in der exponentiellen Wachstumsphase zu sammeln, Gewebekultur Platten oder aus einer Suspensionskultur, und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer laut Hersteller ' Anweisungen. 1 x 10 5 D. Discoideum Zellen mit 260 µL K. Aerogenes Federung auf einer SM-Platte zu verbreiten. Drehen Sie die Platte auf dem Kopf nach unten am nächsten Tag. Zellen bei Raumtemperatur zu wachsen, bis die D. Discoideum Zellen beginnen Löschen des bakteriellen Rasens aber bevor sie aggregieren anfangen (~ 36-48 h).
    3. Sammeln D. Discoideum Zellen in 5 mL DB Puffer durch Kratzen sie mit einem Glas-Spreader. Übertragen Sie Zellen auf einem 50 mL-Polypropylen-Rohr. Spülen Sie die Platte mit einem anderen 5 mL DB-Puffer und Pool mit der originalen Federung. Füllen Sie das Rohr bis 50 mL mit DB Puffer.
    4. Zentrifuge D. Discoideum Aussetzung bei 360 X g für ca. 3-4 min. Überstands Aspirieren und Aufschwemmen das Pellet in 50 mL DB-Puffer. Wiederholen Sie Waschschritten bis der Überstand ist klar (~ 3-4 Wäschen). Die letzte Zelle Pellet in DB-Puffer zu einer endgültigen Dichte von ~ 5 x 10 6 Zellen/mL Aufschwemmen.
  2. Vorbereitung der Aggregation-zuständigen D. Discoideum Zellen
    1. Entwicklung D. Discoideum Zellen durch 1 h verhungern, gefolgt von 4 h an Hunger und mit 50 nM cAMP pulsieren alle 6 min nach Norm Protokolle 23.
    2. Nach Entwicklung, Messen der letzte Band der Zellsuspension.
    3. Bezogen auf die ursprüngliche Anzahl der für die Entwicklung verwendeten Zellen berechnen Zelldichte der endgültigen Aufhebung.
      Hinweis: Wenn alle 6 min. cAMP in 100 µL Bänden geliefert wird, erhöht Zellvolumen von 1 mL für jede Stunde des Lagers pulsieren. Also für die Standardkonditionen mit 8 x 10 7 Zellen in 4 mL DB, nach 4 h der Entwicklung ist das Endvolumen 7 mL und die endgültige Zelldichte ~1.1 X 10 7 Zellen/mL.

3. Biochemische Analyse der Zelle als Reaktion auf mechanische oder chemische Stimulation

    1. Platte 2 x 10 6 Aggregation-kompetente Akute mechanische Stimulation der Zellen gefolgt von Zelle Lysis Zellen (aus Schritt 2.2) nach 4 h Entwicklung im 35-mm-Schalen mit 2 mL DB. Lassen Sie die Zellen, die für 10 min bei Raumtemperatur zu befestigen. Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 mL DB. Zellen in DB mit 2,5 mM Koffein für 30 min ohne Störung der Platten inkubieren.
      Hinweis: Wenn Zellen mit einem pharmakologischen Inhibitor behandelt werden müssen, fügen gewünschte Konzentration des Inhibitors oder die gleiche Menge an geeigneten Fahrzeug während Basalation mit Koffein.
    2. Anzuwendende mechanische Stimulation, die Platte (einzeln nacheinander) auf einem Orbitalschüttler und schalten Sie ihn sofort mit 150 u/min (0,24 x g) für 5 s.
      Hinweis: Die Platte kann auch manuell stimuliert werden durch Bewegung in gewissem Sinne kreuzweise für ca. 5 s.
    3. Absaugen der Puffer zu den o.g. Zeiten nach dem Beginn der Stimulation. Sofort lösen die Zellen durch Zugabe von 100 µL Probenpuffer mit Phosphatase, Protease-Inhibitoren.
    4. Die Platte auf Eis, und sammeln Sie die lysate in eine 1,5-mL-Tube. Für ' Zeit 0 ', lösen die Zellen ohne schütteln. Übertragen Sie die Röhren auf einem Heizblock 95 ° C für 10 min unmittelbar nach Lyse. Fahren Sie mit Immunoblotting oder speichern Lysates bei-20 ° c
  2. Stimulation von Zellen mit einem Lockstoffgradient
    1. Basalate-Aggregation-kompetente Zellen nach 4 h der Entwicklung durch Schütteln sie schnell in Anwesenheit von 5 mM Koffein bei 200 u/min (0,42 x g) auf einem Orbitalschüttler für 30 Minuten.
      1. Zentrifuge die Zellsuspension bei 360 X g für ca. 3-4 min. Überstands Aspirieren und Aufschwemmen das Pellet in 10 mL eiskaltes DB-Puffer. Wiederholen Sie den Waschschritt.
    2. Aufschwemmen der letzten Zelle Pellet im eiskalten DB-Puffer zu einer endgültigen Dichte von 4 x 10 7 Zellen/mL bezogen auf die erste Zelle Anzahl verwendet, um die Zellen zu entwickeln (siehe Punkt 2.2). Halten Sie die Zellsuspension auf dem Eis vor stimulAtion.
      1. Pipette 50 µL 10 µM cAMP oder Fahrzeug in eine Polystyrol Tasse platziert auf einem Orbitalschüttler.
    3. Um die Zellen zu stimulieren, 450 µL der eiskalte Zellsuspension in die gleiche Tasse hinzufügen und sofort den Shaker schalten bei 200 u/min (0,42 x g). Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Stimulation (z. B. 10, 30, 45, 60, 120 s), kurz den Shaker zu stoppen, nehmen Sie 50 µL-Aliquots der Zellsuspension, und lösen Sie die Zellen, indem sie 1,5 mL Röhrchen mit 25 µL 3 X Probenpuffer hinzugefügt.
      1. Für ' Zeit 0 ', verwenden Sie die Zellen aus der unstimulierte eiskalte Zellsuspension.
        Hinweis: Die Endtemperatur der Zellsuspension während der Stimulation ist ~ 9 ° C 26. Unter diesen Bedingungen tritt die Spitze Antwort etwas später als der Höhepunkt für die Stimulation durchgeführt bei Raumtemperatur (z. B. Lockstoffgradient Stimulation der adhärenten Zellen am Mikroskop oder mechanische Stimulation des adhärenten Zellen) beobachtet.
    4. Die Rohre auf einem Heizblock 95 ° C für 10 min sofort nach Lyse übertragen. Fahren Sie mit Immunoblotting oder speichern Lysates bei-20 ° c
  3. Analyse des Zell-Antwort durch Immunoblotting
    1. Lysaten (von Schritten 3.1.3 oder 3.2.4) auf ein 4-15 %-Tris-HCl-Polyacrylamid-Gel laufen, übertragen auf ein Polyvinylidene Fluorid Membran, Block und Immunoblot mit Phospho-PKC Ζ Thr410 (zur Erkennung von Phospho-PKBR1 und Phospho-PKBA). Erkennen das Signal durch Inkubation mit Meerrettich Peroxidase konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper, gefolgt von Chemolumineszenz mit verstärkte Chemilumineszenz Substrat.
    2. Für die Erkennung von mehreren Proteinen Streifen den Blot mit stripping Buffer und Sonde erneut mit einem primären Antikörper gegen Phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (, Phospho-ERK2 zu erkennen). Bestätigen Sie gleich Protein durch Färbung der Polyvinylidene Fluorid Membran mit Coomassie Brilliant Blue laden.

4. Akute mechanische Stimulation und Live-Imaging von Einzelzellen am Mikroskop

  1. Bewertung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit einem Flow-Gerät
    1. sammeln und verdünnen vegetativen oder Aggregation-kompetente Zellen bis ~ 1 x 10 6 Zellen/mL in DB wie in 2.1 und 2.2, bzw. beschrieben. ~ 600 µL in die Folie mit einem Kanal zu laden (siehe Tabelle Material für Details). Können Sie Zellen zu legen für 10 min. stellen sicher, dass alle Buchten auf der Folie vollständig gefüllt sind. Zusätzlichen Puffer bei Bedarf nachfüllen.
      Hinweis: Die Folie für die Analyse verwendet verfügt über drei Eingänge, die in engen, 1 mm Kanäle zu ernähren, aber dann verschmelzen zu einem breiten, 3 mm Kanal. Die Höhe des Kanals beträgt 0,4 mm. Obwohl die Zellen in den Kanal überzogen sind, wird nur der Breite Teil abgebildet.
    2. Pass eine der Linien, die eine 50-mL-Reservoir durch die vorderen rechten Ventil des Referats fluidische zugeordnet ist (siehe die Tabelle der Materialien für Details). Mit der Software für die Pumpe, achten Sie darauf, das Ventil ist geschlossen (d.h. auf der linken Seite). Füllen Sie den Tank mit der DB.
      1. Druck bei 50 Mbar einstellen und einschalten. Füllen Sie und spülen Sie die Zeile mit der DB durch Klicken auf das Ventil zu öffnen. Drehen Sie den Druck wieder auf 0, und schließen Sie das Ventil nach ~ 30 s.
    3. Schließen Sie die Leitung eines der drei Buchten auf der einen Seite der Folie ohne Luftblasen abfangen. Stecken Sie die zwei Buchten. Die Linie aus dem Abfluss zu verbinden, mit dem einzigen Einlass auf der zweiten Seite der Folie.
      Hinweis: Die Schläuche für die Eingabe und Abfluss Linien in diesem Setup verwendet hat einen Innendurchmesser von 1,6 mm.
    4. Legen Sie die Folie auf dem Mikroskop unter einem 20 X Luft Ziel. Um den Kanal zu spülen, wechseln Sie das Ventil, um die Linie zu öffnen, und klicken Sie auf " Druck ON ", beginnend bei höheren Druck (~ 50 Mbar oder ~ 40 dyn/cm 2), die Flüssigkeit zum Abfluss durchzusetzen.
      1. Sobald die Flüssigkeit aus dem Abfluss kommt, Druck von außen auf Null reduzieren (i.e. Schwerkraft fließen nur ~ 15 dyn/cm 2), und weiter Spülen für ~ 30 S. Switch das Ventil in die gegenüberliegende Position zu unterbrechen.
    5. Bilder mit RFP oder GFP-Beleuchtung auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop unter einen 40 X Öl Ziel 3 s Abständen zu erwerben. Mit dem Ventil in der geschlossenen Position, schalten Sie den Druck auf den gewünschten Druck, in der Regel zwischen 15 und 40 dyn/cm 2 (0 - 50 Mbar).
    6. Nach der Übernahme von 5 Bildern, liefern die Impulse durch Umschalten des Ventils der " öffnen " Position. Schalten Sie den Fluss aus nach 2-5 s durch Umschalten des Ventils in die entgegengesetzte Richtung.
      Hinweis: Für bestimmte schwächere Biosensoren (z.B. PTEN, CynA und RalGDS) es möglicherweise notwendig, mit einem konfokalen Mikroskop verfügt über einen 40 X Öl Ziel Bildzellen.
  2. Testing Effekte von pharmakologischen Inhibitoren auf Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit einem Flow-Gerät
    1. Zellen in der Folie mit einem Channel Plate, wie unter Punkt 4.1.1 beschrieben. Richten Sie zwei Linien: eine Linie durch die vordere richtige Ventil wie in Schritt 4.1.2, übergeben und die zweite durch die Hintertür verlassen Ventil. Klemmen Sie die linke Linie und das Ventil in den " geschlossenen " (links). Füllen Sie eine Zeile mit DB, enthält das passende Fahrzeug und die zweite mit der Lösung mit einer pharmakologischen Inhibitor von Interesse (z.B. 5 µM Latrunculin A).
      Hinweis: Es ist notwendig, physisch die linke Linie weil Klemmen der " geschlossenen " linke Position öffnet das Ventil für diese Zeile.
    2. Füllen und Spülen der rechten Linie durch Einschalten des Drucks bei 50 Mbar und das Ventil zu wechseln die " öffnen " (rechts). Wechseln Sie dem Ventil auf der linken Seite nach ~ 30 füllen s. und spülen Sie die linke Linie durch das Entfernen der Klammer für ~ 30 S. verbinden beide Linien auf zwei Buchten auf der einen Seite der Folie mit einem Kanal, stecken Sie den verbleibenden Einlass und verbinden Sie den Abfluss mit dem einzigen Einlass auf der zweiten Seite. < / l ich >
    3. waschen Sie die Folie mit dem Puffer in die richtige Linie und Stimulation in den gleichen Puffer führen, wie in den Schritten 4.1.3 und 4.1.4 oben beschrieben.
      Hinweis: Obwohl die richtige Linie wie die erste in diesem Setup gewählt wurde, die Reihenfolge kann umgekehrt werden.
    4. Nach Stimulation, wechseln Sie das Ventil um die richtige Linie bei Null Druck (d.h. Schwerkraft fließen nur, ~ 15 dyn/cm 2) zu öffnen. Die linke Linie entfernen Sie die Klemme und wechseln Sie das Ventil nach links, um diese Zeile zu öffnen. Klemmen Sie die erste Zeile.
    5. Nach 3-5 mL des Puffers mit Inhibitor durch laufen, wechseln Sie das Ventil nach rechts, um den Fluss zu stoppen und inkubieren Sie die Zellen mit dem Inhibitor für die erforderliche Länge der Zeit (z.B. 15 Minuten). Schalten Sie den Fluss durch Umschalten des Ventils jeden ~ 10 min für ca. 15 s, Sauerstoffmangel zu verhindern. Wiederholen Sie die Stimulation mit der zweiten Zeile.
  3. Alternative Methode zur Bewertung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit einer Mikropipette
    1. die Mikropipette gefüllt mit DB nach Standardprotokoll 23 eingerichtet. Halten Sie den Ausgleich Druck bei 1.500 Psi.
    2. Sammeln und vegetative Zellen zu verdünnen, wie unter Punkt 2.1 beschrieben. Platz 25 µL Tropfen ~7.5 X 10 5 Zellen/mL in einer 1-Well-Kammer ermöglichen zu halten für mindestens 10 min, und bedecken Sie mit 3 mL DB.
    3. Legen die Kammer auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop mit einem 40 X Öl Objektiv ausgestattet. Suchen Sie die Zellen. Die Mikropipette vorsichtig in die Mitte des Sichtfeldes zu senken, bis es zuerst den Boden der Kammer berührt.
      Hinweis: Da der Entschädigung Druck bei 1.500 Psi eingestellt wurde, die Zellen kontinuierlich ausgesetzt werden, eine sehr langsame Strömung der DB aus der Mikropipette.
    4. Beginnen, Importieren von Bildern mit RFP oder GLP-Beleuchtung in 3 s Intervallen. Gelten die ' sauber ' Funktion um einen Bolus von Flüssigkeit aus der Mikropipette freizugeben. Weiter ich imagingdas Vorhandensein der Strömung wegen Entschädigung Druck allein n.
  4. Eine alternative Methode zur Bewertung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit loser Schüttung Puffer Zusatz
    1. sammeln und vegetative Zellen zu verdünnen, wie unter Punkt 2.1 beschrieben. Platz 20 µL sinkt der Zellen bei ~ 1 x 10 6 Zellen/mL in DB in der Mitte ein Brunnen aus einer 8-Well-Kammer. Können Zellen für mindestens 10 min. halten
    2. Beginnen, Importieren von Bildern mit RFP oder GLP-spezifische Beleuchtung auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop Intervallen von 3 s mit einem 40 X Objektiv ausgestattet. Konzentrieren Sie sich auf einer Fläche nah an den Rand des Tropfens.
    3. Schnell hinzufügen 430 µL der DB auf der einen Seite des Brunnens. Bildgebung weiter.
    4. Zur Analyse der Interaktion zwischen mechanische und chemische Reize, 12 oder 45 s nach mechanische Stimulation, sanft hinzufügen 50 µL der Folsäure (Endkonzentration 20 nM) oder Fahrzeug (DB) ohne induzieren eine mechanische Antwort. Bildgebung weiter.
  5. Quantifizierung der Antwort
    1. Öffnen Sie die 32-Bit-TIFF-Bild in der Bildanalyse-Software (Details siehe Tabelle der Materialien) 27.
    2. Unter der ' Analyse ' Registerkarte, gehen Sie zu " Set Messungen ". Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ' Mittelwert grau '. Stellen Sie sicher, dass die anderen Kontrollkästchen nicht aktiviert sind. Klicken Sie auf " OK ".
    3. Unter den ' Prozess ' Registerkarte, klicken Sie auf " subtrahieren Hintergrund ". Halten des rollenden Kugel Radius auf 50 Pixel, und tun nicht Prüfung aller Optionen im Menü aufgelistet. Vergrößern Sie eine Zelle mit dem ' Lupe ' Tool.
    4. Mit der ' Rechteck ' Werkzeug, zeichnen Sie ein Rechteck (~2.5 x 2,5 µm 2) in das Zytosol, sicherstellen, dass Sie nicht über den Kern oder die Plasmamembran zu zeichnen. Presse " Strg " + " M " Tasten oder gehen Sie auf die ' Analyze ' Registerkarte, und klicken Sie auf " Maßnahme " mittleren Grauwert des Feldes zu bestimmen. Voraus zu nachfolgenden Frames und Messen Sie erneut, sicherstellen, dass die Box bleibt in der Zellflüssigkeit.
      Hinweis: Da D. Discoideum Zellen sehr rasch Feld kann verschoben werden von einem Frame zum nächsten zu halten in der Zellflüssigkeit.
    5. Schließlich der Frames analysiert wurden, kopieren Sie die Werte in einer Tabelle. Um Zell-Zell-Variation in den Ausdruck der verschiedenen Biosensoren berücksichtigen, normalisieren Sie sich die Werte für die mittlere Grauwert beobachtet zum Zeitpunkt 0. Berechnen den Kehrwert der Werte auf die Anhäufung des Signals auf den Kortex widerspiegeln.

5. Kontinuierliche mechanische Stimulation und Live-Imaging von Einzelzellen am Mikroskop

  1. eingerichtet, die Zellen genau wie oben beschrieben für akute mechanische Stimulation Analyse in Schritten 4.1.1 - 4.1.3. Öffnen Sie den Stecker für das Reservoir mit dem Puffer, so das Volumen aufgestockt werden kann, wenn Antwort länger als ein paar Minuten zu einem Zeitpunkt analysiert wird.
    Hinweis: Da das Reservoir für die Dauer des Experiments geöffnet bleibt, dieser Assay wird ohne Druck von außen durchgeführt und stützt sich auf Schwerkraft fließen allein. Um die Rate von Strömung durch die Schwerkraft zu erhöhen, kann der Bach auf einem Tisch unter dem Mikroskop platziert werden.
  2. Beginnen imaging Zellen mit RFP oder GLP-spezifische Beleuchtung auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop in 3 s-Intervallen für die Analyse der Biosensor Antworten mit einem 40 X Objektiv ausgestattet. Alternativ mit Phasenkontrast mit einem 20 X Objektiv in Intervallen von 10 s für die Analyse von insgesamt Zellwanderung Bild.
  3. Schalten Sie den Fluss nach mehreren Frames bei der Null-Druck-Einstellung (d.h. Flow ist aufgrund der Schwerkraft allein oder ~ 15 dyn/cm 2) durch den Wechsel des Ventils in die offene Position. Fällt das Niveau der Flüssigkeit auf ca. 5-10 mL im Tank, mit mehr Puffer auffüllen. Achten Sie darauf, die Flüssigkeit vorsichtig hinzufügen, damit Luftblasen in den Zeilen nicht verfangen.
    Hinweis: Es ist wichtig, fügen Sie Flüssigkeit die gleiche Temperatur um einen Hitzeschock-Antwort in den Zellen zu vermeiden.
  4. Zelle Geschwindigkeit und Ausdauer mit Migrations-Analyse-Software zu quantifizieren (siehe die Tabelle der Materialien für Details) laut Hersteller ' Anweisungen s.

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Ergebnisse

Zeitliche Reaktion der Chemotaxis Regulierungsbehörden auf akute mechanische stimulation

Um die Reaktion von D. Discoideum Zellen auf mechanische Stimulation zu beurteilen, wurden anhaftende Aggregation-kompetente Zellen einen kurzen Impuls von Schubfluss ausgesetzt. Zusammenfassung-kompetente D. Discoideum Zellen absondern, Lager, das von benachbarten Zellen zu spüren. Um den Beitrag der Zell-Zell-Signalisierung ...

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Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, Bevölkerung und einzelne Zelle Verhalten um Strömung Scheren zu beurteilen. Wichtig ist, während frühere Studien Lokalisierung von leading und lagging Rand Markierungen während der Migration analysiert, ermöglicht das derzeitige Konzept Untersuchung der unmittelbaren Auswirkungen durch die Anwendung der Schubfluss akut. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass in der Tat, die erste Reaktion der Zellen fließen Scherung Zellwanderung nicht erforderlich ist....

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant R35 GM118177 PND unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
DextroseFisherD16-1Zur Herstellung von HL-5-Medien und SM-Platten (Schritte 1.1, 1.2)
Proteose-PeptonFisherDF0120-17-6Zur Herstellung von HL-5-Medien (Schritt 1.1)
HefeextraktFisher50-550-445Zur Herstellung von HL-5-Medien und SM-Platten (Schritte 1.1, 1.2)
Na2HPO4· 7H2OFisherS373-500Zur Vorbereitung von HL-5-Medien und 10X Phosphatpuffer (Schritte 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500Zur Vorbereitung von HL-5-Medien, SM-Platten und 10X Phosphatpuffer (Schritte 1.1-1.3)
Streptomycin (Dihydrostreptomycinsulfat)FisherICN10040525Zur Herstellung von HL-5-Medien (Schritt 1.1)
Peptone (Bacto)FisherDF0118-17-0Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)
K2HPO4FisherP288-100Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)
AgarFisherBP1423-500Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)
MgSO4FisherM65-500Zur Vorbereitung von DB Buffer (Schritt 1.4)
CaCl2FisherC79-500Zur Herstellung von DB-Puffer (Schritt 1.4)
KoffeinFisherO1728-500Zur Zubereitung von Koffein (Schritt 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosin 3 ft.,5 ft.-cyclisches Monophosphat, Natriumsalz)Fisher11-680-1100MGZur Herstellung von cAMP (Schritt 1.6)
FolsäureSigmaF7876Zur Herstellung von Folsäure Saure (Schritt 1.7)
TrisbaseFisherBP152-500Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)
Natriumdodecylsulfat (SDS)FisherBP166-500Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)
GlycerinFisherG33-500Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad1610610Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)
BromphenolblauBio-Rad1610404Zur Herstellung von 3X Probenpuffer (Schritt 1.8)
NaFFisherS299-100Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)
Natriumpyrophosphat-DecahydratFisherS390-500Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)
Vollständiger EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche)Sigma11873580001Zur Herstellung von Probenpuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (Schritt 1.8)
Latrunculin AEnzo Life SciencesBML-T119-0100Zur Herstellung von Latrunculin A (Schritt 1.9)
4-15 % Tris-HCl Polyacrylamid-GelBio-Rad3450029Zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)
Polyvinylidenfluorid-MembranBio-Rad1620177Zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Kaninchen-AntikörperCell Signaling2060Primärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) XP-AntikörperCell Signaling4370Primärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)
Kaninchen-IgG HRP Linked Whole Ab (von Esel)GE HealthcareNA934-100ULSekundärer Antikörper zur Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)
Verstärktes Chemilumineszenzsubstrat (Clarity Western ECL-Substrat)Bio-Rad1705060Verwendung beim Immunblotting (Schritt 3.3)
Stripping-Puffer (Restore Plus Western-Blot-Stripping-Puffer)PiercePI46430Verwendung für Immunblotting (Schritt 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278Verwendung für Immunblotting (Schritt 3.3)
K. aerogenes Stamm (nicht pathogen)Dicty Stock Center (dictybase.org)
Namestrong>CompanyKatalognummerKommentare
Materialien und Ausrüstung
Orbitalschüttler (Modell G-33 oder eine vergleichbare Alternative)New Brunswick ScientificZur Züchtung von K. aerogenes (Schritt 2.1.1) und zur Stimulation von D. discoideum-Zellen (Schritt 3). Der Drehradius für diesen Shaker beträgt 9,5 mm.
10 cm PetrischaleFisherFB0875712Zur Vorbereitung von SM-Platten (Schritt 1.2)
HämozytometerFisher02-671-51BZur Zählung von D. discoideum Zellen (Schritt 2.1.2)
35-mm-Schale (Corning Falcon Easy-Grip Gewebekulturschale)Fisher08-772AZur Platte von D. discoideumZellen für die mechanische Stimulation und anschließende Zelllyse (Schritt 3.1.1)
Becher aus Polystyrol (5 mL)VWR13915-985Zur Stimulation von D. discoideum Zellsuspension mit einem Chemoattraktivstoff (Schritt 3.2.2)
Fluidische Einheit mit Pumpe (ibidi Pump System)Ibidi10902Zur mechanischen Stimulation von d. discoideum Zellen in einem Kanal (Schritte 4.1, 4.2 und 5)
Objektträger mit Kanal (μ-Objektträger III 3in1 ibiTreat: #1.5 Polymer-Deckglas, Gewebekultur behandelt, sterilisiert)Ibidi80316Zur Platte von D. discoideum-Zellen für die mechanische Stimulation, die von einem fluidischen Gerät abgegeben wird (Schritte 4.1, 4.2 und 5)
50-ml-Reservoire (Ibidi Reservoirhalter für Fluidik-Einheit)Ibidi10978Verwenden Sie diese Option, um die fluidische Vorrichtung für die Verabreichung mechanischer Stimulation an d. discoideum Zellen in einem Kanal einzurichten (Schritte 4.1, 4.2 und 5)
Leitungen für die fluidische Einheit (Perfusionsset GELB-und-GRÜN)Ibidi10964Verwenden Sie diese Option, um die fluidische Vorrichtung für die Verabreichung mechanischer Stimulation an D. discoideum Zellen in einem Kanal einzurichten (Schritte 4.1, 4.2 und 5). Hinweis: Die beiden Leitungen können auch aus dem 1,6 mm Schlauch (Katalognummer 10842) geschnitten werden.
Leitung für den Abfluss (Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,6 mm)Ibidi10842Zum Einrichten des fluidischen Geräts zur Verabreichung mechanischer Stimulation von d. discoideum Zellen in einem Kanal (Schritte 4.1, 4.2 und 5).
Zeiss Observer.Z1 inverses Mikroskop mit einem 40X/1,3 Ölobjektiv und einem 20X/0,3 Luftobjektiv (oder einer vergleichbaren Alternative)ZeissZur Abbildung von D. discoideum Küvetten mit Phasenkontrast- oder Fluoreszenzbeleuchtung (Schritte 4 und 5)
UltraView Konfokalmikroskop mit Spinning-Disk, ausgestattet mit einem 40-fachen;/1,25– 0,75 Ölobjektiv (oder eine vergleichbare Alternative)Perkin-ElmerDM 16000Alternative zur Abbildung von D. discoideum Zellen (Schritt 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; Modell 5247 oder eine vergleichbare Alternative) mit Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D und 5192000027Zur mechanischen Stimulation von D. discoideumZellen durch eine Mikropipette (Schritt 4.3). Hinweis: Die Katalognummern beziehen sich auf die neueste Version des Gerätes (4i).
Mikropipette (Femtotip; 1 μ m Außendurchmesser, 0,5 μ m Innendurchmesser )Eppendorf930000035Zur mechanischen Stimulation von D. discoideum Zellen mit einer Mikropipette (Schritt 4.3)
Microloader-Spitzen (Eppendorf Femtotips Microloader-Spitzen für Femtojet Microinjector)Eppendorf5242956.003Zum Befüllen der Mikropipette (Femtospitze) mit Puffer (Schritt 4.3.1)
1-Well-Kammer (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)Fisher12-565-472Zur Platte von D. discoideum Zellen für die mechanische Stimulation durch eine Mikropipette (Schritt 4.3.2)
8-Well-Kammer (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Kammer-Deckglas)Fisher12-565-338Zur Platte von D. discoideum Zellen für die mechanische Stimulation durch Bulk-Pufferzugabe (Schritt 4.4.1)
NameCompanyKatalognummerComments<
strong>Software
Image Analysis Software (Fiji)NIHhttps://fiji.sc/Zur Quantifizierung der Reaktion auf mechanische Stimulation (Schritt 4.5)
Migrationsanalysesoftware (Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/Zur Quantifizierung der Zellgeschwindigkeit und -persistenz (Schritt 5.4)

Referenzen

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