Grippe neutralisierende Antikörper korrelieren mit dem Schutz der Influenza-Infektionen. Microneutralization Assays messen neutralisierende Antikörper im menschlichen Serum und dienen oft der menschlichen Grippe-Serologie. Wir beschreiben einen Microneutralization-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen um zu messen, neutralisierende Antikörpertiter zu zeitgenössischen 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren nach Influenza-Impfung oder Infektion.
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Methodenartikel
Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neutralisierende Antikörper gegen Hämagglutinin (HA) von Influenza-Viren werden die wichtigsten Immunmechanismus angesehen, die mit Schutz für Influenza-Infektionen korreliert. Microneutralization (MN) Assays werden häufig verwendet, um neutralisierende Antikörperreaktionen im menschlichen Serum nach Influenza-Impfung oder Infektion zu messen. Verdeckte Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen sind die häufigsten verwendeten Zelle Substrat für MN-Assays. Allerdings verändert die derzeit zirkulierenden 3C.2a und 3C.3a a/H3N2 Influenza Viren erworbenen Rezeptorspezifität Bindung. Die MDCK-SIAT1-Zell-Linie mit erhöhten α-2,6 sialic Galaktose Moieties auf der Oberfläche erweist sich verbesserte Infektiosität und treuere Repliken als herkömmliche MDCK-Zellen für diese zeitgenössischen a/H3N2-Viren zur Verfügung. Hier beschreiben wir eine MN-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen, die zu neutralisierende Antikörpertiter zu dieser zeitgenössischen a/H3N2-Viren quantifizieren optimiert wurde. In diesem Protokoll sind Hitze inaktiviert Sera, neutralisierende Antikörper enthält zunächst seriell verdünnt dann inkubiert mit 100 TCID50/gut von Influenza a/H3N2-Viren Antikörper im Sera binden an die Viren ermöglichen. MDCK-SIAT1 Zellen sind dann die Virus-Antikörper-Mischung hinzugefügt und inkubiert für 18-20 h bei 37 ° C, 5 % CO2 , a/H3N2-Viren MDCK-SIAT1 Zellen infizieren können. Nach der Inkubation über Nacht, sind Platten fixiert und der Virusmenge in jedem gut durch ein Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) mit Anti-Grippe quantifiziert ist ein monoklonaler Antikörper Nucleoprotein (NP). Neutralisierende Antikörpertiter ist definiert als der Kehrwert der höchsten Serum Verdünnung, die ≥50 % Hemmung der Virus Infektiosität bereitstellt.
Einleitung
Influenza-Viren weiterhin Morbidität und Mortalität in der Bevölkerung jedes Jahr verursachen. HA ist die große Oberfläche Glykoprotein von Influenza-Viren. Neutralisierende Antikörper gezielt HA sind die wichtigsten Immunmechanismus, die mit dem Schutz der Influenza-Infektion1,2korreliert. Hämagglutination Inhibition (HI) Assays und MN-Assays sind zwei Methoden, die häufig verwendet, um Antikörperreaktionen im menschlichen Serum nach Grippe-Infektion oder Impfung3messen. Die HI-Assay misst Antikörper Hemmung der Virus Hämagglutination der roten Blutkörperchen und gilt als einen Surroga....
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Protokoll
Alle Influenzaviren behandelt werden, nach geeigneten Biosafety Level-Anforderungen (BSL-2 oder höher) wie in der Biosicherheit auf Mikrobiologie und biomedizinischen Labors (BMBL)12definiert.
1. Vorbereitung der Reagenzien und Ausgangsmaterial
-
MDCK-SIAT1 Zellen und sterile Zellkulturmedium vorbereiten
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium MDCK-SIAT1 mit 500 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit hoher Glucose, 10 % V/V Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 1 mg/mL G418 Sulfat (z.B. Geneticin)....
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Ergebnisse
Bestimmung der die Infektiosität der Virus Bestände ist der erste Schritt bei der MN-Assay. Abbildung 2 veranschaulicht die Platte Layout um die TCID50 der Virus Bestände zu bestimmen. Für Virus Bestände mit unbekannten Infektiosität kann das Virus aus mehreren Pre-Verdünnungen, z.B. 10-2 und 10-3, titriert werden, um die beste Titration Kurve zur Berechnung der Infektiosität des Virus zu erfassen. Die Virus-Menge in der MN-As.......
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Diskussion
Die MN-Assay ist eines der wichtigsten Assays für Influenza Serologie zur Antikörperantworten nach Influenza-Infektion oder Impfung eingesetzt. Titer von MN-Assays generiert werden oft als die primären Endpunkt vieler Grippe Seroepidemiology Studien verwendet. MN-Assays sind auch für Sero-Diagnostik und der Bewertung der Impfstoff Immunogenität verbreitet. Internationalen Inter Lab Studien wurden durchgeführt, um MN Assays trat in mehreren Laboratorien14zu vergleichen.
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Offenlegungen
Die Autoren berichten keinen Interessenskonflikt. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in dieser Publikation sind diejenigen der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention und die Leistungsträger.
Danksagungen
Wir danken Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu und Frau Ashley Burroughs aus der Influenza-Division des CDC für ihre kritische Überprüfung und Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Handschrift. Wir danken Dr. Adrian Reber von Influenza Division des CDC für seine Hilfe bei der Vorbereitung der Grafik in Abbildung 3. Zu guter Letzt bedanken wir uns bei Dr. M. Matrosovich, Marburg, Deutschland für die Bereitstellung der MDCK-SIAT1-Zellen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt | Life Science | 11965 | Ein kritischer Bestandteil von sterilen Zellkulturen, Virusvermehrungs- und Virusverdünnungsmedien |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Hyklon | SH30070,03 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, Protasefreies | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamin | Life Science | 25030-081 | |
| Natriumpyruvat | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 Disulfatsalz | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Aceton | VWR | 67-64-1 | Wird in einer Konzentration von 80 % |
| verwendet Phosphat-Citrat-Puffer mit Natriumperborat | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylendiamin Dihydrochlorid Tablette | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 Tablette pro 100 ml Wasser in Zellkulturqualität |
| Schwefelsäure | Fisher Scientific | A510-P500 | Verwendet 0,5 M Endkonzentration |
| Ethanol, denaturiert, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Verwendet in einer Konzentration von 70 % |
| Trypsin-EDTA | Life Science | ||
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP Maus monoklonal Ab | Millipore Pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-Maus IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-Well-Platten mit flachem Boden | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plattenleser | Molekulares Gerät | Spectromax 384 plus | |
| Zellkulturflasche 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
Referenzen
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
