Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Summary

Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.

Abstract

In den letzten Jahrzehnten ist die Prävalenz von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD), gewachsen. Diese altersassoziierter Erkrankungen zeichnen sich durch das Auftreten von Protein-Aggregate mit fibrillary Struktur in den Gehirnen von Patienten. Genau warum normalerweise löslichen Proteine zu unterziehen, bleibt ein Aggregationsprozess schlecht verstanden. Die Entdeckung, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheitsprozesse und stattdessen Teil des normalen Alterungsprozesses die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Proteinaggregation, zu regulieren ermöglicht, ohne Verwendung von ectopically zum Ausdruck menschlicher Krankheit-assoziierte Proteine. Hier beschreiben wir Methoden um inhärente Proteinaggregation in Caenorhabditis Elegans durch komplementäre Ansätze zu untersuchen. Zunächst untersuchen wir wie zahlreicher Alter synchronisiert C. Elegans wachsen im Alter von Tieren zu erhalten und wir präsentieren die biochemische Verfahren um hoch-unlöslich-große Aggregate zu isolieren. In Kombination mit einer gezielten genetischen Knockdown, ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse an der Förderung oder altersabhängig Proteinaggregation zu verhindern, indem Sie entweder eine umfassende Analyse mit quantitativen Massenspektrometrie sezieren oder eine Kandidaten-basierte Analyse mit Antikörpern. Diese Erkenntnisse werden dann mit transgenen Tieren ausdrücken Leuchtstoff-Tags Aggregation neigen Proteine durch in-Vivo -Analyse bestätigt. Diese Methoden sollen erklären, warum bestimmte Proteine sind anfällig für Aggregat mit zunehmendem Alter und letztlich wie diese Proteine voll funktionsfähig zu halten.

Introduction

Protein misfolding und Aggregation sind ein Markenzeichen von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie AD, PD, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und viele andere anerkannte. Α-Synuclein Baugruppen zu Amyloid-Fibrillen anzusammeln, die beispielsweise als Lewy-Körper vor allem in der Substantia Nigra von Parkinson-Patienten, während bei ALS-Patienten TDP-43 oder FUS Misfold Form zytoplasmatischen Aggregaten in degenerierenden Motoneuronen. In jedem dieser neurodegenerativen Erkrankungen nicht Mechanismen, die Aufrechterhaltung der Homöostase Protein oder Proteostase verhindern die Ansammlung von fehlgefaltete Proteine, folglich zu Krankh....

Protocol

Hinweis: Zum besseren Verständnis des Verfahrens, ist eine schematische Darstellung des Workflows (Abbildung 1) befestigt.

1. Wachstum von großen Zahlen von Jugendlichen und im Alter von C. Elegans unterzogen um RNAi gezielt ein Gen von Interesse

Hinweis: Verwendung C. Elegans temperaturbedingte sterile gon-2(q388) Mutanten (CF2253), große Alter synchronisiert Populationen zu erhalten. Bei allen Arbeitsschritten ist es wichtig, unter semi-sterilen Bedingungen mit einer offenen Flamme zu arbeiten und zu prüfen, dass keine Verunreinigungen (z. B. mit Pilzen ode....

Results

Wir verwendet um wie langlebigen Tiere mit bewerten hier vorgestellten Methoden reduzierte IIS modulieren altersabhängigen Proteinaggregation. Durch Western blot (siehe Punkt 2.2, schnell unlöslichen Protein Extraktion für Western-Blot Analyse), analysiert die Summe und die unlösliche Eiweißgehalt von Young (Tag 3 des Erwachsenenalters) und im Alter von (18. Tag des Erwachsenenalters) Würmer auf Kontrolle RNAi und RNAi gezielt das Insulin / IGF-1-Like-Rezeptor Daf-2. Wir beobacht.......

Discussion

Hier berichten wir über eine Methodik zu isolieren, hoch-unlösliche Aggregate aus Altern C. Elegans RNAi durch Massenspektrometrie und Western blotting für Analyse unterzogen. Wir zeigen, dass Verbesserung Proteostase durch Reduzierung der IIS stark altersabhängig Proteinaggregation verhindert. Wenn Sie spezifische Aggregation neigen Proteine, in C. Elegansoverexpress auswählen, ist es möglich, weitere Mechanismen, die Modulation der inhärenten Proteinaggregation sezieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbacher Kulturflasche	Corning	4425-2XL	Pyrex, Fassungsvermögen 2.800 ml, mit 3 Blendeneinkerbungen
Membran-Schraubverschluss	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
Separatortrichter	Nalgene	4300-1000	Fassungsvermögen 1.000 ml
1 ml Spritze	BD Plastipak	300013
Graunadel, 27 G x ½ ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Membranfilter 0,025 & Mikro; M	Millipore	VSWP04700
pH-Streifen	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Proteasehemmer Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini EDTA-freie Tabletten
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethansulfonsäure (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglykol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	rekombinante, RNasefreie
RNaseA	Promega	A7973	Lösung
Gesamtprotein-Blot-Färbung	Thermofisher	S11791	Sypro Rubin-Protein-Blot-Färbung
Gesamtprotein-Gel-Färbung	Thermofisher	S12001	Sypro Rubin-Protein-Gel-Färbung
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid)	Serva	36970
Jodacetamid	Serva	26710
Ammoniumbicarbonat	Sigma-Aldrich	09830
Modifiziertes Trypsin		Promega V5111
Isobare Tags für die relative und absolute Quantifizierung	Sciex	4352135	iTRAQ Reagenzien Multiplex-Kit
Zentrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Schar	393126
Ultrazentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Schar	393315
Zentrifuge 5424R	Eppendorf
Zentrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Zentrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Zentrifugalverdampfer
Fluoreszierendes Stereomikroskop M165 FC	Leica		mit Planapo 2.0x Objektiv
Dissektionsmikroskop	Leica		Leica S6E
Mikroskop mit hoher Vergrößerung Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		mit PlanAPOCHROMAT 20x Objektiv und Zeiss Axio Cam MRm
Software
Bildanalysesoftware	ImageJ
Analyse von Massenspektrometriedaten	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli Stamm
OP50	CGC
RNAi Bakterien
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans Mutanten
CF2253	CGC, Stammname: EJ1158		Genotyp: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della Davids Labor am DZNE Tü bingen		Genotyp: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	Della Davids Labor am DZNE Tü bingen		Genotyp: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]