Methodenartikel
Zellmigration ist entscheidend für Entwicklung, Gewebe-Wartung und Reparatur und Tumorgenese und wird durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine reguliert. Dieses Protokoll beschreibt Dot-Test, eine zweidimensionale, ungezwungene Migration Assay den wandernden Phänotyp der beigefügten, geschlossene Zelle Blätter als Reaktion auf microenvironmental Hinweise zu beurteilen.
Auch wenn komplexe Organismen statisch erscheinen, sind ihre Gewebe unter einem kontinuierlichen Umsatz. Als Alter Zellen, bewegen sterben und werden durch neue Zellen ersetzt Zellen in den Geweben in gewissem Sinne dicht orchestrierte. Während der Entwicklung von Tumoren ist dieses Gleichgewicht gestört, und Tumorzellen lassen das Epithel des Ursprungs, der lokalen Mikroumgebung, ferne Orte bereisen und bilden schließlich metastasierten Tumoren an entfernten Standorten zu erobern. Die Dot-Assay ist ein einfache, zweidimensionale ungezwungene Migration Assay, Nettobewegung Zelle Blätter in einem zellfreien Bereich bewerten und Parameter der Zellwanderung mit Zeitraffer-Bildgebung zu analysieren. Hier der Dot-Test zeigt sich mit einem menschlichen invasive, Lunge koloniebildenden Brust-Krebs-Zell-Linie, MCF10CA1a, wandernden Reaktion der Zellen auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), analysieren die bekannt ist, bösartige Potenzial von Brustkrebs-Zellen zu erhöhen und die wandernden Phänotyp der Zellen ändern.
Migration-Assays sind weit verbreitet, die invasive und metastatische Potential der Tumor Zellen in Vitrozu bewerten. Am häufigsten wird die Wunde oder Kratzer Assay verwendet, um Migration von epithelialen Blätter in eine Zelle gelöscht Bereich1,2,3bewerten. Um der Scratch-Test durchzuführen, sind Zellen in einem monomolekularen Film beschichtet und einen "Kratzer" oder zellfreie Bereich wird mit einer Pipettenspitze erstellt. Der Scratch-Test ist einfach mit handelsüblichen Gewebekultur Lieferungen einzurichten und im Multi-well-Platten, so dass für die Verarbeitun....
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(1) Beschichtung der Gerichte (Tag 1)
Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, Fingerabdrücke oder Schmutz auf der Unterseite der Platte zu verlassen, beim Umgang.
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Die Dot-Assay präsentiert hier (Abbildung 1) erfolgte mittels invasiver, Lunge koloniebildenden Brustkrebs-Zellen (MCF10CA1a) als Modellsystem. Der Dot-Test ergibt hoch reproduzierbare Zelle Punkte selbst in der Hand von Anfängern, so dass es eine bequeme und leicht auszuführende Assay (Abbildung 1D). Die Dot-Assay kombiniert mit er Färbung oder Zeitraffer Bildgebung und nachfolgenden Partikel Image Velocimetry (.......
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Migrieren Sie bei Fortschreiten der Tumorzellen vom Gewebe des Ursprungs das umliegende Gewebe einzudringen und Metastasen in entfernten Standorten15. Wanderung von Zellen von einer Zelle Kolonie kann in der Dot-Probe beobachtet werden. Hier ist der Dot-Test dargestellt, durch die Analyse des wandernden Phänotyps von menschlichen Brustkrebszellen in Reaktion auf EGF.
Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten mehrere Schritte bei der Einrichtung des Punktes si.......
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Der Autor hat nichts preisgeben.
Der Autor bedankt sich bei Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo und Carole Parent fürs Lesen und kommentieren auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MCF10CA1a-Zellen | Karmanos Research | Institute N/A-Zellen | für den Assay |
| von Mauskollagen IV | BD Biosciences | 354233 | zur Beschichtung von Platten |
| Trypsin / EDTA | Thermo | Fisher 25300054 | zur Entnahme von Zellen aus Gewebekulturplatten |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | zum Waschen von Zellen |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | als Nährmedium |
| für | Pferdeserum Thermo | Fisher 26050088 | zur Ergänzung von Nährmedium |
| 12-Well-Glasbodenplatte | MatTek | P12G-1.5-14-F | zur Züchtung von Zellen für die Bildgebung |
| EGF (epidermaler Wachstumsfaktor, humane Rekombinant) | Peprotech | AF-100-15 | zur Stimulierung von Zellen |
| fettsäurefrei BSA | Sigma A8806-1G | zur Herstellung von Puffer für | |
| Sigma | HHS32 | zur Färbung von Kolonien | |
| Eosin | Elektronenmikroskopie | Sciences 26051-10 | zur Färbung von Kolonien |
| 37 ° C, 5% CO2 Inkubator | Sanyo | Modell MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver mit Inkubatorkammer und motorisiertem Tisch | Zeiss | Modell Axio Observer.Z1 | für Zeitrafferaufnahmen |
| ORCA Flash LT sCMOS Kamera | BioVision | C11440-42U-KIT | für Zeitrafferaufnahmen in Kombination mit Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | Software für die Zeitraffer-Bildgebung |
| Inverses Mikroskop | Olympus | Modell IX70 | zur Zellzählung und zur Überprüfung von Kolonien in der Kunststoffbox der Gewebekultur |
| Lock& Schloss | N/A | als Feuchtkammer (jede dicht schließende Kunststoffbox, die auf die Platten passt, kann verwendet werden) |
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