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Methodenartikel

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

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DOI:

10.3791/56420

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27. Dezember 2017

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.

Zusammenfassung

Thrombozyten-Produktion erfolgt hauptsächlich im Knochenmark in einem Prozeß bekannt als Thrombopoiesis. Während Thrombopoiesis differenzieren hämatopoetischen Vorläuferzellen zu Form Thrombozyten Vorläufern genannt Megakaryozyten, die unheilbar unterscheiden, Thrombozyten aus langen zytoplasmatischen Prozesse bezeichnet Proplatelets freizugeben. Megakaryozyten sind seltene Zellen beschränkt sich auf das Knochenmark und sind daher schwer zu ernten, in ausreichender Zahl für den Laboreinsatz. Effiziente Produktion von menschlichen Megakaryozyten kann erreicht in Vitro durch Kultivierung CD34+ Zellen unter geeigneten Bedingungen. Das Protokoll hier detailliert beschreibt Isolierung von CD34+ Zellen durch magnetische Zellen aus Nabelschnurblut Blutproben sortieren. Die notwendigen Schritte um hochreines, Reifen Megakaryozyten serumfreien Bedingungen zu produzieren sind beschrieben. Details der phänotypische Analyse der Megakaryocyte Differenzierung und Bestimmung der proplatelet Bildung und Thrombozyten sind ebenfalls vorhanden. Effektoren, die Megakaryocyte Differenzierung und/oder proplatelet Bildung, wie z. B. Anti-Thrombozyten-Antikörper oder Thrombopoietin Mimetika beeinflussen können hinzugefügt werden kultivierten Zellen, biologische Funktion zu prüfen.

Einleitung

Isolierung von ausreichender Anzahl der primären menschlichen Megakaryozyten (MK) für regelmäßige Laboreinsatz ist nicht möglich aufgrund ihrer niedrigen Frequenz im Knochenmark, wo sie ~0.01% von kernhaltigen Zellen1entfallen. Eine bequeme Alternative ist die ex-Vivo -Erweiterung und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren. Eine Reihe von Zytokinen einschließlich Stammzell-Faktor (SCF; c-Kit-Ligand) und Interleukin (IL)-3 und IL-11 wurden ist in Kultur-Systeme eingesetzt, um MKs Thrombopoietin (TPO) produzieren der effektivste Wachstum und Differenzierung Faktor für Megakaryopoese Kulturen und ist effektiv, allein oder mit anderen Zytokinen, z. B. SCF und IL-3-2. TPO wirken auf Stammzell-Populationen, die Verbreitung und die Reifung der MKs2führen.

MK produzieren Thrombozyten aus zytoplasmatischen Vorsprünge genannt Proplatelets und in-vivo, ca. 1 x 1011 Thrombozyten sind entsteht täglich um Thrombozytenwerte von 150-400 x 109/L. Thrombozyten Produktion in Vitro aufrecht zu erhalten bis zu 1000 -Falten Sie niedriger als die in Vivo 3 schätzt, und dies hat Anlass zu zahlreichen Kulturbedingungen CD34 mit+ hämatopoetischen Vorläuferzellen, MK und Thrombozyten Produktion in Vitrozu verbessern. Die ursprüngliche Quelle der CD34+ für MK Differenzierung verwendete Zellen war menschlichen peripheren Blut4. Andere Zelle Quellen schließen Knochenmark5,6, embryonale Stammzellen/induzierte pluripotente Stammzellen (ESC/iPSC)7und Nabelschnur Blut (UCB)8,9,10 . Menschlichen Knochenmark CD34+ 11 und Maus Linie negative Knochenmark Zellen5 produzieren MK und Blutplättchen in Vitro; Dennoch, die mangelnde Verfügbarkeit von menschlichen Knochenmark schränkt seine Verwendung als eine Quelle von CD34+ Zellen. Im Gegensatz dazu stehen für ESC und iPSC eine unbegrenzte Quelle von Zellen für in-vitro- Thrombozyten-Produktion. Thrombozyten-Produktion aus diesen Zellen erfordert Feeder-Zellen wie murinen OP9 Zellen und längere Kultur. Thrombozyten im Feeder-freien Bedingungen abgeleitet scheinen weniger funktional12sein. iPSC-abgeleitete Plättchen werden voraussichtlich von Einsatz in klinischen Einrichtungen sein, da sie auf einer großen Skala erweitert werden können. Dieser Prozess erfordert Lentivirale vermittelte Transduktion von Transkriptionsfaktoren und langfristige Zelle Kultur13.

UCB ist eine zugängliche Quelle von CD34+ Zellen, die leicht einsetzbare Forschung Einstellungen. TPO allein kann Förderung der Differenzierung der Schnur Blut stammenden CD34+ Zellen, und dies gibt Anlass zu hochreinen, Reife MKs ohne die Notwendigkeit für Serum-Supplementierung oder Kokultur mit Feeder-Zellen. Andere Zytokine wie z. B. SCF Differenzierung von UCB CD34 verringern kann+ Zellen, während Flt-3 Ligand und IL-11 die Produktion von unreifen Megakaryozyten14 fördern. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von hochreinen MK Kulturen aus Nabelschnurblut CD34+ Zellen in serumfreien Bedingungen.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der South Eastern Sydney menschliche Forschungsethikkommission genehmigt und von der University of New South.Wales menschliche Forschungsethikkommission ratifiziert. Nabelschnurblut aus gesunden Spendern gewonnen wurde durch die Sydney Nabelschnurblutbank (Sydney, New South Wales, Australien) zur Verfügung gestellt. Volumen von ca. 100 mL wurden für dieses Verfahren verwendet.

Hinweis: In einer Klasse II Biosicherheit Schrank mit aseptischen Technik arbeiten. Das äußere des Kabel-Blutbeutel mit 70 % Ethanol zu dekontaminieren. Sterile Instrumente (Schere, Pinzette) für dieses Verfahren zu verwenden.

1. Schnur Blutkörperchen Vorbereitung und Isolierung von CD34 Zellen+

  1. Bereiten Sie sterile Trennung Puffer (SB) mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), bei pH 7,2 und mit 0,5 % bovine Serum Albumin und 2 mM EDTA.
  2. 10 mL SB in ein 50 mL konische Röhrchen (eine Röhre pro 10 mL Blut ist erforderlich) zu verzichten. Mit Hilfe einer G18 stumpfen Nadel montiert auf einer 10 mL Spritze, 10 mL Blut aus der Tasche ziehen und in der 50 mL Röhrchen mit 10 mL SB zu verzichten.
  3. Hinzugeben Sie 15 mL Lymphozyten Trennung Medien (siehe Tabelle der Materialien) an der Unterseite des Rohres, enthält das verdünnte Blut, zwei Schichten.
    Hinweis: Verzichten Sie Medien langsam an der Unterseite des Rohres zu vermeiden, mischen die verschiedenen Schichten.
  4. Zentrifugieren Sie Rohre bei 1.200 × g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit keinen Bruch und keine Beschleunigung.
  5. Übertragen Sie die Schicht nahe der Mitte des Rohres mit mononukleären Zellen (ca. 5-10 mL aus jeder Tube) in eine neue 50 mL-Tube mit einer Pasteurpipette. Jedes Rohr auf ein Gesamtvolumen von 50 mL SB hinzufügen.
  6. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min bei RT. verwerfen des Überstands.
  7. Aufschwemmen Sie Zelle Pellets sorgfältig mit einer Pasteurpipette in 5-10 mL GBL kombinieren die suspendierten Zellen und bringen Sie Volumen 50 mL mit SB.
  8. Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer oder automatisierte Zelle entgegen (siehe Tabelle der Materialien). Den Anteil der CD34 bestimmen Zellen+ in der Probe, Aufschwemmen 2,5 × 105 Zellen in 100 µL der SB und Fleck durch Zugabe von 10 µL Anti-CD34-PE Antikörper für 15-30 min bei 4 ° C. Analysieren von Durchflusszytometrie (Abbildung 1A).
  9. Zentrifuge Rohre bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie überstand.
    Hinweis: Wenn Sie nicht sofort benötigt, können Mononukleäre Zellen zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden.
  10. Aufschwemmen Sie Zellen in 300 µL der SB pro 108 Zellen. Hinzufügen von 100 µL der FcR menschliche IgG (blocking Reagenz, siehe Tabelle of Materials) und 100 µL CD34 magnetische Beads pro 108 Zellen. Vorsichtig mischen und bei 4 ° C für 30-40 min inkubieren.
    Hinweis: Eine einzelne Zelle Suspension ist erforderlich (wenn notwendig, übergeben den Zellen aber 30 µm Filter vor der Zugabe von Reagenzien). Verwenden Sie die Reagenz Bände hier beschrieben für 108 Zellen oder weniger. Für mehr als 108 Zellen, die Reagenzien (SB, blockiert Lösung und CD34 magnetische Beads) werden entsprechend skaliert.
  11. Bereiten Sie LS-Trennsäule während der Inkubationszeit, indem man die LS-Spalte in einem Magnethalter und waschen mit 3 mL GBL verwerfen das Abwasser.
    Hinweis: LS Trennsäulen können mit bis zu 2 × 108 total Zellen geladen werden. Kleinere und größere Spalten stehen zur Verfügung.
  12. Die Zelle Mischung 5-10 mL SB hinzu und Zentrifuge bei 400 × g für 10 min. Überstands verwerfen.
  13. Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL SB und laden Sie die Zellsuspension (1,5 mL) auf die LS-Säule. Sammeln Sie die Strömung durch die unbeschriftete Zellen in einem 15 mL Sammelrohr (negative Bruch #1). Lassen Sie die Flüssigkeit abtropfen und waschen Sie die Spalte mit 1,5 mL SB.
  14. Die gesammelten Lastfluss durch (3 mL) wieder in die Spalte und die Durchströmung in dem gleichen 15 mL Sammelrohr (negative Bruch #1) sammeln. Waschen Sie die LS-Spalte 3 Mal mit 3 mL SB.
    Hinweis: Bei Bedarf Zellen in den negativen Anteil (12 mL) können auch gebeizt mit Anti-CD34-Antikörper zu prüfen, Erfassung von CD34+ Zellen, die Spalte "LS".
  15. Entfernen Sie Spalte aus der Magnetabscheider und leeren Sie Zellen mit einem Spritzenkolben langsam in ein neues 15 mL Röhrchen mit 2 mL SB.
  16. Setzen Sie Spalte wieder auf Magnetabscheider und laden die 2 mL der Zellen in der Spalte. Die Durchströmung zu sammeln und mit 2 mL SB waschen. Dies ist der negative Teil #2 (4 mL).
  17. Magnetabscheider LS Spalte entfernen und 2 mL SB Flush Zellen stetig und fest mit einem Spritzenkolben die CD34 sammeln+ Zelle Bruchteil. Zählen Sie die Zellen mit Trypan blau Färbung und einem Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler.
  18. Zentrifugenröhrchen mit dem positiven Bruch bei 400 × g für 15 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Zellen in serumfreien Medien für CD34 Aufschwemmen+ Zellen (SFM, siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Wenn Sie nicht sofort benötigt, können Zellen in flüssigem Stickstoff zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden.

(2) Reinheit Check von isolierten CD34 Zellen+

  1. 2 x 104 Zellen aus der positiven Fraktion mit 10 µL Anti-CD34-PE Antikörper und 20 µL Anti-CD45-PerCP Antikörper für 15 min bei 4 ° C (Verwendung eine separaten tube für Isotype Steuerelemente) färben (Abbildung 1 b).
  2. Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min. Aufschwemmen Pellet in 200 µL des SB.
  3. Durchflusszytometrischen Analyse durchführen und Tor live Zellpopulation Schutt (Abbildung 1 b) auszuschließen. Das Tor für PE und PerCP positive Populationen mit Steuerelementen für PE und PerCP Isotype (Abbildung 1 b) und bestimmen den Prozentsatz der CD34+/CD45+ Zellen.

(3) Megakaryocyte Differenzierung

  1. Samen 5 × 105 Zellen/mL CD34+ Zellen in 2 mL SFM pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte mit 50 ng/mL rekombinanten menschlichen Thrombopoetin (RhTPO) ergänzt. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre. Wenn Zellen konfluierende sind, bevor sie für die Analyse erforderlich sind, die Zellen zu ernten und in mehrere Brunnen mit frischem Medien- und RhTPO aufgeteilt.
    Hinweis: Zwei oder drei Brunnen sollte bereit sein, speziell, Differenzierung zu verschiedenen Zeitpunkten (z.B. Tage 7, 9 und 10) zu überwachen.
  2. Ernten Sie Zellen aus den Brunnen beiseite stellen und Differenzierung zu überwachen, ohne die Zellen in den anderen Brunnen zu stören.
  3. Fleck-Zellen mit 20 µL Anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper und 10 µL Anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 Antikörper in einem Endvolumen von 100 µL. richten Sie ein Steuerelement Rohr mit den jeweiligen Isotype Kontrolle Antikörper. 15-30 min bei 4 ° c inkubieren
  4. Fügen Sie 1 mL SB zu waschen.
Zentrifugieren bei 400 × g für 10 min. überstand verwerfen und das Pellet in 200-300 µL SB Analyze durch Durchflusszytometrie aufzuwirbeln.
  • Analysieren Sie für jede Fluorophor die Isotype-Steuerelemente legen die Anspritzung FITC und Alexa Mehl 647 positiven Bevölkerung. Analysieren Sie die gefärbten Zellproben um den Prozentsatz der CD41 bestimmen+/CD42a+ doppelt positiven Zellen, die Reife MK (Abbildung 1) darstellen.
  • Für mikroskopische Darstellung der Zelle färben Oberflächenmarker Zellen wie in 3.3 beschrieben.
    1. Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in 100 µL der SB und Spin auf einem Objektträger bei 1.000 x g für 5 min. Fix Zellen auf der Folie durch Eintauchen in Methanol für 30 S. lufttrocknen hinzufügen 20 µL Medium mit DAPI zu montieren (siehe Tabelle der Materialien) , mit einem Deckglas abdecken und visualisieren mit einem fluoreszierenden Mikroskop (Abb. 2A).
  • Zur Visualisierung der intrazellulären Antigene Aufschwemmen Zellen mit PBS-Puffer und fixieren mit Paraformaldehyd (1 % Endkonzentration) für 15 min bei Raumtemperatur. Um die Zellen permeabilize, fügen Sie Triton-X 100 (0,1 %) und inkubieren Sie für 15 min. Waschen Zellen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100. Aufschwemmen in 100 µL der PBS/0.1% Triton-X 100, anti-vWf und Anti CD62p Antikörper (Verdünnung 1: 200) hinzufügen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    1. Waschen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100 und 400 × g für 10 min Zentrifugieren, in 100 µL des gleichen Puffers Aufschwemmen und Anti-Maus IgG-Alexa 594 und Anti-Kaninchen IgG-Alexa 488 (1: 100) hinzufügen. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, waschen mit 2 mL PBS/0.1% Triton-X 100 in 100 µL des gleichen Puffers Aufschwemmen und fügen Sie 20 µL anti-CD42b-APC. Dann drehen Sie die Zellen auf Glas-Objektträger zu, wie in Schritt 3.6.1 beschrieben und bereiten Sie Proben für mikroskopische Visualisierung vor, wie in Schritt 3.6.1 beschrieben.
  • Zur Bestimmung der Diploidie ernten Sie Zellen am Tage 12 oder 13 der Differenzierung. Fügen Sie 1 mL SB zu waschen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min und Fleck mit 20 µL Anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper in einem Endvolumen von 100 µL. bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
    1. Einmal mit 1 mL SB waschen und Aufschwemmen Pellet in 300 µL hypotone Citrat-Puffer (1,25 mM Natriumcitrat, Natriumchlorid 2,5 mM, 3,5 mM Traubenzucker) mit 20 µg/ml Propidium Jodid und 0,05 % Triton X-100. Inkubieren Sie für 15 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.
    2. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 20 µg/mL RNase und inkubieren Sie für 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Bestimmen Sie die Intensität der Propidium Jodid durch Durchflusszytometrie, durch das Sammeln von 30.000 bis 50.000 Veranstaltungen der Bevölkerung CD41-FITC+ (Abbildung 2).

    • 4. proplatelet zählen, Thrombozyten-Enumeration und Thrombozyten Aktivierung

    1. Ernten Sie Zellen (aus Schritt 3.1) Tage 8 oder 9 von Differenzierung und Saatgut an 1 × 104 Zellen/Brunnen in 48-Well-Platten in 200 µL des frischen SFM mit 50 ng/mL RhTPO ergänzt. Kultur für 5 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2.
      Hinweis: Quantifizierung Zwecken Samen Sie Brunnen in dreifacher Ausfertigung. Diese geringe Dichte ist erforderlich für die Visualisierung und Zählung des proplatelet-Lagers MK Proplatelets in der Regel starten, erscheinen nach 2 Tagen der Kultur. Der Höhepunkt ist zwischen 4 und 5 Tage.
    2. Die Anzahl der proplatelet tragenden MK in der ganze Brunnen auf einem inversen Licht Mikroskop mit 10 X oder 20 X Ziele.
      Hinweis: Ein beheiztes (37 ° C) Mikroskoptisch ist vorzuziehen, da halten die Zellen bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum bewirkt, Schrumpfung der proplatelet Erweiterungen dass. Proplatelets sind als lange Erweiterungen aus dem MK-Körper beobachtet. Jeder MK möglicherweise mehrere proplatelet Vorsprünge. Als Proplatelets zu entwickeln, sinkt der Körper des MK in der Größe.
    3. Zellen zu ernten und Zentrifugieren bei 400 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Färben Sie Zellen mit 20 µL Anti-Human CD41-FITC Antikörper, wie in 3.3 und 3.4 beschrieben. Berechnung des Prozentsatzes der proplatelet tragenden MK (PbMK): PbMK (%) = [(Proplatelet-Lager MKs/gut) / (Total CD41+ Zellen / gut)] X 100
    4. Plättchen in das Kulturmedium abgegeben zu zählen, sanft mischen Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 µL Tage 14 oder 15 Kultur.
      1. Färben Sie mit 20 µL Anti-Human CD41-FITC Antikörper für 20-30 min bei 4 ° C. Richten Sie ein Steuerrohr mit der jeweiligen Isotype Kontrolle Antikörper.
      2. Fügen Sie SB 150 µL und 50 µL Perlen zu zählen.
      3. Stellen Sie für durchflusszytometrischen Analyse FSC und SSC Skala anmelden. Einsatz normaler menschlicher Blutplättchen von Platelet-Rich Plasma mit CD41-FITC befleckt, wie beschrieben in Abschnitt 4.4.1 festzulegende gating für Thrombozyten (Abb. 3A).
      4. Analysieren Sie die gefärbten Plättchen mit Perlen von Durchflusszytometrie zählen. Sammeln Sie 1.000 Veranstaltungen zählen Perlen mit der FSC gegen SSC Streudiagramm (Abb. 3A). Berechnen Sie die Anzahl der Thrombozyten basierend auf CD41-FITC positive Ereignisse (Abb. 3 b) mit der Formel:
        Thrombozyten pro Mikroliter = [(Anzahl positiver Ereignisse CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/sample Volume)]
    5. Um Thrombozyten Aktivierung zu analysieren, vorsichtig mischen Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 µL Tage 14 oder 15 Kultur. Fügen Sie 1 mL Tyrode Puffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM Nahco33, 5,5 mM D-Glucose, pH 6,5) und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min zum pellet-Zellen.
      1. Sammeln Sie die überstand und Zentrifuge bei 800 X g für 10 min bis zum pellet-Thrombozyten-Partikel.
      2. Überstand verwerfen und in 100 µL Tyrode Puffer aufzuwirbeln. Hinzufügen einer Endkonzentration von 20 µM. 20 µL PAC1-FITC Antikörper und Adenosin-diphosphat (ADP) Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Analyze durch Durchflusszytometrie den Anteil positiver Ereignisse FITC bestimmen. Verwenden Sie frische menschlichen Thrombozyten auf die gleiche Weise als Positivkontrolle (Abbildung 3) behandelt.

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    Ergebnisse

    Dieses Protokoll ermöglicht die Zubereitung von MK hoch Reinkulturen von Schnur Blut stammenden CD34+ Zellen. Der Anteil der CD34+ Zellen in Schnur Blut ist etwa 1,3 %15 (Abbildung 1A) und die Gesamtzahl der mononukleären Zellen (Schritt 1,8) reicht von 90-300 x 106 Stück UCB. Die Reinheit von CD34 + / CD45 + Zellen nach Isolierung reicht von 90 bis 99 % (Abbildung 1 b). MK...

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    Diskussion

    Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für konsequente Produktion von MK und Thrombozyten in Kultur aus Nabelschnurblut. Diese Zellen können verwendet werden, um verschiedene Prozesse wie die Wirkung von Drogen oder biologischen Aktivitäten auf MK-Proliferation, Differenzierung, proplatelet Bildung und Produktion der Thrombozyten zu studieren.

    Eine Vielzahl von Kultur, Medien und Zytokin-Kombinationen sind in der Literatur vorgestellt worden. Addition von Zytokinen wie Stammzellen Faktor,...

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    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Danksagungen

    Die Autoren erkennen die Unterstützung des australischen Gesundheits- und Medical Research Council (Projekt Grant 1012409 verbunden mit BHC).

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    Cell Culture Reagents
    Rekombinantes humanes TPOMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605Serumfreie Medien für CD34
    + ZellenName>>KatalognummerComments
    CD34 Isolation Reagenzien
    CD34 MicroBead Kit ultrapureMiltenyi Biotec130-100-453Dieses Kit enthält das FcR humane IgG-blockierende Reagenz und CD34 Mikrobeads. Diese Kügelchen enthalten den Anti-CD34-Antikörperklon QBEND/10. Verwenden Sie für die Reinheitsprüfung einen anderen Anti-CD34-Klon (z. B. Klon 8G12).
    LymphoprepAlere Technologies1114545Lymphozyten-Trennmedium (Dichte 1,077 g/ml)
    Steriler Trennpuffer (SB)Miltenyi Biotec130-091-221Dieser Puffer enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,2 und 0,5 % Rinderserumalbumin und 2 mM EDTA. Es kann mit sterilen Komponenten in Zellkulturqualität hergestellt werden. Entgasen Sie vor dem Gebrauch, da Luftblasen die Säule verstopfen können.
    NameUnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
    Durchflusszytometrie und Zellfärbereagenzien
    PE Maus Anti-Human CD34BD Biosciences340669Klon 8G12. Dies kann für die CD34-Reinheitsprüfung verwendet werden. Endgültige Antikörperkonzentration 1:10 Verdünnung.
    PerCP Maus Anti-Human-CD45BD Biosciences3474641:10 Verdünnung
    PerCP IsotypkontrolleBD Biosciences3490441:10 Verdünnung
    FITC Maus Anti-Human-CD41aBD Biosciences340929Endgültige Antikörperkonzentration 1:5 Verdünnung.
    APC Maus Anti-Human-CD42bBD Biosciences551061Dieser Antikörper kann auch zum Nachweis von reifem MK verwendet werden (der Prozentsatz positiver Zellen ist in der Regel geringer als bei Anti-CD42a). Endgültige Antikörperkonzentration 1:10 Verdünnung.
    Alexa Fluor 647 Maus anti-human CD42aAbD SerotecMCA1227A647TDerzeit vertrieben von Bio-Rad. Endgültige Antikörperkonzentration 1:10 Verdünnung.
    Alexa Fluor 647 Maus Negative KontrolleAbD SerotecMCA928A647Derzeit vertrieben von Bio-Rad. Isotyp-Kontroll-Antikörper
    Anti-von-Willebrand-Faktor Kaninchen polyklonalAbcamAB69941:200 Verdünnung
    V450 Maus Anti-Humna CD41aBD Biosciences584251:20 Verdünnung
    V450 IsotypkontrolleBD Biosciences5803731:20 Verdünnung
    PAC1-FITC AntikörperBD Biosciences3405071:10 Verdünnung
    Anti-CD62p Maus monoklonalesAbcamAB66321:200 Verdünnung
    Alexa Fluor 488 Ziege Anti Kaninchen IgGInvitrogenA110081:100 Verdünnung
    Alexa Fluor 594 Ziege Anti Maus IgGInvitrogenA110201:100 Verdünnung
    Ig Isotyp Kontrolle Cocktail-CBD Biosciences558659Isotyp Kontrolle
    Antikörper Propidium iodid SigmaAldrichP4864
    CountBright Absolute Counting BeadsMolecular Sonden, InvitrogenC36950Zählperlen
    Name<strong>CompanyKatalognummer<>Kommentare
    Materials
    LS SäulenMiltenyi Biotec130-042-401Kleinere und größere Säulen sind auch im Handel erhältlich
    MidiMACS SeparatormagnetMiltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5 ml FACS-Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden, mit Schnappverschluss, sterileIn-vitro-Technologien352063
    GlasobjektträgerMenzel-GlaserJ3800AMNZ
    Eindeckmittel mit DAPIVector LaboratoriesH-1200Eindeckmittel mit DAPI
    strong>NameCompanyKatalognummer<>Kommentare
    Equipment
    Inverses MikroskopLeicaDMIRB Inverses Mikroskop
    FluoreszenzmikroskopZeissVert.A1
    ZellanalysatorBD BiosciencesFACS Canto II
    Cytospin ZentrifugeThermoScientificCytospin 4
    NameCompanyKatalog AnzahlKommentare
    Software
    ZellanalysesoftwareBD BiosciencesFACS Diva Software
    Einzelzellanalyse-SoftwareTree StarFlowJo
    Fluoreszenzmikroskop-SoftwareZeissZen 2 blue edition
    <

    Referenzen

    1. Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
    2. Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
    3. Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
    4. Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
    5. Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
    6. Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
    7. Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
    8. Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
    9. Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
    10. Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
    11. Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
    12. Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
    13. Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208(2016).
    14. De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
    15. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
    16. Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
    17. Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
    18. Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
    19. Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
    20. Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
    21. Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
    22. Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).

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