Method Article

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

DOI:

10.3791/56419

⸱

December 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), 4Deutsches Herzzentrum Berlin (DHZB), 5Department of Cardiovascular Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die komplette Decellularization des menschlichen Myokard unter Beibehaltung seiner Komponenten der extrazellulären Matrix. Weiterverarbeitung der extrazellulären Matrix Ergebnisse bei der Herstellung von Mikropartikeln und einer zellschützenden selbstorganisierende Hydrogel.

Abstract

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Azellulärer extrazelluläre Matrix Präparate eignen sich für das Studium der Zellmatrix Interaktionen und regenerative Therapieanwendungen erleichtern. Einige kommerzielle extrazelluläre Matrix Produkte sind erhältlich als Hydrogele oder Membranen, aber diese besitzen keine Gewebe-spezifische biologischen Aktivität. Da Perfusion Decellularization in der Regel nicht mit menschlichen Herzgewebe möglich ist, haben wir einen 3-Stufen-eintauchen-Decellularization-Prozess entwickelt. Menschlichen myokardiale Scheiben beschafft während der Operation werden zunächst mit Waschmittel-freie Hyperosmolar Lyse Puffer, gefolgt von Inkubation mit ionischen Waschmittel, Sodium Dodecyl Sulfat behandelt und der Vorgang abgeschlossen ist, durch Ausnutzung der intrinsischen DNase-Aktivität des fetale Rinderserum. Diese Technik führt zu zellfreie Blätter der kardialen extrazelluläre Matrix mit weitgehend erhaltenen Bindegewebe Architektur und Biopolymer Zusammensetzung, die erwiesen sich als kardiale Zellpopulationen und pluripotenten Stammzellen bestimmte ökologische Hinweise anzubieten Zellen. Kardiale extrazelluläre Matrix Blätter können dann weiter verarbeitet zu einem Mikropartikel Pulver ohne weitere chemische Modifikation oder, über kurzfristige Pepsin Verdauung in einem selbstorganisierenden kardiale extrazelluläre Matrix Hydrogel mit erhalten Bioaktivität.

Introduction

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Die extrazelluläre Matrix (ECM) bietet nicht nur strukturelle Unterstützung ist aber auch wichtig für biologische Zelle und Gewebe Funktion1. Im Herzen beteiligt sich das ECM bei der Regulierung der pathophysiologische Reaktionen wie Fibrose, Entzündungen, Angiogenese, Cardiomyocyte kontraktile Funktion und Lebensfähigkeit und resident Stammvater Zelle Schicksal. Es enthält neben seiner primären Komponenten - faserige Glykoproteine, Glykosaminoglykane und Proteoglykane - eine Vielzahl von sekretierten Wachstumsfaktoren, Zytokine und häutigen Vesikel mit Nukleinsäuren und Proteine,2,3.

Es kürzlich klar geworden, dass azelluläre ECM Vorbereitungen nicht nur für das Studium der Zellmatrix Interaktionen, aber auch für potentielle therapeutische Zell-basierte Anwendungen von unschätzbarem Wert sind. Die Bedeutung der Bereitstellung einer geeigneten Umgebung auf therapeutische Zelle Produkte oder technische Gewebe ist jetzt weithin anerkannt. Versuche wurden unternommen, Zellsuspensionen oder Wirkstoffe kombinieren mit definierten biopolymeric Hydrogele4,5,6 oder mit Protein Cocktails sezerniert murinen Sarkom Zellen (d. h. Matrigel, Geltrex) 7. Erstere haben begrenzte Bioaktivität, letztere sind jedoch problematisch in GMP-Klasse Prozesse, und beide fehlt die gewebespezifischen Bioaktivität von kardialen ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Decellularization der Herzmuskel wurde zuvor von Perfusion von ganzem Herzen über den koronaren Gefäßsystem14,15durchgeführt. Dies ist, zwar möglich in tierische Herzen sind intakte Menschenherzen nur selten zur Verfügung. Daher wurde ein Eintauchen-Prozess, für den Umgang mit Gewebeproben im OP-Saal ermöglicht, begünstigt. Unser "3-Step"-Protokoll enthält 3 Separate Inkubation Schritte, nämlich Lyse Solubilisierung und DNA-Entnahme. Es ergibt sich menschlichen myokardialen ECM mit weitgehend erhaltenen Protein und Glykosaminoglykan Zusammensetzung16,17. Diese cECM Scheiben für in-vitro- Studien der Zelle-Matrix Interaktionen ermöglichen aber sind schlecht für Menschen-Skala therapeutische Anwendungsmöglichkeiten geeignet. Der Herstellungsprozess wurde dann erweitert, um entweder lyophilisierten cECM Mikropartikel oder ein cECM Hydrogel18produzieren.

Dieses Protokoll ermöglicht die Decellularization des menschlichen Myokard von chirurgischen Proben, Erhaltung der Hauptkomponenten des myokardialen extrazelluläre Matrix (ECM) und deren biologische Aktivität erreicht. Dieses Protokoll wird empfohlen, wenn menschliche Herz ECM mit erhaltenen Gewebe-spezifische Bioaktivität für experimentelle Studien der Zelle-Matrix Interaktionen erforderlich ist oder wenn ein geeignetes Umfeld für zellbasierte Herzmuskelregeneration Ansätze benötigt wird. Im Prinzip ist es auch möglich, dieses Protokoll zum GMP-Klasse Bedingungen anzupassen, so dass die Verwendung von verarbeitetem cECM machbar in Zukunft therapeutisch sein sollte.

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Protocol

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Das Studienprotokoll passt sich an die ethischen Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki und der institutionellen Beitrag Board und Ethik-Ausschuss der Charité medizinische Universität verabschiedet. Alle Patienten zur Verfügung gestellt geschrieben, informierte Zustimmung für den Einsatz von Herzgewebe für experimentelle Studien.

1. Vorbereitung des menschlichen Myokard-Schnitt

  1. Erhalten Links ventrikulären Myokard (Größe hängt von der Art der Operation) direkt aus dem OP-Saal und Transport in kaltem PBS in einen sterilen Behälter.
  2. Entfernen Sie alle Fettgewebe mit einem sterilen Skalpell mit Klinge Nr. 10 unter sterilen Bedingungen.
  3. Schneiden Sie das Myokard in Würfel von ca. 1 x 1 x 1 cm mit einem Skalpell.
  4. Legen Sie die Würfel in sterilen 50 mL-Tuben.
    Hinweis: Um zu pausieren, führen Sie Schritt 1.5, Andernfalls fahren Sie mit Schritt 2.2. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen um Proteinabbau und eine Abnahme der Qualität der Gewebe zu verhindern.
  5. Speichern Sie die Röhrchen mit den Würfeln bei-80 ° C. Das Gewebe kann mehrere Monate aufbewahrt werden.

(2) Schneiden der Herzmuskel Würfel in Scheiben

  1. Nehmen Sie die Tube(n) enthält die vorbereitete Würfel aus dem Gefrierschrank.
  2. Transport auf Eis, um den Kryostaten.
  3. Stellen Sie die Objekt und Raum Temperatur bis-15 ° C.
    Hinweis: Die richtige Temperatur ist entscheidend für den perfekten Schnitt zu gewährleisten.
  4. Chill leer 50 mL-Tuben und Briefmarken in der Kammer oder Trockeneis.
  5. Fügen Sie eine Schicht (ca. 0,5 - 1,0 mL) des Cryosection Mediums auf den kalten Stempel und lassen Sie es einfrieren, bis es weiß und solide.
  6. Fügen Sie eine zweite Schicht des Cryosection Mediums und legen Sie einen Myokard-Würfel auf dieser Ebene.
  7. Stellen Sie sicher, dass das Cryosection Medium und Myokard vollständig gefroren sind, bevor Sie fortfahren.
    Hinweis: Wenn die Probe und Cryosection Medium sind nicht gefroren der Schnitt beeinträchtigt wird. Vollständig gefroren Cryosection Medium wechselt von flüssig und transparent zu festen, weiß und undurchsichtig. Die myokardiale Würfel benötigen mindestens 30 min bis 1 h komplett gefrieren, wenn sofort Schritt 1.4 Vorgang fortsetzen. Wenn das Gewebe fixiert ist sollte es nicht verformen, wenn berührt/behandelt mit einer Pinzette.
  8. Legen Sie Stempel mit gefrorenen Myokard in der Halterung und ziehen Sie alle Schrauben fest.
  9. Schneiden Sie die Oberfläche des Gewebes, bis eine sogar Stationspunkte Oberfläche erzielt wird.
  10. Set bis 300 µm Dicke schneiden.
  11. Abschnitt der gefrorenen Myokard mit automatischen schneiden. Dies garantiert einheitliche Zuschnitte. Ca. 30-40 Abschnitte können aus einem Würfel geschnitten werden.
  12. Legen Sie jede Scheibe nach schneiden lose in eine vorgekühlte 50 mL-Tube.
    Hinweis: Drücken Sie nicht die Scheiben oder Pack fest. Ca. 40 Scheiben passen in eine Röhre.
  13. Schließen Sie die gefüllten Röhrchen und auf Eis legen.
    Hinweis: Um gehen auf Schritt 2.14 pausieren, sonst fahren Sie mit Schritt 3.2.
  14. Shop-Myokard-Scheiben bei-80 ° C. Die Scheiben können für mehrere Monate gespeichert werden.

3. Decellularization der menschlichen Myokard Scheiben

  1. Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von 50 mL Röhrchen mit Myokard Abschnitte aus den-80 ° C Gefrierschrank und Transport auf dem Eis.
  2. Übertragen Sie die Gefrierschnitte alle 50 mL-Tuben von Schritt 3.1 in einem sterilen Becher. Ca. 40 Scheiben werden die Becher pro 50 mL-Tube hinzugefügt. Der Becher sollte dreimal das Volumen von 50 mL Röhrchen; Verwenden Sie zum Beispiel, für Decellularization eine 50 mL Tube eine 150 mL-Becherglas.
  3. 50 mL Lyse-Lösung (10 mM Tris, 0,1 % w/V EDTA, pH 7.4 in H2O) pro 50 mL-Tube mit Myokard Scheiben hinzufügen.
  4. Schütteln Sie die Myokard-Scheiben in einem sterilen Becher bei 100-150 u/min kontinuierlich für 2 h bei Raumtemperatur.
  5. Die Flüssigkeit mit dem Gewebe Scheiben durch ein grobes Sieb abseihen. Übertragen Sie die Gewebe-Scheiben mit einer stumpfen Pinzette auf einen neuen sterilen Becher. Fügen Sie 50 mL 0,5 % SDS in PBS pro erste 50 mL Tube Myokard Scheiben (z. B. 100 mL SDS Lösung wenn zwei 50 mL Röhrchen der myokardialen Abschnitte sind decellularized wird).
  6. Schütteln Sie kontinuierlich für 6 h bei 100-150 u/min bei Raumtemperatur.
  7. Die Flüssigkeit mit dem Gewebe Scheiben durch ein grobes Sieb abseihen. Übertragen Sie die Gewebe-Scheiben mit einer stumpfen Pinzette auf einen neuen sterilen Becher und 3 Mal mit 50 mL PBS für 10 min unter Schütteln bei 150 u/min waschen. Als nächstes über Nacht waschen in PBS mit 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % Nystatin (PBS-P/S-N) bei 100-150 u/min und 4 ° C unter schütteln.
    Hinweis: Gründliches Waschen ist entscheidend für jede verbleibende SDS vollständig zu entfernen. Verbleibende Spuren von SDS sind giftig, wenn das ECM in Kombination mit Zellen verwendet wird.
  8. Entfernen Sie die Waschlösung und 25 mL vorgewärmt FBS (37 ° C) mit 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % Nystatin, die decellularized Scheiben pro erste 50 mL-Tube Myokard Scheiben.
  9. 3 h bei 37 ° c inkubieren In diesem Schritt wird die Matrix aufgrund der intrinsischen DNase-Aktivität von der FBS keine verbleibenden DNA entfernt.
  10. Übertragen Sie die Scheiben auf einen neuen sterilen Becher und unter Schütteln bei 150 u/min 3 Mal mit 50 mL PBS für 10 min waschen.
    Hinweis: Die ECM-Scheiben können im PBS-P/S-N bei 4 ° C mehrere Tage aufbewahrt werden. Es wird jedoch empfohlen, sofort fortfahren.

(4) verarbeiten die Decellularized cECM zu einem Pulver

  1. Legen Sie die ECM-Scheiben lose in eine neue sterile 6-Well-Platte. Das ECM bei-80 ° C eingefroren und für 2 Tage in ein Gefriertrockner lyophilize.
    Hinweis: mehr als eine Scheibe kann pro Bohrloch platziert werden. Ordnen Sie die Scheiben um vollständig bedecken die Oberfläche des Brunnens. Überlappenden Slices hat keinen Einfluss auf den Erfolg der späteren Pulverisierung.
  2. Für die Pulverisierung des ECM-Slice Röhren Verwendung bestimmten Fräsen (siehe Tabelle der Materialien) mit 1,4 mm keramische Perlen. Füllen Sie die Rohre mit lyophilisierten ECM sterile stumpfen Pinzette locker. Um optimale Ergebnisse zu erzielen empfiehlt sich ein Gesamtgewicht von ECM zwischen 10-20 mg.
    Hinweis: Wenn das ECM in den Fräsen Röhren zu dicht ist der Pulverisierung Prozess wird negativ beeinflusst werden.
  3. Snap-Einfrieren der Rohre in flüssigem Stickstoff.
    Vorsicht: Flüssigstickstoff ist extrem niedrige Temperaturen, geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
  4. Legen Sie die eingefrorene Rohre in die Fräsmaschine und pulverisieren Sie das ECM zu.
    1. Legen Sie eine Dauer von 30 s und eine maximale Geschwindigkeit und starten Sie das Gerät.
    2. Nehmen Sie nach Beendigung die Rohre und Snap-Freeze wieder in flüssigem Stickstoff.
    3. Wiederholen Sie fünfmal.
  5. Waschen Sie die Mikropartikel aus den Rohren durch Zugabe von 1 mL DdH2O pro Rohr und schütteln oder Wirbel für komplette Gefäss-. Filtern Sie die heterogene Lösung durch ein Netz von 200 µm in einem 50 mL-Tube.
  6. Fixieren Sie das Rohr in-80 ° C oder flüssiger Stickstoff.
  7. Den standard Deckel des Rohres mit einem 0,22 µm-Filter. Dieser Filterdeckel verhindert, dass das Pulver aus dem Rohr fließt sondern ermöglicht Luftzirkulation für Wasserverdunstung.
  8. Legen Sie die Rohre in den Gefriertrockner und lyophilize wieder um das Wasser aus den Schritt (4.5) entfernen
    Hinweis: Lyophilisierung bei diesem Schritt kann bis zu 3 Tage dauern.
  9. Lagern Sie Puder bei-80 ° C bis zur Weiterverarbeitung oder fahren Sie mit Schritt 5.1.

(5) Enzym basierend Homogenizing von cECM Mikropartikel

  1. Porcines Pepsin in 0,01 M HCl (pH 2.0) zu einer Konzentration von 1 mg/mL auflösen. Legen Sie auf einem rotary Schüttler bei Raumtemperatur, bis sie vollständig aufgelöst ist.
  2. Die gefriergetrockneten menschlichen ECM Pulver (Schritt 4.8) in die Pepsin-Lösung, um eine Endkonzentration von 10 mg/mL auflösen. Mischen Sie durch Pipettieren gründlich. Das Gesamtvolumen hängt die Höhe der ECM-Lösung benötigt. Z. B. 10 mg ECM Pulver in 1 mL Pepsin Lösung auflösen.
    Hinweis: Auflösen von Teilchen kann durch sanfte vortexen (1.000-1.500 u/min) unterstützt werden. Verbleibenden Klumpen von Mikropartikeln wird die Verdauung negativ beeinflussen.
  3. Übertragen Sie die Lösung auf 2 mL Röhrchen mit einem Volumen von 1 mL pro Rohr.
  4. Legen Sie die Rohre in einem Rohr-Shaker für 48 h bei 27 ° C und 1.200 u/min.
  5. Nehmen Sie die Rohre aus den Shaker und auf Eis oder einem vorgekühlten Rohrhalter.
  6. Mix 1/9 des Volumens der ECM-Lösung von kalten 10 X PBS (pH 7,4) mit 1/10 des Volumens der ECM-Lösung von Kälte 0,1 M NaOH in eine vorgekühlte Rohr- und Platz auf dem Eis. Diese Mischung wird der verdaute ECM-Lösung zu neutralisieren und irreversibel inaktivieren das Pepsin.
  7. Die Neutralisation Mischung und die Mischung gründlich durch Pipettieren oder Aufschütteln der ECM-Lösung hinzufügen.
  8. Legen Sie die ECM auf die gewünschte Konzentration mit 1 X PBS (pH 7,4). Der pH-Wert der Lösung kann mit pH-Papier überprüft werden.
    Hinweis: Beispielrechnung für 10 mL verdaut ECM-Lösung:
    Porcines Pepsin 10 mg zu 10 mL HCl (pH 2.0) hinzufügen.
    100 mg ECM Pulver Pepsin Projektmappe hinzufügen.
    Hinweis: Beispielrechnung zur Neutralisation 10 mL verdaut ECM-Lösung und die Konzentration auf 8 mg/mL:
    VolFinal = Cstart X Volstart / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
    Vol10xPBS = Volstarten / 9 = 1/9 von 10 mL = 1,11 mL 10 X PBS
    VolNaOH = Volstarten / 10 = 1/10 von 10 mL = 1 mL
    Vol1xPBS = VolFinal - Volstarten - Vol10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL

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Results

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Das 3-Stufen-Protokoll für Decellularization der menschlichen Myokard hier vorgestellten Ergebnisse in nahezu vollständigen Entfernung von Zellmaterial, unter Beibehaltung der wichtigsten ECM-Komponenten und die fibrillären Struktur des ECM. Nach Decellularization zeigt sich die grobe Entfernung von Zellen aus dem Gewebe durch die Änderung der Farbe (Abbildung 1A). Histologischen Untersuchung mit H & E und Masson Trichrome Flecken offenbart das völlige Fe...

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Discussion

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Beim menschlichen myokardialen ECM vorbereiten, das Ziel ist es, Folgendes zu erreichen: Entfernung von relevanten immunogen Zellmaterial, Erhaltung der Integrität von ECM und Bioaktivität, Sterilität, Ungiftigkeit des Endproduktes, GMP-Prozess Kompatibilität und Eignung des Produkts für eine bestimmte Anwendung in Bezug auf die Handhabung. Durch die Kombination unserer 3-Stufen-Decellularization-Protokoll mit Weiterverarbeitung zu Mikropartikeln oder selbstorganisierende Hydrogel, kardiale ECM Menschenmaterial ergibt, d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Studienprotokoll passt sich an die ethischen Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki. Patienten zur Verfügung gestellt informierte Zustimmung für die Verwendung des Gewebes um zu Forschungszwecken und der Prozess der Gewebe Sammlung von Institutional Review Board und Ethikkommission der Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) genehmigt wurde.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BalanceDR Precisa, Dietikon, SchweizPrecisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3InstrumenteNRW, Erftstadt, GermanySK-10-004
Zellkulturplatten (6-Well)Greiner, Frickenhausen, Germany657160
Cryostat CMLeica, Wetzlar, Germany3050S
EDTACarl Roth, Karlsruhe, Deutschland8043.3
Eppendorf Reaktionsgefäße (1,5 oder 2 ml)Greiner, Frickenhausen, Deutschland616201, 623201
Falcon 15ml, 50mlGreiner, Frickenhausen, Deutschland188271, 227270
Fötales Rinderserum (FBS)Biochrome, Berlin, DeutschlandS 0115
Freeze Dry SystemLabconco, Kansas City, USA7670520
Gefrierschrank (-80°; C)Thermo Scientific, Waltham, MA, USAForma 900 Serie
HClCarl Roth, Karlsruhe, Deutschland281.1
Mikrotomklingen Typ 819Leica, Wetzlar, Deutschland14035838925
Minilys HomogenisatorPEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland91-PCSM
NaOHCarl Roth, Karlsruhe, DeutschlandK021.1
NystatinPAN Biotech, Aidenbach, DeutschlandP06-07800
PBSThermo Scientific, Waltham, MA, USA14190-094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies, Darmstadt, Deutschland15140122
PepsinSigma-Aldrich, Taufkirchen, DeutschlandP6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mmPeqlab Biotechnolgie, Erlangen, Deutschland91-PCS-CK14
Rotamax 120 PlattenschüttlerHeidolph, Schwabach, Deutschland544-41200-00
SDSCarl Roth, Karlsruhe, DeutschlandCN30.3
StereomikroskopLeica, Wetzlar, DeutschlandM125
Steriflip-GP, 0,22 & Mikro; mMerck Millipore, Darmstadt, DeutschlandSCGP00525
Stuart analoge Rocker & Roller MixerSigma-Aldrich, Taufkirchen, DeutschlandZ675113-1EA
Tissue Tek O.C.T. CompoundHartenstein, Würzburg, DeutschlandTTEK
Transfusionsset 200µ mSarstedt, Nü mbrecht, Deutschland798.200.500
TRISCarl Roth, Karlsruhe, Deutschland5429.3
vedena Skalpellgriff Abb. 3, Standard, 125 mmMedical Highlights, Rohrdorf, DeutschlandCV102-003
Vortex-Genie2Scientific Industry, New York, USASI-0256

References

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