Method Article

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

DOI:

10.3791/56444

⸱

November 16th, 2017

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Routinemäßige Nachweismethoden nutzen virale Genom Verstärkung sind durch ihre Unfähigkeit, infektiöse von nicht-infektiöse Partikel unterscheiden begrenzt. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle nach alternativen Methoden zur Diskriminierung von ansteckenden Norovirus Teilchen mit Aptamer Bindung, dynamische Lichtstreuung und Transmissions-Elektronenmikroskopie Unterstützung bieten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menschlichen Norovirus fordert erhebliche öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Verluste weltweit. Schwellenländer in Vitro sind Anbau Fortschritte noch nicht anwendbar für routinemäßige Nachweis des Virus. Die aktuelle Erkennung und Quantifizierung Techniken, die in erster Linie auf Nucleinsäureamplifikation angewiesen sind, diskriminieren nicht infektiöse von nicht-infektiöse Viruspartikel. Der Zweck dieses Artikels ist es, spezifische Details über die jüngsten Fortschritte in Techniken zusammen, um weitere Informationen über den Status der Infektiosität der Viruspartikel erwerben zu präsentieren. Eine Technik beinhaltet die Beurteilung der Bindung von einer Norovirus SsDNA Aptamer, Capsids. Aptamere haben den Vorteil des Seins leicht synthetisiert und geändert und sind preiswert und stabil. Eine andere Technik, dynamisches Licht Streuung (DLS), hat den Vorteil der Beobachtung Kapsid Verhalten in Lösung. Elektronen-Mikroskopie ermöglicht eine Visualisierung der strukturellen Integrität der viralen Capsids. Obwohl mit dem Versprechen, gibt es einige Nachteile, jede Technik, wie z. B. Aptamer unspezifische Bindung an positiv geladene Moleküle aus Probe Matrizen, Erfordernis der gereinigten Kapsid für DLS und schlechte Empfindlichkeit für Elektronenmikroskopie. Dennoch, wenn diese Techniken in Kombination verwendet werden, versorgt den Körper der produzierten Daten umfassenderen Informationen auf Norovirus Kapsid Integrität, die verwendet werden, um die Infektiosität, Informationen ableiten, die wesentlich für die genaue Bewertung der Inaktivierungsverfahren oder Auslegung der Virenerkennung. Dieser Artikel enthält Protokolle für den Einsatz dieser Methoden, um menschlichen ansteckenden Norovirus Teilchen zu unterscheiden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menschlichen Norovirus ist verantwortlich für eine beträchtliche öffentliche Gesundheit Belastung weltweit verursacht ca. 685 Millionen Erkrankungen und 212.000 Todesfälle jährlich1, zu einem Preis in den Milliarden von Dollar2,3. Heute, beinhaltet Norovirus-Erkennung und Quantifizierung Genom Verstärkung bzw. Liganden-basierten Plattformen. Ersteres wird in der Regel bevorzugt, da es empfindlicher ist, quantitative Informationen liefert und in der Regel geringere Gefahr von falsch-positive Ergebnisse4 hat. Die am häufigsten verwendete Norovirus Erkennung und Quantifizierung Genom Verstärkung Technik ist Reverse Transkriptase quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Denn es richtet sich an und ein kleines Segment des menschlichen Norovirus-Genoms verstärkt, RT-qPCR allein ist nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen dem infektiösen und nicht-infektiöse Partikel als kostenlose genomischen RNA, beschädigt tödlich Capsids mit Genomen und Capsids mit mutiert/abgeschnitten Genome können durch RT-qPCR noch verstärkt werden. Während vor kurzem zwei neue in-vitro- Kultivierung Techniken für menschliche Norovirus5,6 gemeldet wurden, beide noch verlassen sich auf RT-qPCR Virus Quantifizierung und noch nicht machbar Methoden für die routinemäßige klinische/Umwelt Tests für menschliche Noroviren. RT-qPCR bleibt daher den Goldstandard für klinische/Umwelttests.

Andere in-vitro- Methoden entstanden in dem Bemühen, die Infektiosität Status des Norovirus Partikel besser abschätzen zu können. Diese Methoden können in der Regel als diejenigen, die die Integrität der Norovirus Kapsid ansprechen und die Bewertung von Genom Integrität kategorisiert werden. Das erste Verfahren wird immer beliebter. Eine häufig verwendete Methode ist RNase Vorbehandlung vor der Extraktion der viralen genomischen RNA, aber dies nicht berücksichtigt werden, Viruspartikel, die intakt bleiben, aber nicht über die Fähigkeit, Host-Rezeptoren/co-Faktoren zu binden sowie Viruspartikel, die tödlich mutiert haben oder abgeschnitten oder Genome7geringfügig beschädigt haben. Kapsid Integrität kann auch ausgewertet werden, basierend auf die Fähigkeit des Virus binden an menschlichen Norovirus co-receptor/co-Faktoren, die Kohlenhydrate sind bekannt als Histo-Blut Gruppe Antigene (HBGAs). HBGAs sind in intestinalen Epithelzellen Host als Bestandteil von Glykoproteinen oder Glycolipide (unter mehreren anderen Geweben) und in Körperflüssigkeiten wie Speichel abgesondert werden kann. Magensaftresistente Bakterien mit HBGA-ähnlichen Substanzen auf ihrer Oberfläche haben auch gezeigt, dass menschliche Norovirus8,9,10binden und solche Interaktionen können Norovirus Infektion5fördern. Das grundlegende Konzept der Verwendung HBGA Bindung ist, dass nur virale Partikel binden die vermeintliche Rezeptor/co-factor in der Lage wäre, Zellen zu infizieren. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Wulst-basierte HBGA Bindung vor Nucleinsäureamplifikation eine viel versprechende Methode für Infektiosität Diskriminierung11,12,13,14ist, 15,16. Eine große Herausforderung für HBGAs ist, dass kein einziges HBGA Typ alle menschlichen Norovirus Genotypen binden kann. Um dieses Problem anzugehen, hat Schwein Magen Mucin, die HBGAs enthält, anstelle von gereinigten HBGA Kohlenhydrate im Interesse der einfachen Synthese, Konsistenz und reduzierten Kosten eingesetzt.

Einer kürzlich erschienenen Publikation von Moore Et al. 17 führte eine Reihe von neuen Techniken für die Schätzung der menschlichen Norovirus Kapsid Integrität. Anstelle von HBGAs, Moore Et al. 17 Bindung eines weitgehend reaktiven Nukleinsäure-Aptamer (M6-2)18 und im großen und ganzen reaktive monoklonaler Antikörper (NS14)19 , wärmebehandelte GII.4 Sydney Norovirus Capsids (virusähnliche Partikel oder untersuchten) untersucht und verglichen um die Bindung an synthetischen HBGAs. Nukleinsäure-Aptamere sind kurz (~ 20-80 nt) einzelne gestrandeten Nukleinsäuren (SsDNA oder RNA), die Falten zu einzigartigen dreidimensionalen Strukturen als Folge ihrer Sequenz und ein Ziel zu binden. Weil sie Nukleinsäuren sind, sind sie weniger kostspielig; leicht chemisch synthetisiert, gereinigte und modifiziert; und stabil gegen Hitze. Mehrere Berichte von Aptameren generiert gegen Noroviren gibt, mit einigen von ihnen zeigen breite Reaktivität verschiedener Stämme18,20,21,22. Zum Beispiel, Moore Et al. 17 unter Beweis gestellt, dass Aptamer M6-2 verpflichtet, gereinigt, zusammengebauten menschlichen Norovirus Capsids (untersuchten) und verhielt sich ähnlich, HBGA in die Abhängigkeit von der viralen Kapsid zu höherer Ordnung (z. B. sekundäre und tertiäre) Protein-Struktur für verbindliches auftreten. Auf der anderen Seite blieb ein erheblicher Anteil der Norovirus VLP Bindung an Antikörper NS14 nach Capsids völlig denaturiert wurden. Bewertung der Norovirus-Bindung in der Studie von Moore Et al. 17 erfolgte über eine einfache Platte-basierte Methode ähnlich wie ELISA, mit der Ausnahme, dass Aptamere anstelle von Antikörpern verwendet werden (daher ist die Methode ELASA hieß). Diese experimentellen Hochdurchsatz-Methode wurde zur Bewertung der Auswirkungen verschiedener Therapien auf das Norovirus Kapsid, Arbeit, die für das Verständnis des Mechanismus der viralen Inaktivierung bei Belastung durch physikalische oder chemische Stressoren wertvoll ist. Ein Nachteil dieser Methode ist jedoch die geringere Empfindlichkeit und Mangel an Toleranz für Matrix-assoziierte Kontaminanten auf höheren Ebenen, die unspezifische Bindung von Aptameren verursachen.

Moore Et al. 17 verwendet eine andere Methode, dynamische Lichtstreuung (DLS), Aggregation der Viruspartikel als Reaktion auf Wärmebehandlung zu überwachen. DLS ist häufig verwendet, um die Größe der Nanopartikel-Suspensionen zu bewerten und auf Proteine23,24 und Viren25,26,27erweitert. Die Intensität des Lichts verstreut durch Partikel in Lösung schwankt in Abhängigkeit von der Partikelgröße, so dass für die Berechnung des Diffusionskoeffizienten und dann Partikeldurchmesser mit bewährten Formeln. Die DLS-Technik kann den hydrodynamischen Durchmesser der dispergierten Partikel bis in den Nanobereich unterscheiden, die ermöglicht die Erkennung von verteilten Viren, individuelle Kapsid-Proteine oder Dimere und Virus-Aggregate, die anhand der Größe27. Virus-Aggregation, vertreten durch eine Erhöhung der Partikelgröße, zeugt vom Verlust der Integrität Kapsid. Das Kapsid ist denaturiert und seine Struktur gestört, hydrophoben Überreste ausgesetzt werden und dazu führen, dass die Teilchen zusammenhalten und Aggregate zu bilden. DLS kann verwendet werden, zur Messung der Partikelgröße nach einer bestimmten Behandlung oder die Kinetik der Aggregation in Echtzeit17,28. Diese Methode erfordert hohe Konzentrationen von gereinigten Kapsid, die möglicherweise nicht ganz repräsentativ für das Virus in seinem natürlichen Zustand aber hat den Vorteil, dass Beobachtung des Verhaltens Kapsid in Lösung.

Die letzte Methode von Moore Et Al. genutzt 17 Jahre alt war Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM). Obwohl diese Methode Empfindlichkeit fehlt und keine quantitative Daten erzeugt, ermöglicht es für die Visualisierung der Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf die virale Kapsid-Struktur. Obwohl nicht noch ideal für klinische/Umgebungseinstellungen, ist der Einsatz dieser Methoden in Kombination wertvolle menschliche Norovirus Inaktivierung zu verstehen. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle für die Platte basierende Bindung-Assay (ELASA), DLS, bieten und TEM Vorbereitung Methoden untersuchen die Auswirkungen der Wärmebehandlungen auf das Norovirus Kapsid im Zusammenhang mit den Behandlungen Auswirkungen auf Kapsid Integrität im Moore Et Al. vorgestellt 17.

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Protocol

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1. Platte-basierte verbindlich Test zur Bewertung der Verlust der höheren Norovirus Kapsid Auftragsstruktur

Hinweis: ein sehr ähnliches ELASA Protokoll zu dem hier vorgestellten wurde veröffentlicht 29, und ähnliche ELASA Assays zuvor gemeldet wurden als Teil der Forschung anderswo 17 , 18 , 22 Artikel.

  1. Wärmebehandlung von menschlichen Norovirus GII.4 Sydney Capsids
    1. erhalten gereinigte menschlichen Norovirus großen Kapsid Protein (VP1) von GII.4 Sydney (Beitritt: JX459908) montiert in Capsids.
      Hinweis: Capsids in der Studie wurden mit freundlicher Genehmigung von R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
    2. Verdünnt Capsids zu 50 µg/mL in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) auf eine maximale Lautstärke von 15 µL in aufgestellter PCR Einzelrohren. Sicherstellen, dass das Rohr mindestens 600 enthält ng Kapsid. Sicherzustellen, dass es 600 ng Kapsid pro Behandlung-Liganden Kombination.
    3. Vorheizen Thermocycler gewünschte Wärmebehandlung.
      Hinweis: für die Zwecke dieses Protokolls, Behandlung bei 68 ° C für die verschiedenen Tageszeiten (0 - 25 min) gewählt wurde.
    4. Heizen eine zusätzliche Thermocycler bis 4 ° C für sofortige Kühlung. Die Thermocycler Röhren mit Kapsid-Lösung für die gewünschte Zeit hinzufügen. Sofort nach dem Erhitzen auf Cycler vorgekühlte 4 ° C für 5 min übertragen.
      1. Include 95 ° C für 5 min Behandlung als denaturiert Kapsid Kontrolle. Sind sie unbehandelt (23 ° C) Kapsid Lösung als Positivkontrolle. PBS mit keine Kapsid als eine zusätzliche negative Kontrolle enthalten.
    5. Kurz spin-down in einer Zentrifuge, alle Tropfen an der Unterseite des Rohres und die behandelten Kapsid Lösungen mit PBS-Puffer bis 3 µg/mL zu verdünnen. Sicherzustellen, dass es mindestens 200 µL verdünnt, behandelten Kapsid (100 µL/Well).
  2. Gelten 100 µL Kapsid Lösung in jede Vertiefung, gibt es mindestens zwei Brunnen pro Behandlung zu gewährleisten. Darüber hinaus gehören Sie 2 Kontroll-Vertiefungen mit 100 µL PBS für jedes Liganden; Dadurch wird die Hintergrund Extinktion des Assays. Die Platte mit einem Deckel abdecken, Versiegelung der Kanten mit Paraffin film um die Verdunstung zu reduzieren, und lassen über Nacht auf ein Schütteln Inkubator bei 4 ° C oder 2 h bei Raumtemperatur.
  3. Vorbereitung den blockierenden Puffer durch die 5 % Magermilch Feststoffe (w/V) in PBS mit 0,05 % Tween 20 (PBST).
  4. Entfernen die behandelten Kapsid-Lösungen von der Platte. Fügen Sie 200 µL/Well des blockierenden Puffer. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren oder verschlossen über Nacht bei 4 ° c
    5. Vorbereiten der Ligand verbindliche Lösungen für die biotinylierte Aptamer M6-2 18 , 29 und biotinylierte synthetischen HBGA Blutgruppe A oder biotinylierte Typ H.
    1. Verdünnt biotinylierte Aptamer bis 1 µM in Nuklease-freies Wasser. Sicherzustellen Sie, dass es genug Lösung für 200 µL total für jede Behandlung. Verdünnen Sie der gewählten biotinylierte HBGA zu 30 µg/mL in der blocking-Puffer. Sicherzustellen, dass es genug Lösung für 200 µL Gesamtvolumen für jede Behandlung.
      Hinweis: Um weniger HBGA zu verwenden, können 10 µg/mL HBGA in 0,25 % Magermilch-PBST ersetzt werden. Konzentrationen für biotinylierte M6-2 und HBGA wurden bisher optimiert und berichtet.
  6. Blockierende Puffer zu entfernen und waschen Sie die Platten 3 Mal mit 200 µL/Well PBST. Klopfen Sie die Platte auf dem Kopf stehend auf sterilen Papiertüchern trocknen die Restfeuchte.
  7. Hinzufügen 100 µL/Well des Liganden verbindliche Lösungen, um sicherzustellen, dass es 2 Brunnen pro Wärmebehandlung-Liganden-Kombination gibt. Die Platte bedeckt mit einem Deckel auf einem Orbitalschüttler bei ca. 60 u/min für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: Achten Sie darauf, 2 Brunnen der unbehandelten Capsids und völlig denaturierten Capsids für jede Liganden bzw. als positive und negative Kontrollen umfassen. Darüber hinaus gehören 2 " keine Kapsid " Brunnen für jeden Liganden wie die Platte Hintergrund Kontrolle.
  8. Entfernen die Liganden-Lösungen und die Brunnen 3 Mal mit 200 µL/Well PBST waschen. Pat die Platte auf dem Kopf stehend auf sterilen Papiertüchern Restfeuchte trocknen.
  9. Hinzufügen 100 µL/Well-Lösung von 0,2 µg/mL Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase mit PBS-Puffer. 15 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
    Hinweis: Verschiedene Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugate haben unterschiedliche Konzentrationen. Wenden Sie sich an den Benutzer ' s-Handbuch für den idealen Bereich der Konzentrationen für ELISA Anwendungen des Enzyms und achten Sie darauf, dass es optimal ist.
  10. Die konjugierte Lösung entfernen. Waschen Sie 3 Mal mit 200 µL/Well PBST. Pat die Platte auf dem Kopf stehend auf sterilen Papiertüchern Restfeuchte trocknen.
  11. Hinzufügen 100 µL/Well 3,3 ', 5,5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) Substrat, und lassen Sie die Farbe für 5-15 min. beobachten Negativkontrolle Brunnen für jede Farbe und achten Sie darauf, konsequent für den gleichen Zeitraum zwischen replizieren Platten entwickeln entwickeln. Beachten Sie die Extinktion-Palette von der Platte-Leser verwendet, sowie.
    Hinweis: Die Entwicklungszeiten können unterscheiden sich je nach der Qualität der verwendeten Liganden/Reagenzien.
  12. Halten die Entwicklung der Reaktion mit 100 µL/Well 1M Phosphorsäure. Lesen Sie sofort Platte bei 450 nm. Sichern Sie Ihre Daten.
    Hinweis: Einführung der Säure in der Regel die Reaktion drastisch verlangsamt aber nicht völlig stoppen. Lassen Sie die gestoppte Platte nicht für einen längeren Zeitraum hinweg vor dem Lesen der Extinktion.

2. Analyse der Untersuchungsergebnisse Platte-basierten

  1. sichern Sie die rohen Extinktion-Daten in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Die durchschnittliche Absorptionswerte für jedes gut mit der spezifischen Behandlung und Liganden zu produzieren. Verwenden Sie diese Durchschnittswerte für alle nachfolgenden Analysen.
    Hinweis: Vergleichen Sie beide gut Absorptionswerte um sicherzustellen, dass keine Paare von Brunnen deutlich unterschiedliche Werte haben.
  2. Analysieren die absolute Kapsid Integrität (alle Bindung), subtrahieren die rohe Extinktion von der " keine Kapsid " Steuerung von jedem anderen Extinktion Beispielwert.
    Hinweis: Alternativ kann Verlust der Bindung durch den Verlust der höheren Ordnung (sekundären, tertiären, Quartär) Struktur direkt analysiert werden. Statt die Extinktion des Kontrollstreifens negativ (keine Kapsid) subtrahieren, subtrahieren Sie den Wert des Steuerelements vollständig denaturierten Kapsid. Dieser entfernt alle verbindenden signal aufgrund der unspezifischen Bindung an den Apparat als auch aufgrund der Kapsid Reihenfolge verbindlich. HBGA und Aptamer M6-2 Anzeigen wenig Bindung völlig denaturierten Kapsid, so dass beide Methoden ähnliche Ergebnisse produziert. Falsches positives Signal unspezifische Aptamer Bindung zugeschrieben betrachtet werden, bei der Wahl der Analyse verwenden.
  3. Mit der negativen oder denaturierte Steuerung angepasst Absorptionswerte, die Behandlung Absorptionswerte durch ihre jeweiligen positiven (keine Behandlung) Steuern Absorptionswerte und multiplizieren dividieren durch 100. Dadurch wird den Anteil des Signals von der behandelten Kapsid gegenüber der unbehandelten Kontrolle.
    4. Subtrahieren Sie
  4. zur Schätzung des verbindlichen Signal für jede Liganden auf die Kapsid-Sequenz, die " keine Kapsid " negative Kontrolle von der anfänglichen Absorptionswerte, und nehmen Sie die angepasste Extinktion von denaturierten Kapsid. Teilen Sie dies durch die angepassten Extinktion des positiven Steuersignals und mit 100 multiplizieren. Dies gibt die scheinbaren Prozentsatz des Signals durch Liganden Bindung an denaturierten Kapsid/Kapsid Sequenz.

3. DLS zum Nachweis von Virus-Aggregation nach der Wärmebehandlung

Hinweis: Die folgenden Schritte möglicherweise spezifisch für die Software und Instrument verwendet, können aber angepasst und zu ähnlichen Geräten angewendet werden kann.

  1. Erstellen eine neue Größe SOP in der DLS Instrument Software verwenden: Material = Protein, Dispergiermittel = PBS, Temperatur = 25 ° C, Gleichgewichtherstellung Zeit = 0 sec, Zelltyp = Einweg-Küvette (kleines Volumen, ZEN0040), Messwinkel = 173° Backscatter, Messdauer = Automatik, Anzahl der Messungen = 3, Verzögerung zwischen Messungen = 0 sec, Datenverarbeitung: Analysemodell = General Purpose (normale Auflösung). Verwenden Sie die Standardeinstellungen für alle anderen Parameter.
  2. Wählen Sie den grünen laufen Pfeil innerhalb der Software, und das Beispiel zu nennen.
  3. Schritte 1.1.1 bis 1.1.4 für die Wärmebehandlung von untersuchten.
  4. Verdünnt die Hitze untersuchten 01:10 in 1 X PBS für eine Endkonzentration von 5 µg/mL behandelt. (Optional) Filtern Sie die Probe mit einer 1 µm Porengröße, Staubpartikel zu entfernen; DLS ist sehr empfindlich gegenüber Staub, wie große Partikel wesentlich mehr Licht als Teilchen streuen.
  5. Transfer 50 µL verdünnter untersuchten in einem kleinen Volumen Einweg-Küvette. Legen Sie die Küvette in die Probenkammer des Instruments.
  6. Den Durchlauf starten und verwenden die ' Correlogram ', ' Cumulants Fit ', und ' Experte Beratung ' Registerkarten, um die Datenqualität zu bewerten.
    1. Während des Laufs zu prüfen, ob die Polydispersität-Index-Wert kleiner als 0,3 ist, stellvertretend für eine Qualität Messung. In der ‘ MV ’ tab, stellen Sie sicher der Korrelationskoeffizient ist konstant und in der Nähe, aber nicht mehr als 1, in kurzer Zeit und scharf auf 0 zu einem späteren Zeitpunkt, charakteristisch für Partikelgröße abfällt. Verwendung der ‘ Rat Experten ’ Registerkarte für Rückmeldung über die Qualität der Daten während der Messungen.
    2. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, überprüfen Sie nochmals, dass die Polydispersität-Index-Wert ist kleiner als 0,3. Stellen Sie sicher, dass die Cumulants Linie folgt passen die Datenpunkte genau in die ‘ passen Cumulants ’ tab.
  7. Nehmen im Durchschnitt von der Z-Durchschnitt Partikeldurchmesser für jede Messung als die Partikelgröße von jeder Probe berichtet. Plot den Durchmesser in nm vs. Temperatur in ° c

4. DLS zur Erkennung von Viren Aggregation in Echtzeit

Hinweis: die folgenden Schritte möglicherweise spezifisch für die Software und Instrument verwendet, können aber angepasst und zu ähnlichen Geräten angewendet werden kann.

  1. Erstellen eine neue Größe SOP in der DLS Instrument Software verwenden: Material = Protein, Dispergiermittel = PBS, Temperatur = als gewünschte, Gleichgewichtherstellung Zeit = 0 sec, Zelltyp = Quarz Küvette, Messwinkel = 173° Backscatter, Messdauer = Automatik, Anzahl der Messungen = 50 (möglicherweise erhöhten oder verringerten Abhängigkeit von Aggregation Rate), Verzögerung zwischen Messungen = 0 sec, Datenverarbeitung: Analysemodell = mehrere schmale Modi (hohe Auflösung). Verwenden Sie die Standardeinstellungen für alle anderen Parameter.
  2. Wählen Sie die Ausführungspfeil innerhalb der Software zu öffnen und ein neues Beispiel zu nennen, und ermöglichen das Instrument, das Temperatur-Gleichgewicht zu erreichen.
  3. Aussetzen der untersuchten mit 1 X PBS-Puffer in einem Microcentrifuge Schlauch in einer Konzentration von 5 µg/mL und ein Volumen zwischen 200-500 µL. Wirbel der Aufhängung.
  4. Spin-down der VLP-Aufhängung für 5-10 s in einer Tischplatte Zentrifuge zu de-Gas. Dies verhindert, dass Blasenbildung bei der Wärmebehandlung die Größenmessungen stört.
  5. Übertragung der VLP Aussetzung zu ein kleines Volumen Quarz Küvette vermeiden Sie Luftblasen und pipette langsam gegen die Wand von der Küvette. Nachdem das Instrument Temperatur Gleichgewicht erreicht hat, setzen Sie die Küvette in die Probenkammer.
  6. Warten 10 s für die Temperatur der Probe zu equilibrate, dann den Durchlauf starten. Starten Sie einen Timer zu Beginn des Laufs. Stoppen Sie die Zeitmessung am Ende der ersten Messung. Nutzt diese Zeit als die ersten Zeitpunkt. Späteren Zeitpunkt Punkte erzielen, von der Messzeiten von der Software erfasst.
  7. Den Durchlauf starten und überwachen die Correlogram, Verteilung passen und kompetente Beratung, die Datenqualität zu bewerten.
    Hinweis: Die PDI wird nicht unbedingt, dass weniger als 0,3 für diese Messungen wie die Probe, während der Anhäufung Polydisperse sein soll.
    1. Stellen Sie sicher der Korrelationskoeffizient ist konstant und in der Nähe, aber nicht mehr als 1 in kurzer Zeit und zu einem oder mehreren späteren Zeiten, charakteristisch für Partikelgröße stark abfällt.
    2. Sicherstellen, dass die Verteilung passen Linie folgt die Datenpunkte eng.
  8. Größe Datenanalyse.
    1. Bestimmen jeweils Punkt aus der Zeitdifferenz zwischen jeder Messung und die erste Zeit-Punkt. Dauer der Messung sind nicht alle genau das gleiche.
    2. Mit eine Intensitätsverteilung, die Größe der Gipfel mit den größten Flächen für jede Messung/Zeitpunkt erfassen.
    3. Zeichnen Sie die Peak-Durchmesser in nm vs. Zeit in min.

5. TEM Probenvorbereitung

  1. erhalten Kohlenstoff Unterstützung Film (Nickel) Raster entworfen für TEM.
    Hinweis: Wenden Sie sich an die zentrale Einrichtung auf empfohlene Reagenzien und deren Handhabung für den Einsatz mit dem Anlage-Mikroskop. Achten Sie darauf, Gitter in eine Kiste mit Trockenmittel oder eine Vakuumkammer zur Minimierung der Exposition gegenüber Feuchtigkeit zu speichern.
  2. Reißen ca. 5 x 5 cm Stück Filterpapier. Erhalten Glas Petrischalen und ordnungsgemäße selbstschließende Pinzette für den Einsatz in der Mikroskopie umkehren.
  3. Schneiden Sie ca. 2,5 x 5 cm Stück Paraffin Film. Auf die Benchtop.
  4. Wärmebehandlung von Norovirus GII.4 Sydney Capsids
    1. die Wärmebehandlung Schritte genau wie oben beschrieben in Schritte 1.1.1 - 1.1.5 außer: 10 mM HEPES (pH 7,4) für Behandlung anstelle von PBS und Capsids nicht weiter verdünnen nach der Behandlung (halten Sie Lösung bei 50 µg/mL). Pipette die gesamte ~ 15 µL Tropfen auf Paraffin Film behandelten Kapsid.
  5. Greifen die Raster-Kante mit einer Pinzette, so dass sie am Rand um das Raster zu halten in der Nähe und legen Sie die Gitter Kohlenstoff-Side-Down auf den Tropfen der behandelten Lösung. Lassen Sie für 10 min erlauben das Kapsid Anfügen an das Raster inkubieren.
    1. Abhängig von der Reinheit der Kapsid Zubereitung wäscht von 10 mM HEPES Lösung bei Bedarf hinzugefügt werden in Form von 10-15 µL Tröpfchen in Zeile nach der behandelten Kapsid Tropfen gestellt.
    2. Nach 10 min, nehmen Sie das Raster mit den Tropfen. Platzieren Sie das Raster fast senkrecht auf ein Stück Filterpapier, entfernt das Droplet Docht. Das Tröpfchen von 10-15 µL HEPES-Puffer mit dem Raster abholen, halten Sie für 30 s, dann Docht entfernt mit einem anderen Stück Filterpapier, Wash
  6. Einen 15 µL Tropfen 2 % Uranyl-Acetat-Lösung auf dem Paraffin-Film in einem leeren Bereich zu platzieren.
    1. Nehmen Sie das Droplet Uranyl-Acetat mit dem Gitter und halten für 45 S. Wick entfernt Uranyl-Acetat, wobei Sie auf die meisten der Lösung zu entfernen. Stellen die Gitter Kohlenstoff-Seite nach oben auf ein Stück Filterpapier, wobei Sie darauf achten, dass das Raster nicht " Stick " an der Feuchtigkeit auf die Pinzette. Das Filterpapier mit dem Gitter aufsetzen, in einem offenen Glas Petrischale.
      Hinweis: Verwenden Sie Kunststoff Petrischalen, nicht, wie die Netze sie elektrostatisch angezogen werden und stecken zu Gericht.
  7. Wiederholen Sie für alle Behandlungen. Legen Sie die Petrischale-Hälften mit den Netzen in einem Exsikkator über Nacht zum Trocknen vor der Beobachtung mit TEM.
  8. Wenden Sie sich an die Mikroskopie-Anlage an der jeweiligen Institution in Bezug auf die vorbereiteten Gitter zu beobachten. Einige Einrichtungen ermöglichen dem Nutzer auf den Betrieb ihrer Anlage ausgebildet werden ' s Instrument. Bestimmte Details über die Einrichtung und die Beobachtung eines speziellen Mikroskops ist bEyond den Rahmen dieses Artikels sprengen.

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Results

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Die strukturelle Integrität des menschlichen Norovirus GII.4 Sydney Capsids (untersuchten) wurde anhand mehrere neuartige Methoden wie von Moore Et Al. vorgestellt 17. zunächst ein Experiment wurde durchgeführt, die die Integrität des Capsids in Abhängigkeit von ihrer Fähigkeit, eine vermeintliche Rezeptor/co-factor (HBGA) oder SsDNA Aptamer (M6-2) binden waren im Vergleich (Abbildung 1). Die angezeigten Ergebnisse wurden bish...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll und die hier beschriebenen Techniken bieten ein Mittel zur Bewertung der menschlichen Norovirus Kapsid Integrität/Funktionalität. Diese Methoden können verwendet werden, für den Erhalt der mechanistische Einblicke in die Auswirkungen der Inaktivierung Behandlungen gegen das Virus und können potenziell traditionellere Inaktivierung Bewertungsmethoden wie RT-qPCR oder Plaque-Assay ergänzen. Beispielsweise sieht die Bewertung der chemischen oder physikalischen Inaktivierung durch Plaque-Assay allein ein Maß fü...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Agriculture and Food Research Initiative wettbewerbsfähige Grant Nr. 2011-68003-30395 vom United States Department of Agriculture, nationalen Institut für Ernährung und Landwirtschaft im Rahmen des NoroCORE Projekts unterstützt. Open-Access-Gebühr wurde von der United States Department of Agriculture finanziert. Wir möchten danken Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) freundlicherweise uns zur Verfügung gestellt die gereinigten Capsids und Valerie Lapham für ihre Unterstützung bei der TEM-Bilder. Wir möchten auch Frank N. Barry Danke für Ihre Hilfe die Experimente vorgestellt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
plattenbasierter Bindungsassay zur Bewertung des Verlusts der Norovirus-Kapsidstruktur höherer Ordnung
96-Well, mittelbindende Polystyrol-EIA-PlatteFisher (Costar)07-200-36
Deckel für 96-Well-PlatteThermo Fisher3098
Paraffinfilm (Parafilm)Thermo FisherPM999
1x PBS (pH 7,2)Life Technologies20012-050
Polysorbat 20Sigma-AldrichP9416
1x PBS (pH 7,2) + 0,05% Polysorbat 20N/AN/A
Gereinigte, assemblierte humane Noroviren GII.4 KapsideN/AN/A
Einzelne 0,2 ml PCR-RöhrchenGenesee Scientific22-154G
2 ThermocyclerBio-Rad
Mini-TischzentrifugeFisher Scientific12-006-901
MagermilchtrockenmasseThermo FisherLP0031B
Synthetisches Histo-Blutgruppen-Disaccharid Typ A, biotinyliertGlycotech01-017
Biotinyliertes Aptamer M6-2 (Stammkonzentration 100 &; Mikro; M in nukleasefreiem Wasser): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (ELISA-Qualität), Wir verwenden Life Technologies SNN2004Life TechnologiesSNN2004
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat, RaumtemperaturThermo Fisher50-76-00
1 M PhosphorsäureN/AN/A
Mikroplatten-Reader in der Lage, 450 nmTecanInfinite m200 Pro
NameCompanyKatalognummerComments
Analyse von plattenbasierten Assay-Ergebnissen
Microsoft Excel oder ähnliches ProgrammN/AN/A
Name<>Unternehmen<>KatalognummerKommentare
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, oder ähnliches PartikelgrößenanalysegerätMalvern InstrumentsN/A
VortexFisher Scientifc02-215-365
QuarzküvetteHellma104-002-10-40
Kleinvolumige Einwegküvette (zur Reduzierung des VLP-Einsatzes)Malvern InstrumentsZEN0040
Name<strong>CompanyKatalognummer<strong>Kommentare
Transmissionselektronenmikroskopie Probenvorbereitung
Nickel-Elektronenmikroskopie-Gitter mit Kohlenstoff-StützfolieLadd Research10880-100
Selbstschließende Umkehrelektronenmikroskopie-PinzetteTed Pella5372-NM
Qualitatives FilterpapierSigma-Aldrich (Whatman)WHA1002055
Glas PetrischalenSigma-AldrichBR455743
100 mM Stamm HEPES Lösung (pH 7,2)N/AN/A
2% UranylacetatN/AN/A
1861096

References

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