Methodenartikel

Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

DOI:

10.3791/56451

⸱

5. Dezember 2017

1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Zellmigration ist entscheidend für Entwicklung, Gewebe-Wartung und Reparatur und Tumorgenese und wird durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine reguliert. Dieses Protokoll beschreibt Dot-Test, eine zweidimensionale, ungezwungene Migration Assay den wandernden Phänotyp der beigefügten, geschlossene Zelle Blätter als Reaktion auf microenvironmental Hinweise zu beurteilen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auch wenn komplexe Organismen statisch erscheinen, sind ihre Gewebe unter einem kontinuierlichen Umsatz. Als Alter Zellen, bewegen sterben und werden durch neue Zellen ersetzt Zellen in den Geweben in gewissem Sinne dicht orchestrierte. Während der Entwicklung von Tumoren ist dieses Gleichgewicht gestört, und Tumorzellen lassen das Epithel des Ursprungs, der lokalen Mikroumgebung, ferne Orte bereisen und bilden schließlich metastasierten Tumoren an entfernten Standorten zu erobern. Die Dot-Assay ist ein einfache, zweidimensionale ungezwungene Migration Assay, Nettobewegung Zelle Blätter in einem zellfreien Bereich bewerten und Parameter der Zellwanderung mit Zeitraffer-Bildgebung zu analysieren. Hier der Dot-Test zeigt sich mit einem menschlichen invasive, Lunge koloniebildenden Brust-Krebs-Zell-Linie, MCF10CA1a, wandernden Reaktion der Zellen auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), analysieren die bekannt ist, bösartige Potenzial von Brustkrebs-Zellen zu erhöhen und die wandernden Phänotyp der Zellen ändern.

Einleitung

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Migration-Assays sind weit verbreitet, die invasive und metastatische Potential der Tumor Zellen in Vitrozu bewerten. Am häufigsten wird die Wunde oder Kratzer Assay verwendet, um Migration von epithelialen Blätter in eine Zelle gelöscht Bereich1,2,3bewerten. Um der Scratch-Test durchzuführen, sind Zellen in einem monomolekularen Film beschichtet und einen "Kratzer" oder zellfreie Bereich wird mit einer Pipettenspitze erstellt. Der Scratch-Test ist einfach mit handelsüblichen Gewebekultur Lieferungen einzurichten und im Multi-well-Platten, so dass für die Verarbeitung mehrerer Proben durchgeführt werden kann. Jedoch da der Kratzer hergestellt wird, Zellen sind physisch aus der Monolage entfernt und oft durchlaufen Zelltod. Extrazellulärer Matrix an der Platte befestigt ist darüber hinaus oft kratzen dabei beschädigt. Ebenso die Verwendung von Silizium wird eingefügt (z. B. Ibidi Kammern4) oder Schablonen5,6,7 zu mechanischen Störungen der Zellen und der teilweisen Entfernung der Matrixproteine Beschichtung führen die Platten. Ein weiterer Nachteil von Assays Überwachung Verschluss von Wunden oder Kratzer ist ihre begrenzte Zeit natürlich da Zellwanderung nur analysiert werden kann, bis der Kratzer geschlossen wird.

Bei der Durchführung des Dot-Tests, sind Zellen als eine kreisförmige Kolonie auf einer beschichteten oder unbeschichteten Platte8vergoldet. Die Gründe für diese Beschichtung-Strategie soll Zelle Blätter mit definierten Kanten zu erhalten, die dringen in die Zelle-freie Umgebung ohne zu stören die Kultur durch Abbau von Zellen oder Beilagen oder migrieren können. Das übergeordnete Ziel des Dot-Assays ist Migration der Zelle Blätter gemessen am Rande Verschiebung oder Kolonie Durchmesser, sowie hinsichtlich durchführen, Time-Lapse imaging zu analysieren, die wandernden Phänotyp der Zellen in räumlich-zeitliche Auflösung beobachten.

Zellwanderung kann durch eine Vielzahl von microenvironmental Signale wie Chemokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren wie EGF beeinträchtigt werden. EGF ist ein Wachstumsfaktor, der übt seine biologische Wirkung über Bindung an seinen Rezeptor EGF-Rezeptor-9, und invasive und metastasierten Verhalten von Tumor Zellen4,9,10erhöht. Hier ist der Dot-Test zur Untersuchung EGF stimuliert Zellwanderung in eine menschliche invasive, Lunge koloniebildenden Brust Krebs Zelle Linie (MCF10CA1a)8,11,12.

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Protokoll

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(1) Beschichtung der Gerichte (Tag 1)

Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, Fingerabdrücke oder Schmutz auf der Unterseite der Platte zu verlassen, beim Umgang.

  1. Tauen Sie Maus Kollagen IV auf Eis auf, und verdünnen Sie es mit 50 mM HCl (pH 1.3) um 3 mL einer 10 µg/mL Kollagen IV Lösung vorzubereiten.
    Hinweis: Kollagen wird Niederschlag bei 37 ° C. Es ist daher wichtig, die Kollagen-Lösung bei niedriger Temperatur zu halten, beim Auftauen und mit ihm arbeiten. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Wechseln durch die Vorbereitung entsprechend dimensionierte Aliquote und speichert sie bei-80 ° C.
  2. Jede Vertiefung des 12-Well Glas Bodenplatten 250 µL Kollagen IV Lösung hinzu, und legen Sie sie in eine entsprechend dimensionierte, dicht schließender Kunststoff-Box. Feuchten Papiertuch über und um die Platten für die Herstellung einer feuchten Kammer und schließen Sie das Feld zu platzieren. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Da nur das Wachstumsfeld werden beschichtet muss, es ist ausreichend, nur das Deckglas abdecken, die an der Unterseite der Platte, die mit Kollagen-Lösung verbunden ist (siehe Abbildung 1A, B für eine schematische Darstellung der Platte).
  3. Am nächsten Morgen spülen Sie Platten mit entionisiertem H2O zweimal, nicht absorbiert Kollagen und Puffer zu entfernen. Richten Sie das Wasser an den Rand der Platte gut, nicht an den Rand von Platte unten und das Deckglas (wenn Wasser in diesem Bereich können sie Spritzen wird pipettiert) gebildet. Trocknen Sie die Platten in der Laminar-Flow-Haube an der Luft. Platten sofort verwenden oder für bis zu 5 Tage bei 4 ° C lagern.
    Hinweis: Verschiedene Zelllinien benötigen unterschiedliche Beschichtung, z. B. Fibronektin oder Kollagen ich.

(2) Beschichtung der Dot-Assay (Tag 2)

  1. Vorbereitung der Zellsuspension
    1. Zur Vorbereitung der Zellsuspension verwenden Sie Zellen, die angebaut wurden in einer 60 mm Gewebe Kulturschale in DMEM/F12 Medium mit 5 % Pferd Serum zu 80 % Zusammenfluss ergänzt
    2. Spülen Sie die Zellen mit Kalzium und Magnesium-freie Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) einmal fügen Sie 500 µL Trypsin-EDTA (Raumtemperatur hinzu) und inkubieren Sie die Zellen für 3-5 min. im Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre.
    3. Aussetzen der freistehenden Zellen in 4,5 mL Kulturmedium zu stoppen Trypsin Aktivität und zählen eine 20 µL aliquoten die Zellsuspension in eine Hemocytometer.
    4. Pellet-die restlichen Zellen in einem 15 mL konische Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 X g 3 min, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in Kulturmedium bis 3 x 106 Zellen/mL.
      Hinweis: Für andere Beschichtung Substraten und/oder Zelllinien, muss die optimale Zelldichte in einer Verdünnungsreihe hergestellt werden. 3 x 106 Zellen/mL empfiehlt sich als Ausgangspunkt.
  2. Galvanischen Zellen
    1. Statt einen Tropfen 10 µL Zellsuspension in der Mitte der einzelnen Deckglas des Kollagen IV beschichtet 12-Well Glas Bodenplatte ohne berühren oder kratzen die Beschichtung (Abbildung 1A, B). Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° C, feuchte Atmosphäre, damit die Zellen befestigen. Check-in einem inversen Mikroskop, dass die Zellen verbunden sind.
      Hinweis: Dies kann am besten gesehen werden am Rand des Tropfens, wo kann Bildung von einem monomolekularen Film (Abbildung 1C) beobachtet werden. Bei Bedarf, brüten die Platte bis zu 3 h. sicher sein, dass die Luftfeuchtigkeit im Inkubator hoch genug ist, wie die Tropfen schnell austrocknen können. Wird eine Reduzierung des Volumens Tropfen während dieses Schritts eingehalten, fügen Sie PBS hinzu, die Zwischenräume zwischen den Brunnen um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen.
    2. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen mit 1 mL Kulturmedium zweimal um die fraktionslosen Zellen zu entfernen. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in jede Vertiefung. Check-in einem inversen Mikroskop, dass keine schwimmenden Zellen bleiben, sonst die Brunnen wieder waschen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre, gut definierte Zelle Blätter zu erhalten.
      Hinweis: Schwimmende Zellen sind wahrscheinlich auf die Platte wieder anzubringen und zu unerwünschten Zelle Kolonien bilden.

3. Förderung der Zellen (Tag 3)

  1. Überprüfen Sie alle Brunnen mit einem inversen Mikroskop um diese Zelle sicherzustellen, die Kolonien richtig gewachsen sind. Ggf. Markieren Sie ungeeignete Brunnen und verwenden Sie sie nicht.
  2. Beschriften Sie jede Vertiefung der Platte entsprechend für jede Bedingung untersucht. Führen Sie jede Bedingung in doppelt oder dreifach.
  3. Ändern Sie das Medium, um die Zellen in DMEM/F12 mit 0,1 % Pferd Serum (hungernden Medium) verhungern 3 h bevor Zellen stimuliert werden.
  4. Stimulieren die Zellen durch Zugabe von EGF (Endkonzentration 5 ng/mL) oder andere gewünschte Mediatoren und vorsichtig mischen das Medium mit einer 1 mL Micropipettor oder durch Schütteln der Plattenrandes.
  5. Inkubieren Sie die Platte für 1-4 Tage, Rand Verschiebung und Rand Kontur zu beobachten, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben oder Zeitraffer Bildgebung durchführen, wie in Abschnitt 4.2 beschrieben.

(4) Visualisierung der Zelle Kolonien und Zellwanderung

  1. Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung zur Messung der Koloniewachstum (Tag 4-7)
    1. Zellen in 70 % igem Ethanol (1 mL/Na) für ~ 2 min zu beheben.
    2. Kerne mit Hämatoxylin (1 mL/gut), ~ 2 min. Fleck.
    3. Waschen Zellen mit Leitungswasser (1 mL/Na) bis Kerne sind blau, 5-10 Minuten.
    4. Fleck Zytoplasma mit Eosin (1 mL/gut), ~ 2 min.
    5. Spülen Sie mit entionisiertem Wasser (1 mL/Na).
      Hinweis: Hämatoxylin und Eosin Lösungen gesammelt und verwendet werden können mehrere Male, bis die Färbung ohnmächtig wird.
    6. Trocknen Sie Platte an der Luft.
    7. Drehen Sie die Platte und gemessen Sie der Punkt-Durchmesser mit einem Lineal. Alternativ die Platte mit einer Kamera fotografieren und analysieren des Punkt-Durchmessers in ImageJ.
  2. Zeitraffer-Mikroskopie (Tag3)
    1. Schalten Sie das Inkubator-Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Füllen Sie den Luftbefeuchter mit dH2O. Adjust CO2 auf 5 %. Stellen Sie sicher, dass die Inkubator Kammer befeuchtet ist und dass die motorisierte Bühne frei bewegen kann. Die Inkubator-Kammer in der Nähe und lassen Sie das Mikroskop auf 37 ° c einstellen
      Hinweis: Das Mikroskop verwendet (siehe Tabelle Material) hier sollte auf 37 ° C für mindestens 3 h erhitzt werden, bevor die Zellen abgebildet werden, um zu vermeiden, driften die Schärfentiefe.
    2. Die Platte auf der Bühne des Mikroskops Inkubator und richten Sie die Bühne-Liste. Bild zwei gegenüberliegenden Kanten und das Zentrum von jeder Zelle Punkt (Abb. 1A).
    3. Nehmen Sie Bilder alle 3 min für 15-24 h mit 10 X-Objektiv. Laden Sie die Daten und fahren Sie mit Bildanalyse in einem Programm Ihrer Wahl, z.B.ImageJ oder Matlab.

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Ergebnisse

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Die Dot-Assay präsentiert hier (Abbildung 1) erfolgte mittels invasiver, Lunge koloniebildenden Brustkrebs-Zellen (MCF10CA1a) als Modellsystem. Der Dot-Test ergibt hoch reproduzierbare Zelle Punkte selbst in der Hand von Anfängern, so dass es eine bequeme und leicht auszuführende Assay (Abbildung 1D). Die Dot-Assay kombiniert mit er Färbung oder Zeitraffer Bildgebung und nachfolgenden Partikel Image Velocimetry (...

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Diskussion

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Migrieren Sie bei Fortschreiten der Tumorzellen vom Gewebe des Ursprungs das umliegende Gewebe einzudringen und Metastasen in entfernten Standorten15. Wanderung von Zellen von einer Zelle Kolonie kann in der Dot-Probe beobachtet werden. Hier ist der Dot-Test dargestellt, durch die Analyse des wandernden Phänotyps von menschlichen Brustkrebszellen in Reaktion auf EGF.

Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten mehrere Schritte bei der Einrichtung des Punktes si...

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Offenlegungen

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Der Autor hat nichts preisgeben.

Danksagungen

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Der Autor bedankt sich bei Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo und Carole Parent fürs Lesen und kommentieren auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MCF10CA1a-ZellenKarmanos ResearchInstitute N/A-Zellenfür den Assay
von Mauskollagen IVBD Biosciences354233zur Beschichtung von Platten
Trypsin / EDTAThermoFisher 25300054zur Entnahme von Zellen aus Gewebekulturplatten
DPBS Mediatech21-031-CVzum Waschen von Zellen
DMEM / F12Thermo Fisher11320082als Nährmedium
fürPferdeserum ThermoFisher 26050088zur Ergänzung von Nährmedium
12-Well-GlasbodenplatteMatTekP12G-1.5-14-Fzur Züchtung von Zellen für die Bildgebung
EGF (epidermaler Wachstumsfaktor, humane Rekombinant)PeprotechAF-100-15zur Stimulierung von Zellen
fettsäurefrei BSASigma A8806-1Gzur Herstellung von Puffer für
SigmaHHS32zur Färbung von Kolonien
EosinElektronenmikroskopieSciences 26051-10zur Färbung von Kolonien
37 ° C, 5% CO2 InkubatorSanyoModell MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver mit Inkubatorkammer und motorisiertem TischZeissModell Axio Observer.Z1für Zeitrafferaufnahmen
ORCA Flash LT sCMOS KameraBioVisionC11440-42U-KITfür Zeitrafferaufnahmen in Kombination mit Zeiss AxioObserver
MetamorphBioVisionMMACQMICSoftware für die Zeitraffer-Bildgebung
Inverses MikroskopOlympusModell IX70zur Zellzählung und zur Überprüfung von Kolonien in der Kunststoffbox der Gewebekultur
Lock& SchlossN/Aals Feuchtkammer (jede dicht schließende Kunststoffbox, die auf die Platten passt, kann verwendet werden)
EGF-Hämatoxylin

Referenzen

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ZellmigrationEGF StimulationTime Lapse ImagingH E F rbungCollagen IV BeschichtungMCF10CA1a ZellenZellgeschwindigkeitsanalyseRandverschiebung

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