Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

Summary

Dieses Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopie Zahl Variationen in interessieren Pflanzen.

Abstract

Mutanten sind wertvolle genetische Ressourcen für Funktionsstudien gen. Um mutierte Sammlungen zu generieren, können drei Arten von mutagenen genutzt werden, einschließlich biologischer wie T-DNA oder Transposon, chemische wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder physische wie Ionisation Strahlung. Die Art der Mutation beobachtet variiert je nach der Mutagen verwendet. Ionisation Strahlung induzierten Mutanten sind Mutationen löschen, duplizieren oder Neuordnung. Während T-DNA oder Transposon-basierte Mutagenese, auf Arten, die zur Transformation unterliegen beschränkt, kann chemische oder physikalische Mutagenese auf verschiedenste Arten angewendet werden. Allerdings stützt sich die Charakterisierung der Mutationen abgeleitet von chemischen oder physikalischen Mutagenese traditionell auf eine kartenbasierte Klonen Ansatz, ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Hier zeigen wir, dass eine High-Density-Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (aCGH) Plattform angewendet werden kann, um effizient zu erkennen und zu charakterisieren, Kopie Nummer Variationen (CNV) in Mutanten abgeleitet von schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in Medicago Truncatula, ein Leguminosenarten. Gesamte Genom-Sequenzanalyse zeigt, dass es mehr als 50.000 Gene oder gen Modelle in M. Truncatula. Im vorliegenden, FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula stammen aus mehr als 150.000 Linien, M1, die wertvolle genetische Ressourcen für funktionelle Studien der Gene im Genom darstellen. Die hier beschriebenen aCGH-Plattform ist ein effizientes Werkzeug zur Charakterisierung von FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula.

Introduction

Hülsenfrüchte (Fabaceae) sind die drittgrößte Familie der Blütenpflanzen, mit vielen wirtschaftlich wichtige Arten wie Soja (Glycine Max) und Alfalfa (Medicago Sativa). Hülsenfrucht Pflanzen können interagieren mit Stickstoff-fixierenden Bodenbakterien, im allgemeinen genannt Rhizobien Wurzelknöllchen zu entwickeln, in denen die atmosphärische Distickstoff auf Ammoniak für den Einsatz von der Wirtspflanze reduziert wird. Als solche Anbau von Leguminosen Pflanzen erfordert wenig Input von Stickstoffdüngemitteln und trägt somit zu einer nachhaltigen Landwirtschaft. Hülsenfrucht Getreide produzieren Blätter und Samen mit hohem Proteing....

Protocol

Hinweis: Abbildung 1 zeigt die fünf Schritte für das Array CGH-Protokoll. Sie sind: 1) Vorbereitung der pflanzlichen Stoffen; (2) Isolierung von DNA-Proben von hoher Qualität; (3) Kennzeichnung und Reinigung von DNA-Proben; (4) Hybridisierung, waschen und das Scannen des gesamten Genoms Arrays; und 5) CGH Datenanalyse. M. Truncatula gesamte Genom Tiling Arrays enthalten insgesamt 971.041 einzigartige Oligo-Sonden, die Ausrichtung auf mehr als 50.000 Gene oder gen-Modelle in das Genom (siehe Tabelle der Materialien). Die einzigartige Sonden Abstand ca. alle 150 Basenpaare (bp) in exonic Regionen und 261 bp in in....

Results

Abbildung 2 zeigt die Verteilung der normalisierten Log₂ Verhältnisse der Mutant versus WT Signale über das gesamte Genom. Analyse der CGH Daten ergab eine ungefähre 22 kb Löschung auf Chromosom 4, das umfasst die gesamte SUNN gen³³ und mehrere andere kommentiert Gene in FN6191 Mutant (Abbildung 2, Abbildung 3). Die Kandidat gelöschten Region wurde durch 73.......

Discussion

Haben wir eine Array-CGH Plattform für die Erkennung und Charakterisierung von schnellen Neutronen Bombardement (FNB)-induzierten Mutanten in M. Truncatula CV Jemalong A17. Um die Verwendung von Array CGH Methode bei der Aufdeckung von Gen-Mutationen zu demonstrieren, führten wir aCGH Analyse des mutierten FN6191, die einen hyper-Nodulation Phänotyp im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen ausgestellt, wenn mit S. Meliloti Sm1021geimpft. Für die Segmentierung Analyse galt ein Segment erhebliche wenn das Log

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula Genom-Array, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutiert)	Im Haus	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (Referenz)	Im Haus	A17
Schwefelsäure	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
Nanotropfen-Spektralphotometer	Thermo Scientific	1000D
SureTag DNA-Markierungskit	Agilent	5190-3400
Random Primer	Agilent	5190-3399
Acetonitril	Sigma-Aldrich	271004-1L
Thermocycler	MJ research	PTC-200
Zentrifuge	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Stabilisierungs- und Trocknungslösung	Agilent	5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-Chip-Hybridisierungskit	Agilent	5188-5380
Hybridisierungskammer Dichtungsschieber	Agilent	G2505
Human Cot-1 DNA	Agilent	5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-Chip-Waschpuffer 1 und 2	Agilent	5188-5221
Hybridisierungskammer, rostfrei	Agilent	G2534A
Hybridisierungsofen	Agilent	G2545A
Aufreinigungssäulen	Agilent	5190-3391
Laserscanner	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Nimblegen	5225035001
Signalkarte 1.9	Roche Nimblegen	Signalkarte1.9