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Methodenartikel

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

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⸱

DOI:

10.3791/56453

⸱

6. Februar 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Zusammenfassung

Meiotische Progression bei Männern ist ein Prozess, der die konzertierte Aktion eine Reihe von stark regulierten zelluläre Ereignisse erfordert. Während der Meiose auftretende Fehler können zu Unfruchtbarkeit, Schwangerschaftverlust oder Gendefekte führen. Beginnend mit dem Beginn der Pubertät und während der gesamten Erwachsenenalter, kontinuierliche halbsynchrone Wellen von Spermatozyten Spermatogenese zu unterziehen und letztlich bilden haploide Spermien. Die erste Welle der Maus Spermatozyten unterziehen meiotische Einleitung erscheinen am 10. Tag Post-Partum (10 Dpp) und in das Lumen der seminiferous Röhrchen als reifes Sperma auf 35 Dpp freigesetzt werden. Daher ist es vorteilhaft, Mäuse innerhalb dieser Entwicklungsstörungen Zeitfenster zu nutzen, um hoch angereicherten Populationen von Interesse zu erhalten. Analyse der seltenen Zelle Stadien ist schwieriger bei älteren Mäusen aufgrund des Beitrags von aufeinanderfolgenden spermatogenic Wellen, die die Vielfalt der zellularen Bevölkerungen innerhalb der Tubuli zu erhöhen. Die hier beschriebene Methode ist eine leicht implementierte Technik für die zytologische Auswertung der Zellen innerhalb der seminiferous Röhrchen von Mäusen, einschließlich Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatids gefunden. Die Röhrchen Squash Technik bewahrt die Integrität der isolierten männlichen Keimzellen und ermöglicht die Untersuchung der zellulären Strukturen, die mit anderen Techniken nicht einfach visualisiert werden. Um die Anwendungsmöglichkeiten dieser Röhrchen-Squash-Technik zu demonstrieren, wurde Spindel Montage in Spermatozyten voran durch die Prophase, Metaphase, die ich Übergang (G2/MI Übergang) überwacht. Darüber hinaus wurden Centrosome Vervielfältigung, meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) und Chromosom Blumenstrauß Bildung als Beispiele der zytologischen Strukturen beurteilt, die mit dieser Röhrchen-Squash-Methode beobachtet werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um bestimmte Mängel während der Spermatogenese aufzeigen, die durch Mutation oder exogene Störung verursacht werden und trägt somit zum molekularen Verständnis der Spermatogenese.

Einleitung

Meiose ist ein komplexes zellulären Ereignis, in dem eine einzelne Runde der DNA-Replikation von zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung gefolgt. Meiose-spezifische Veranstaltungen müssen während der Anfangsphase der Meiose zu gewährleisten genaue Chromosom Abtrennung koordiniert werden. Diese Ereignisse gehören der Abschluss der homologen Rekombination, Co Ausrichtung der Schwester Kinetochore während die erste meiotische Teilung und der schrittweise Verlust der Cohesin-komplexe, Chiasmata zwischen homologen zu lösen. Präzise Regulation dieser Prozesse ist notwendig, um die Fruchtbarkeit zu erhalten und Chromosom Missegregation Ereignisse zu verhindern, die zu genetischen Entwicklungsstörungen und spontanen Fehlschlag1führen können.

Während die wichtigsten Ereignisse der Meiose in Männchen und Weibchen stattfinden, bestehen erhebliche zeitliche und mechanistische Unterschiede zwischen Spermatogenese und Oogenese2. Zum Beispiel, während der weibliche Meiose, Prophase I tritt während der Embryonalentwicklung und Verhaftungen in der Dictyate-Phase bis zur Pubertät. Im Gegensatz dazu beginnt Spermatogenese um Pubertät und schreitet in Wellen im gesamten Erwachsenenlebens ohne Haftbefehl. Die Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Meiose betont die Notwendigkeit, Methoden zu entwickeln, die speziell zur Beurteilung dieser Prozesse in Spermatozyten und Eizellen gesorgt werden. Derzeit beruht weitgehend meiotic Progression Beurteilung auf der Verwendung von Chromatin breitet sich3,4,5. Während Chromatin breitet sich nützlich für das Studium meiotische Chromosomen sind, Scheitern sie Erhaltung zellulären Integrität, Bewertung von Zellstrukturen wie Spindel Mikrotubuli, Zentrosomen, die Kernhülle und Telomere Anlagen zu verhindern. Live imaging und langfristigen Kultivierung Techniken haben unser Verständnis der weibliche Meiose stark fortgeschritten; ähnliche Konzepte für die gesamte intakten Zelle zu visualisieren sind jedoch weniger häufig für die Untersuchung der Spermatogenese6,7implementiert. Um dynamische Ereignisse in der gesamten männlichen Meiose zu visualisieren, haben wir etablierte Röhrchen Squash Techniken um schnell beurteilen die zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten8,9angepasst. Die hier beschriebene Methode bewahrt die Integrität der Zelle ermöglicht die Untersuchung von mehreren Zellstrukturen während der verschiedenen Phasen der Spermatogenese.

Diese Röhrchen-Squash-Technik ist eine ganze Zelle Ansatz, der für die Beurteilung der Zellstrukturen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Gemeinsamen histologischen Ansätze zur meiotic Progression bei männlichen Mäusen wie Hämatoxylin und Eosin Färbung von Paraffin eingebettet Hoden und immunofluorescent Kennzeichnung von Cryosections visualisieren ermöglichen einen umfassenden Überblick über die meiotische fortschreiten. Aber nicht diese Techniken, Einzelzellen, soweit dies zur detaillierten Analyse der Ereignisse in der gesamten Meiose10,11zu lösen. Alternative Techniken meiotische Prozesse visualisieren beruhen auf bedeutende chemiosmotischen Unterbrechung der Spermatocyte zu isolieren und beheben von nuklearem Material3,4,5. Diese chemischen Behandlungen behindern die Beobachtung der Zelltypen als primären Spermatozyten. Eine kürzlich beschriebene Methode durch Namekawa ermöglichte die Forschungsgemeinschaft, die nukleare Architektur des isolierten Spermatozyten zu bewahren, aber erfordert den Einsatz von einem Cytospin und Accessoires, die möglicherweise nicht ohne weiteres zur Verfügung stehen einige Labors4. Im Gegensatz dazu erfordert die Röhrchen Squash Technik nur Geräte, die in der Regel standard in den meisten Zelle Biologie Labors.

Die hier beschriebene Röhrchen Squash-Methode lässt sich die unterschiedlichen Zelltypen gefunden innerhalb der seminiferous Röhrchen, einschließlich Sertoli-Zellen, Spermatogonien, primäre und sekundäre Spermatozyten und Spermatids visualisieren. Durch die Kopplung dieser Technik mit der in der Nähe von synchronen erste Welle der Spermatogenese bei jungen Mäusen, ist es möglich, angereicherte Populationen von spermatogenic Zellen zu erhalten, wie sie durch Meiose12 Fortschritte. Dieses Verfahren ermöglicht die detaillierte Analyse der Prozesse innerhalb der gesamten Spermatogenese, wie frühe Prophase Ereignisse, die G2/MI und Metaphase Anaphase Übergänge und Spermiogenesis. Darüber hinaus können Röhrchen Squash Vorbereitungen zur zytologischen Merkmale der Chromosomen (z. B. interchromatid Domains (ICD) und Kinetochore) und Zentrosomen (Centriolen und Pericentriolar Material/Matrizen) zu visualisieren. Die Squash-Methode kann ohne weiteres parallel andere experimentelle Ansätze, wie z.B. Chromatin Spreads und Proteingewinnung durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich geändert spermatogenic Frischzellen auf Folien für direkte Visualisierung13zu hinterlegen.

Die hier beschriebene Methode beinhaltet eine ganze Zelle seminiferous Röhrchen Squash Technik um den G2/MI Übergang in Wildtyp C57BL/6J Mäuse zu analysieren. Die zytologischen Merkmale des primären Spermatozyten betreten die erste meiotische Teilung wurden mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, beobachten die meiotische Spindel visualisiert. Dieses vielseitige Technik kann leicht geändert werden, um andere meiotische Stufen und verschiedene Zelltypen zu visualisieren. Die Technik ist auch offen für alternative Visualisierung Strategien, wie DNA und RNA Fisch Ansätze.

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Protokoll

Die Verwendung von Mäusen nahm die institutionellen Animal Care und verwenden Ausschuss der Johns Hopkins University. Experimente wurden durchgeführt auf Juvenile (20-26 Tage Post-Partum, Dpp) Mäusen C57BL/6J, unter Ausnutzung der halbsynchrone erste Welle der Spermatogenese. Jedoch kann diese Technik auch mit Erwachsenen Mäusen durchgeführt werden.

1. Präparation und Isolierung von seminiferous Röhrchen Maus

  1. Bereiten Sie den Fix/Lyse Lösung und Antikörper Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben.
  2. Bereiten Sie eine 35-mm-Petrischale mit 3 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS, pH 7,4) und ein weiteres 35-mm-Gericht mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung per Mausklick.
  3. Opfern Sie die Maus durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung zu und sprühen Sie ventrale Abdomen mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Dann entfernen Sie die Hoden durch Ziehen an der epididymal Fettpolster mit Pinzette und nicht zu stören der Tunica Albuginea. Legen Sie die Hoden in einer 35-mm-Petrischale mit 1 X PBS.
    Hinweis: Nutzen Sie die erste Welle der Spermatogenese, um ein angereichertes Zellpopulation Interesse14zu beobachten. Bestimmte Stufen der Spermatogenese sind bei verschiedenen Maus ab (Tabelle 3) angereichert.
  4. Entfernen Sie der Hoden Tunica Albuginea durch Punktion des Gewebes mit scharfen spitzen Pinzette und sammeln Sie lose seminiferous Röhrchen. Übertragen Sie die Tubuli auf eine neue 35 mm Petrischale mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung.
  5. Inkubieren Sie die Tubuli in die Verlegenheit/Lyse-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.

2. Vorbereitung von seminiferous Röhrchen

  1. Bereiten Sie einen Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger umreißen die Ränder der Folie mit einem flüssigen Blocker Stift.
  2. Gelten Sie 100 µL Fix/Lyse-Lösung für die Mitte der Folie Glas.
  3. Mit sterilen Pinzette und Schere sanft zu necken auseinander seminiferous Röhrchen. Schneiden Sie lange einzelne Röhrchen Segmente ca. 20 mm Länge.
    Hinweis: Strukturen, die empfindlich auf Fixativ über längere Zeit, z. B. die Zentrosomen zu visualisieren, die Tubuli zuerst in 1 X PBS zu trennen, dann direkt Hackfleisch Tubuli auf der Oberfläche des Poly-Lysin-Folien in 100 µL Fix-Lyse Lösung beschichtet.
  4. Übertragen Sie fünf 20 mm lange seminiferous Röhrchen Segmente auf die vorbereiteten Poly-L-Lysin beschichtetes Glas-Folie mit Fix/Lyse Lösung.
  5. Mit steriler Schere Hackfleisch seminiferous Röhrchen in 1,5 bis 3,0 mm Segmente.
  6. Verwendung von sterilen Pinzette die Röhrchen Segmente auf dem Objektträger so anordnen, dass kein Gewebe übergreift, und die Tubuli sind gleichmäßig verteilt.
    Hinweis: Die optimale Anzahl von Röhrchen Segmente auf einen Glasobjektträger liegt zwischen 20 und 40.

3. Quetschen von seminiferous Röhrchen

  1. Die Glas-Folie mit verstreuten seminiferous Röhrchen Segmente auf einer Tischplatte zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Labor abwischen zu verlieren Gewebe während der Squash-Schritt.
  2. Wenden Sie ein Deckglas (22 x 60-1,5 mm) auf den Objektträger und Druck mit der Ferse des Palm für 10-20 Sekunden. Es ist wichtig, genügend Kraft, Spermatozyten von seminiferous Röhrchen zu zerstreuen.
    Hinweis: Beobachten Sie die Röhrchen mit einem Dissektion Mikroskop um die quetschen Schritt zu optimieren, so dass alle Röhrchen Segmente gestört werden.
  3. Mit Folie Pinzette, sofort Blitz Einfrieren der Objektträger in einem kleinen Dewar Flüssigkeit N2 für 15 Sekunden, oder bis die Flüssigkeit aufhört zu blubbern. Wenn Immunolabeling umgehend entfernen das Deckglas mit einer geraden Kante Rasierklinge, feine Spitze Zange oder 21-Gauge-Nadel.
    Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, Immunolabel Folien sofort (siehe Schritt 4). Jedoch können an dieser Stelle Folien bei-80 ° C bis zu zwei Wochen lang beibehalten werden. Um die Lebensdauer von Proteinen und Zellstrukturen zu maximieren, sofort lagern Sie die Folien auf Trockeneis oder Übertragung auf-80 ° C Gefrierschrank, und das Deckglas auf der Folie. Wenn Immunolabeling Folien gespeichert, entfernen Sie das Deckglas durch Eintauchen der Folien in flüssigen N2 für 15 Sekunden, wie unter Punkt 3.3 beschrieben.

4. Immunolabeling der berittenen seminiferous Röhrchen

  1. Tauchen Sie die Folie in 1 x PBS und drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS waschen.
    Hinweis: Lassen Sie niemals die Folien zu trocken während der Immunolabeling.
  2. Gelten Sie 1 mL der Antikörper Verdünnungspuffer auf den Objektträger für 1-2 h in eine feuchte Kammer sperren.
  3. Entfernen Sie die Antikörper Verdünnungspuffer und 100 µL Primärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper in eine feuchte Kammer verdünnt.
    Hinweis: Inkubieren Sie für beste Ergebnisse primären Antikörper über Nacht bei 4 ° c Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken. Überprüfen Sie und optimieren Sie Primärantikörper15.
  4. Spülen Sie Folien drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS.
    Hinweis: Verbessern Waschungen, agitieren Coplin Gläser mithilfe einer kleinen magnetischen Stir Bar und auf einem Teller magnetische Rühren bei niedriger Drehzahl, platzieren oder das Coplin Glas auf eine Tischplatte Mixer bei geringer Geschwindigkeit.
  5. Wenden Sie 100 µL der Sekundärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper für 1 bis 1,5 h in eine feuchte Kammer bei Raumtemperatur verdünnt an. Inkubieren Sie die Folien in einer dunklen Box Foto Ausbleichen der Fluorophor konjugierten Antikörpern zu vermeiden.
    Hinweis: Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken.
  6. Spülen Sie Dias zwei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS.
  7. Montieren Sie die Folien in Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) und wenden Sie Deckgläsern (22 x 60-1,5 mm).
  8. Versiegeln der Deckgläsern, die Folien mit klaren Nagellack zu bewahren die Folien und verhindern, dass die Deckgläsern bewegt.

5. Analyse und bildgebenden Röhrchen Squash Vorbereitungen

  1. Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit automatisierten Bühne, die präzise Bewegung der z-Achse und eine hochauflösende Kamera für Bildaufnahme ermöglicht. Alternativ können Sie einen Laser confocal Mikroskop.
    Hinweis: Verwenden Sie alle verfügbaren Hardware und Software für diesen Schritt. Beispielsweise wurden in Abbildung 1 und Abbildung 2 angezeigten Bilder mit ein Zeiss Cell Observer Z1 mit einer ORCA-Flash 4.0 CMOS Kamera verknüpft und analysiert mit dem Zeiss ZEN 2012 blau Edition Image-Software erfasst.
  2. Beurteilen Sie die Folien mit einer 20 X Objektiv zur Bestimmung der Qualität der Squash-Vorbereitung. Gute Qualität Folien haben eine Monolage von Kernen, die gleichmäßig verteilt sind.
    Hinweis: Einige Bereiche der Folie können besser sein als andere, ist es sinnvoll, beachten die Koordinaten, wo die besten Regionen der Folie zur weiteren Analyse mit stärkerer Vergrößerung gefunden werden kann.
  3. Verwendung mit höherer Vergrößerung Ziel (z.B. 63 X oder 100 X), Gefangennahme Regionen der Folie eine konsequente Monoschicht der Kerne. Sobald ein Bereich ausgewählt ist, den oberen und unteren Sie Z-Stapel um sicherzustellen, dass alle im Fokus Licht eingefangen wird.
    Hinweis: Die optimale Anzahl der Z-Stapel gefangen zwischen der oberen und unteren Grenzwert bezeichnet man in der Regel durch die Bild-Datenerfassungs-Software und unterscheidet sich für jedes Ziel.
  4. Verwenden Sie die Bildverarbeitungs-Software, um eine erweiterte Tiefenbild Fokus zu kompilieren. Die Software verbindet das Licht im Fokus von jedem Z-Stapel und ist wichtig für die optimale Darstellung von Röhrchen Squash Vorbereitungen.

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Ergebnisse

Hier haben wir die Röhrchen-Squash-Methode verwendet, um vergängliche Zell-Populationen in der Prophase, Metaphase visualisieren ich (G2/MI) Übergang, die angereichert wurden, durch das Ernten von Hoden von juvenile Wildtyp Mäusen durchläuft die erste Welle der Spermatogenese (24 (DPP). Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von den verschiedenen Phasen der Zelle, die mit den Röhrchen Squash Methode visualisiert werden können. Populationen von Metaphase bere...

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Diskussion

Mäuse haben sich als nützliche Modellorganismus für die zelluläre Ereignisse, die meiotische Fortschreiten in der Spermatogenese regieren zu studieren. Weiter, es ist notwendig, kümmerten sich um die Untersuchung der Spermatogenese, weil viele Veranstaltungen, wie z. B. Ausstieg aus meiotischen Prophase ich Werkzeuge zu entwickeln, sind sexuell dimorphen. Dieses Protokoll beschreibt eine seminiferous Röhrchen Squash Methode zur Visualisierung und Studium der verschiedenen Phasen der Maus Spermatogenese. Diese Methode zel...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), S.R.W. und j.h.
 

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16% Paraformaldehyd WässrigeElektronenmikroskopie Wissenschaften (EMS)15710
10xPBS Qualität Biologisch119-069-161
Triton X-100SigmaT8787
BSASigmaA1470
PferdeserumSigmaH-1270
35mm x 10mm Petrischale, steril, unbehandeltCellTreatP886-229638
Poly-L-Lysin-beschichtete ObjektträgerSigmaP0425-72EA
Liquid BlockerPen Elektronenmikroskopie Sciences (EMS)71310
Humid BoxEvergreen240-9020-Z10
Wheaton Coplin Glasfärbeschale für 5 oder 10 ObjektträgerFisher08-813E
VECTASHIELD Antifade-Montage Medium mit DAPIVector LabsH-1200
Mikroskop Cover Slides (22mmx60mm)Fisher12-544-G
Klarer NagellackAmazonN/A
Microsopes
NameCompanyKatalognummer Comments
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000 
Observer Z1Zeiss4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 blue edition BildsoftwareZeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS-KameraHamamatsu
Primärantikörper<
strong>NameUnternehmenKatalognummer<strong>Comments
Maus anti-SYCP3Santa Cruzsc-745691 von 50
Kaninchen anti-SYCP3Fisher (Novus)NB300-2311 von 1000
Ziege anti-SCP3Santa Cruzsc-208451 von 50
Humane Anti-Centromere ProteinAntikörper Incorporated15-2351 von 100
Maus Anti-Alpha-TubulinSigmaT90261 zu 1000
Maus Anti-AIM1BD Biosciences6110821 zu 200
Maus Anti-& Gamma H2AXThermo FisherMA1-20221 zu 500
Maus anti-CENT3AbnovaH00001070-M011 zu 200
Kaninchen anti-pericentrinAbcamab44481 zu 200
Kaninchen anti-REC8Mit freundlicher Genehmigung von  Dr. Karen SchindlerN/A1 zu 1000

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