Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Zusammenfassung

Hier ist ein Protokoll für die Probenahme der menschlichen Plazenta Zotten Gewebe gefolgt von Isolation der Cytotrophoblasts für die primäre Zellkultur. Behandlung von Trophoblasten mit TNF rekapituliert Entzündung in der übergewichtigen intrauterine Umwelt und ermöglicht die Entdeckung von molekularen Zielstrukturen, geregelt durch eine Entzündung in der Plazenta mit mütterliche Korpulenz.

Zusammenfassung

Mütterliche Korpulenz ist verbunden mit einem erhöhten Risiko von nachteiligen perinatale Ergebnisse, die wahrscheinlich durch kompromittierte plazentaren Funktion vermittelt werden, die, im Teil, die Dysregulation der Autophagie zugeschrieben werden kann. Anomale Veränderungen in der Expression der Autophagie Regulatoren in der Plazenta von adipösen Schwangerschaften können durch entzündliche Prozesse im Zusammenhang mit Übergewicht und Schwangerschaft geregelt werden. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zur Probenahme von Zotten Gewebe und Isolierung von Zotten Cytotrophoblasts aus der Begriff menschlichen Plazenta für primären Zellkulturen. Danach erfolgt eine Methode zur Simulation der entzündlichen Milieus in der übergewichtigen intrauterine Umwelt durch Behandlung von primären Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF), ein proinflammatorischen Zytokin, das bei Adipositas und in erhöht ist Schwangerschaft. Durch die Umsetzung des Protokolls, die hier beschrieben, es wird gefunden, dass Exposition gegenüber exogenen TNF reguliert die Expression von Rubicon, ein negativer Regulator der Autophagie in Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit weiblichen Föten. Während eine Vielzahl von biologischen Faktoren in der übergewichtigen intrauterine Umwelt halten das Potenzial, kritische Pfade im Trophoblasten modulieren, ist dieses ex-Vivo -System besonders nützlich für die Bestimmung, wenn Ausdruck beobachteten in Vivo Muster im menschlichen Plazenta mit mütterliche Adipositas sind ein direktes Ergebnis von TNF-Signalisierung. Letztlich bietet dieser Ansatz die Gelegenheit, analysieren die Regulierungs- und molekularen Auswirkungen der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Autophagie und andere kritische zelluläre Signalwege im Trophoblasten, die das Potenzial haben, beeinflussen plazentare Funktion.

Einleitung

Adipositas ist eine entzündliche Zustand, gekennzeichnet durch eine chronische Entzündung der Low-Grade, aus überschüssigem Fettgewebe und Nährstoffverfügbarkeit. Bei Adipositas sind proinflammatorischen Zytokinen in metabolische Geweben sowie systemisch im Umlauf erhöht. Ein robusten Körper des Beweises hat gezeigt, dass TNF deutlich in der Umgebung von Fettleibigkeit mit Auswirkungen in Insulin-Resistenz und Stoffwechselstörungen¹erhöht ist. Aktivierung von TNF trägt auch zur Pathogenese der Krankheit bei Krankheiten wie Krebs und Autoimmunität, so dass es eine attraktive therapeutisches Ziel².

Entzündungen bei Adipositas wird durch Schwangerschaft, auch ein proinflammatorischen Zustand^3,4verschärft. Es hat bisher gezeigt, dass Plazenta TNF-Inhalte mit mütterliche Adipositas bei Schwangerschaften mit weiblichen Föten erhöht. Darüber hinaus hemmt TNF Behandlung mitochondriale Atmung in weiblichen aber nicht männlichen Trophoblast Zellen, was darauf hindeutet, dass TNF beteiligt ist, bei der Regulierung der plazentaren Stoffwechsel in einem sexuell dimorphen Weise⁵. Mütterliche Korpulenz ist verbunden mit einer erhöhten Inzidenz von einer Vielzahl von Komplikationen während der Schwangerschaft, einschließlich Totgeburt, mit männlichen Föten wird das empfindlilchste^3,6,7,8 . Aufgrund seiner Schlüsselrolle an der mütterlichen fetalen Schnittstelle können Veränderungen in der Funktionsfähigkeit der Plazenta in der übergewichtigen intrauterine Umwelt in Reaktion auf inflammatorische Signalisierung eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Ergebnisse der übergewichtigen Schwangerschaften spielen.

Cytotrophoblasts und Syncytiotrophoblasts im Gewebe der Plazenta Zotten sind entscheidend für die endokrine Signalisierung und Nährstoff- und Sauerstoff-Austausch zwischen Mutter und entwickelnden Fötus⁹. Störungen in der funktionellen Kapazität der Zotten Cytotrophoblasts (nachfolgend Trophoblasten) können die fötale Gesundheit und Entwicklung gefährden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Probenahme von Zotten Gewebe aus der Plazenta menschlichen Begriff durch sezieren entfernt die Chorion und basale Platte sowie ein optimiertes Verfahren zur Isolierung von Trophoblasten für primären Zellkulturen. Dieses Protokoll stammt von etablierten Methoden mit enzymatischen Verdauung der Zotten Gewebe, Zellen aus der extrazellulären Matrix, gefolgt von differenziellen Dichte Zentrifugation Trophoblasten^10, isolieren lassen ^11,12. Dieser Protokolldetails ein Ansatz in der primären Trophoblasten von Plazenta aus magerem Schwangerschaften mit Nährmedien ergänzt mit TNF, ein Bestandteil der entzündlichen Milieu zu simulieren behandelt werden mit mütterliche Korpulenz verbunden sind. Schließlich wird ein einfaches Verfahren für die Ernte Ergebniszelle Lysates von TNF-behandelten Trophoblasten gefolgt von Western Blot zum Erkennen von Änderungen in der Genexpression beschrieben.

Während dieses Modell nicht die adipogene in Utero Umwelt in ihrer Gesamtheit rekapitulieren, bietet es ein kontrolliertes System, das es erlaubt, analysieren, der individuelle Beitrag von TNF-vermittelte Entzündung der Trophoblasten als Reaktion auf mütterliche Korpulenz. Dieses Modell bietet sowohl die Möglichkeit zu entdecken oder zu bestätigen molekulare Targets direkt TNF signalisieren in den Trophoblasten geregelt sowie kann man testen, ob Veränderungen im gen Expressionsmuster in Vivo in Plazenta mit Müttern beobachtet Fettleibigkeit kann TNF-vermittelte Entzündung führen.

Der hier beschriebene Ansatz wurde implementiert, um die Wirkung von TNF-vermittelte Entzündung über die Regulierung der Autophagie in menschlichen Trophoblasten zu testen. Trophoblasten von adipösen Schwangerschaften mit männlichen Föten Ausstellung gestört selbstverdauende Umsatz oder Autophagosome Reifung¹³. Ein Protein namens Rubicon (RUN Domain Protein Beclin1 Interaktion und Cystein-reiche enthält), die zum späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert ist, hat vor kurzem beschrieben worden als "Bremse" selbstverdauende Umsatz dabei da er fungiert als eine negative Regulator der Autophagosome Reifung^14,15. Rubicon ist in der Tat ein seltenes Beispiel eines Proteins, die Autophagie, zurückhält, wodurch es eine wertvolle therapeutische Ziel. Sehr wenig Informationen gibt es über die pathophysiologische Bedeutung der Rubicon, außer für seine Rolle in der angeborenen Immunantwort auf Microbials^16,17 und Cardiomyocyte Schutz¹⁸. Mit dem beschriebenen Protokoll hier, wird es festgestellt, dass Rubicon hochreguliert in weiblichen primären Trophoblasten in Reaktion auf die Behandlung mit steigenden Konzentrationen von TNF bis 250 Pg/mL. Die Regulierung der Rubicon kann eine Rolle in wie weibliche Föten Tarif besser als Männer in den Schwangerschaften mit mütterliche Korpulenz spielen. Rekapitulation Entzündung mit mütterliche Korpulenz ex Vivo durch die Aufdeckung der menschlichen Trophoblasten, exogene TNF bietet eine Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen der übergewichtigen intrauterine Umwelt zur Regulierung von kritischen Pfaden in Trophoblasten und durch Verlängerung, plazentare Funktion.

Protokoll

Placentae wurden gesammelt von Arbeits- und Liefereinheit am Universitätsklinikum unter ein Protokoll durch die institutionelle Review Board of Oregon Health and Science University in Portland, Oregon, mit Einwilligung von genehmigt die Patienten.

1. Sammlung der plazentaren Gewebes

1. Vorbereitung
   Hinweis: alle Geräte, die Gewebe Begegnungen muss steril sein.
   1. Sterilisieren die sezierenden Ausrüstung durch Autoklavieren für 60 min bei 121 ° c
   2. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (PSA): Lab Jacken/Kleider/scheuert, Handschuhe und Maske mit einem Gesichtsschutz oder Schutzbrillen.
   3. Schalten Sie Wasserbad und auf 37 ° c
   4. Warm zwei 50 mL konische Rohre, jedes mit 25 mL der komplette Medien (Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, Tabelle 3) in einem 37 ° C Wasserbad.
   5. Mit Zustimmung des Patienten informiert, erhalten eine Plazenta sofort nach Lieferung per Kaiserschnitt.
   6. Machen Sie sich vertraut mit der Plazenta. Die Nabelschnur wird auf der fetalen Seite (Chorion Platte) eingefügt und Blutgefäße sind strahlenförmig von der Nabelschnur Einstichstelle erkennbar. Die gegenüberliegende Seite ist die mütterliche Seite oder die basale Platte. Freuen Sie sich auf die Decidua und Strukturen, Schiff Bäume, genannt Keimblätter enthalten.
2. Sampling der Zotten Gewebe
   Hinweis: Zotten Gewebe aus der Plazenta so bald wie möglich nach Lieferung, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten oder weniger abgetastet werden sollte.
   1. Mit der Chorion Platte 2-3 volle dicke Abschnitte (ca. 2,5 cm x 2,5 cm Größe) Verbrauchsteuern nach oben, 2-3 cm vom Rand der Plazenta an zufällige, mit Zange und Schere ( Abbildung 1A).
      Hinweis: Vermeiden Sie Teile der Plazenta, die abnorme (d.h. weiße Verkalkungen) angezeigt werden.
   2. Trim entfernt die Chorion und basalen Platten und großen Blutgefäße.
   3. Das resultierende Zotten Gewebe ( Abbildung 1 b, insgesamt ca. 80-120 g) in warmen komplette Medien und Trophoblast Isolierung innerhalb von 30 min der Probenahme beginnen.
      Hinweis: Einige nachgelagerten Assays und Anwendungen sind durch die Länge der Wartezeit zwischen Lieferung, Probenahme und Trophoblast Isolation betroffen. Es empfiehlt sich, diese Zeiten so kurz wie möglich und Isolationen konsistent zu halten.
   4. Mit den Techniken beschrieben in Schritten 1.2.1 - 1.2.2, probieren 5 zufällige 1 x 1 cm Abschnitte der Zotten Gewebe aus der Plazenta (einschließlich der Mittelpunktes).
   5. Cut pro 1 cm x 1 cm Zotten Gewebeprobe in 4-5 kleinere Stücke (ca. 30 mg), in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Flash-Einfrieren Flüssigkeit N ₂. Shop bei-80 ° C für den Einsatz in späteren Analysen.

2. Isolierung des Trophoblasten aus Zotten Gewebe

1. Vorbereitung
   Hinweis: verwenden Sie sterilen Ausrüstung und Verfahren im Zusammenhang mit Zellen in einem Laminar-Flow-Abzug führen.
   1. Tauwetter vier gefrorene Dichtegradienten (Tabelle 1, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, ergänzendes Material) bei 4 ° C am Vorabend die Plazenta kommt.
      Hinweis: Alternativ Dichtegradienten können erfolgen am Tag der Isolation.
   2. Turn Zentrifuge und auf 20 ° c
      Hinweis: Alle Zentrifugation Schritte sind auf maximale Beschleunigung und Verzögerung, sofern nicht anders angegeben.
   3. Vorbereiten 1 x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBSS) ergänzt mit Ca ^{+ 2} und Mg ^{+ 2} (Tabelle 3).
   4. Warme Trypsin auf 37 ° c
   5. Verdünnen DNase, etwa 2720 Kilounits/mL in sterilen ergänzt HBSS.
   6. Neugeborenes Kalb Serum (NCS) auf 37 ° c warmen 50 mL
   7. Warm komplette Medien auf 37 ° c
   8. Warm einfrierende Medien (90 % FBS, 10 % DMSO, Tabelle 3) auf 37 ° c
      Vorsicht: DMSO ist giftig und muss mit Handschuhen behandelt werden.
   9. Vorbereiten Verdauung Puffer (Tabelle 2 und 3) durch das Mischen von 308 mL ergänzt HBSS, 50 mL von Trypsin (3751.7 BAEE Units/mL) und 0,5 mL DNase (379.4 Kilounits/mL) in eine sterile Flasche.
      Anmerkung: Die ungefähre Zeit erforderlich, um Zellen aus Zotten Gewebe zu isolieren ist 7 h.
2. Verarbeitung der Zotten Gewebe
   1. spülen jedes Stück der Zotten Gewebe in einem 50 mL konische Röhrchen mit Raumtemperatur Phosphat gefüllt gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen und die PBS ggf. austauschen, bis das überschüssige Blut entfernt wird (PBS spülen werden hellrot oder rosa wenn das Gewebe gründlich gespült wird).
   2. Der Zotten Gewebe in eine sterile Petrischale und entfernen wie viele Blutgefäße wie möglich durch vorsichtig abkratzen der Zotten Weichgewebe aus den Gefässen mit einem Mikroskop-Objektträger.
   3. Das resultierende Zotten Gewebe mit einer Schere fein hacken.
3. Zotten Gewebe Verdauung und grobe Isolation des Trophoblasten
   1. übertragen Sie das Hackfleisch Zotten Gewebe auf eine sterile Flasche mit Aufschlusslösung entsprechend der berechneten Volumen anhand der spezifischen Aktivität von Trypsin und DNase (165 mL, Tabelle 2).
   2. Nach 35 min Inkubation bei 37 ° C Wasserbad mit 70 Umdrehungen pro Minute (u/min), schütteln die Verdauung-Flasche auf die Seite kippen und ermöglichen die unverdaute Teile des Gewebes auf den Boden der Flasche zu begleichen. Der Überstand mit einer serologischen Pipette, Vermeidung ständige Gewebe sorgfältig auszuarbeiten.
   3. Verzichtet den Überstand durch ein 100 µm Zelle Sieb gleichmäßig zwischen 50 mL konische Röhrchen.
      Hinweis: Um Zeit zu sparen, es empfiehlt sich, die zweite beginnen Verdauung indem Aufschlusslösung (110 mL, Tabelle 2) zu den übrigen Gewebe und Wiederaufnahme Inkubation, wie unter Punkt 2.3.2 beschrieben beigelegt.
   4. Schicht sanft 3-5 mL NCS unter der angespannten Überstand durch den Verzicht auf langsam aus einer serologischen Pipette an der Unterseite des Rohres. Ein Meniskus zwischen den angespannten überstand (mit Trophoblasten) und NCS sollte sichtbar ( Abb. 2A).
   5. Zentrifugieren die Überstände über NCS 1.250 x g für 15 min bei 20 ° C. Das daraus resultierende Pellet enthalten rote Blutkörperchen in der untersten Schicht, gefolgt von einer weißen Schicht, den Trophoblast Zellen ( Abb. 2 b).
   6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2 - 2.3.5 für jeden der die zweite und dritte Verdauung (Hinzufügen von 110 mL und 83,5 m bzw. der Aufschlusslösung bis in die Flasche des Gewebes, Tabelle 2).
   7. Sobald alle Überstände zentrifugiert worden, Aufschwemmen jedes Pellet in 5 mL warme komplette Medien und dann bündeln die Suspensionen zusammen.
   8. Teilen die Zellsuspension gleichmäßig zwischen zwei 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 1.250 x g für 15 min bei 20 ° c
   9. Sanft entfernen den Überstand und Aufschwemmen jeder Zelle Pellets in 6 mL warmen kompl.ETE Medien.
4. Dichte Zentrifugation
   1. unterteilen die Zellsuspension gleichmäßig auf vier Dichtegradienten (3 mL) durch langsam und vorsichtig Schichtung der Zellsuspension auf der Oberseite der Dichtegradienten mit einer Transferpipette.
   2. Zentrifugieren Dichtegradienten bei 1.250 x g für 20 min bei 20 ° C mit minimalen Beschleunigungs- und Verzögerungswerte. Dies sollte produzieren unterscheidbare Bands der sedimentierte Zellen (Tabelle 4).
   3. Langsam und vorsichtig entfernen der oberen Schichten der Dichte-Gradienten-Medien (DGM), bis die undurchsichtigen Bändern Trophoblast Zellen (zwischen 35-50 % DGM) (Tabelle 4) erreicht ist.
   4. Übertragen die Trophoblast Bands in zwei 50 mL konische Röhrchen und füllen Sie mit warmen komplette Medien.
   5. Sanft invertieren die Rohre 3 - 6 Mal zu mischen und Zentrifugieren bei 1.250 x g für 15 min bei 20 ° c
   6. Entfernen den Überstand und Aufschwemmen jede Zelle Pellet in 5 mL warme komplette Medien. Kombinieren Sie die Zellsuspensionen und zählen lebensfähige Zellen mit einem Hemocytometer und Trypan blau (oder bevorzugte Zelle Zählweise).
5. Zählen Zellen mit einem Hemocytometer
   1. mischen die Zellsuspension durch Pipettieren oben und unten mit einer serologischen Pipettieren oder sanft invertieren das Rohr mehrmals.
   2. Kombinieren gleiche Teile der Zellsuspension und Trypan blau (d.h. jeweils 20 µL) in einem separaten Rohr und vorsichtig mischen.
   3. Für 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Sanft verzichten, 15-20 µL der Zelle-Trypan blau Mischung zwischen dem Deckglas und der Hemocytometer und erlauben die Zellen über das Raster durch Kapillarwirkung diffundieren.
   5. Zählen lebensfähige Zellen (abgestorbene Zellen werden tiefes blau gefärbt) in jedem der vier 4 x 4-Quadranten mit einem Stückzähler. Ein System des Zählens dafür Zellen zählen nicht mehr als einmal beschäftigen (d. h. Zellen, die die unteren bzw. linken Grenzen berühren nicht zählen).
      Hinweis: Jeder 4 x 4-Quadranten sollte zwischen 50-150 Zellen enthalten. Zu wenige oder zu viele Zellen zu einer über- oder Unterschätzung der Anzahl von Zellen führen können.
   6. Durchschnitt die gesamten Zelle zählt aus jedem der 4 x 4-Quadranten mit 10 multiplizieren ⁴, und multiplizieren Sie dann mit den Verdünnungsfaktor (Zellsuspension Trypan blau) zur Berechnung der Anzahl der Zellen pro mL.
   7. Multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen pro mL durch das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf die Ergebniszelle Rendite errechnen.
      Hinweis: Etwa 100 Millionen Zellen sind von Isolationen, beginnend mit 80-120 g der Zotten Gewebe erwartet.
6. Galvanischen Zellen
   1. Platte 3 Millionen Zellen/Well (3,3 x 10 ⁵ Zellen pro cm ²) in einem 6-Well-Platte (2 mL Suspension pro Well) und sanft hin und her schaukeln und Seite an Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
      Hinweis: Trophoblasten erfordern Gewebekultur behandelt Platten richtig einzuhalten. Eine Monolage von Zellen ist erforderlich, um Syncytialization zu fördern.
   2. Verlassen die vergoldeten Zellen in der Laminar-Flow-Haube für ca. 30 min erlauben Zellen gleichmäßig zu verteilen, zu begleichen und beginnen an der Unterseite der Brunnen halten vor dem Einlegen in den Inkubator.
   3. Kultur-Zellen bis zu 72 h (mit täglichen Medien Änderungen) in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO ₂ % und 95 % Luftfeuchtigkeit.
      Hinweis: Untersuchen Sie die Trophoblasten unter dem Mikroskop um 10-20 x alle 24 h Kultur. Trophoblasten nicht vermehren und passagiert werden können nicht. Im Laufe von 72 h der Kultur, der Runde einzelnen Trophoblasten verschmelzen um zu bilden ein Syncytium ( Abb. 3A und B).
7. Einfrieren Zellen
   1. Pellet nicht verwendete Zellen durch Zentrifugation bei 1.250 x g für 10 min bei 20 ° c
   2. Aspirieren Sie soviel Medien wie möglich aus dem Pellet.
   3. Aufschwemmen das Pellet in eisigen Medien (Tabelle 3).
   4. Einfrieren der Aliquote bei-80 ° C in einem eiskalten Behälter gefüllt mit 100 % Isopropanol. Übertragen Sie die eingefrorenen Aliquoten auf Flüssigkeit N ₂ am Folgetag für langfristige Lagerung.
      Hinweis: Zellen können nach Einfrieren kultiviert werden.
8. Auftauen Zellen
   1. ein Aliquot des gefrorenen Zellen zu entfernen und Auftauen im Wasserbad 37 ° C während wirbeln. Entfernen Sie den Aliquoten aus dem Wasserbad, kurz bevor es zu einer Flüssigkeit vollständig aufgetaut ist.
   2. Sofort die aufgetauten Zellen auf eine 15 ml konische Rohr übertragen. Ab Verlangsamung am Anfang 10 mL komplette Medien mit intermittierenden mischen hinzufügen.
   3. Schlauch mehrmals mischen zu invertieren.
   4. Zentrifuge bei 200 X g für 10 min bei 20 ° C.
   5. Aspirieren überstand und Aufschwemmen das Pellet in 2-5 mL warme komplette Medien.
   6. Zählen die Zellen und die Platte wie oben beschrieben.

3. Behandlung von primären Trophoblasten TNF und Sammlung der Zelle Lysates Western Blotting

1. Vorbereitung
   1. Warm komplette Medien auf 37 ° c
   2. 10 µg/mL Lager TNF in komplette Medien und Store bei-20 ° C bis einsatzbereit machen.
   3. Machen eine 1 µg/mL arbeiten Bestand an TNF in komplette Medien, wenn Sie bereit sind, die Zellen zu behandeln. Serielle verdünnen TNF arbeiten Lager 10 ⁴ Pg/mL, 10 ³ Pg/mL, 500 Pg/mL, 250 Pg/mL und 125 Pg/mL in komplette Medien.
      Hinweis: Die TNF-Konzentration von 10 ⁴ Pg/mL ist mäßig zytotoxisch. Anpassung der TNF Konzentrationen getestet wird auf die Besonderheiten der gewünschten downstream-Anwendungen abhängen.
2. Behandlung von Zellen mit TNF
   1. nach 24 h Kultur, Aspirieren Nährmedien aus den Zellen und ersetzen mit 2 mL TNF ergänzt Medias pro Bohrloch auf 6-Well-Platten (mindestens zwei Brunnen pro Behandlung und Fahrzeug Steuerelement).
   2. Nach 24 h TNF-Exposition (48 h der Kultur), ersetzen die TNF ergänzt Medien durch komplette Medien.
3. Zellen ernten und Gesamt-Protein
   1. nach 72 h (24 h vorbei Entfernung von TNF) Kultur, aspirieren Sie Medien, sanft spülen Zellen mit Raumtemperatur PBS und 80 µL eiskalt Tests Test hinzufügen Puffer (RIPA) mit frisch hinzugefügt direkt in jede Vertiefung Protease und Phosphatase-Inhibitoren (Tabelle 3).
   2. Der Zellen von der Platte mit einer Zelle Spachtel entfernen. Übertragen Sie die Zellen auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, Bündelung von Brunnen in Behandlungsgruppen.
   3. Lyse der Zellen durch Vortexen die Rohre hoch für mindestens drei Intervalle von 15 s.
   4. Brüten die Zellen bei 4 ° C mit Schaukeln für 15 min.
      Hinweis: Alternativ nach Schritt 3.3.3., die Zellen können für 15 min mit intermittierenden Agitation auf Eis inkubiert werden, durch streichen, Rohr, aufschütteln, oder pipettieren Sie und tunWN.
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.3.3.
   6. Zentrifugieren der Rohre bei 10.000 x g für 5 min bei 4 ° C zu Pellets Zelltrümmer.
   7. Übertragung der Überstand (mit zellulären Proteinen) zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und bei-80 ° c
      Hinweis: Das Protokoll kann hier gestoppt und zu einem späteren Zeitpunkt wieder aufgenommen. Es ist ratsam, mehrere Aliquote des zellulären Proteinproben mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
   8. Gesamt-Protein-Konzentration zu bestimmen, indem Sie eine bevorzugte Methode, wie z. B. eine saure Bicinchoninic-Assay (BCA, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, Zusatzmaterial).
4. SDS-PAGE und Western Blotting für Rubicon oder Protein of Interest
   Hinweis: Folgen Sie Western Blot-Protokolle nach Hersteller ' s Anweisungen mit einem bevorzugten Laborsystem.
   1. Last zwischen 20-40 µg von Gesamtprotein im Probenpuffer (Tabelle 3) pro Bohrloch zu einem 12 % Acrylamid Gel. Trennen der Proteine durch SDS-PAGE im laufenden Puffer (Tabelle 3).
   2. Nass-Transfer der Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran laut Hersteller ' s Anweisungen im Transfer-Puffer (Tabelle 3).
   3. Inkubieren Sie die Membran in 5 % Milchpulver in Tris-Buffered Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST, Tabelle 3) für mindestens 1 h bei Raumtemperatur mit rockigen.
   4. Inkubieren Sie die Membran in eine Rubicon Primärantikörper (siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, ergänzendes Material) in 1: 500 in 1 % Milchpulver in TBST über Nacht bei 4 ° C mit rockigen.
   5. Vorsichtig waschen die Membran 3 x 5 min in TBST und 1 x 5 min in TBS bei Raumtemperatur mit rockigen.
   6. Brüten die Membran in 1: 2000 - 1: 5.000 Sekundärantikörper (HRP verknüpft oder bevorzugte sichtbar konjugiert, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, ergänzendes Material) in 5 % Milchpulver in TBST für mindestens 1 h bei Raumtemperatur mit Rocking.
   7. Des Waschvorgangs im Schritt 3.4.5 beschrieben wiederholen und visualisieren Sie den Fleck mit einem geeigneten Visualisierung (d.h. Chemolumineszenz) Substrat auf ein bildgebendes System.
   8. Wiederholen Sie das Waschen in Schritt 3.4.5 beschrieben und die Membran für β-Aktin oder eine bevorzugte laden Kontrolle laut Hersteller Sonde ' Anweisungen s.
   9. Auf bevorzugte Bildanalyse-Software analysieren den Ausdruck von Rubicon durch manuelle Quantifizierung der Extinktion (Band Intensitäten), Subtraktion von Hintergrund-Absorption und Normalisierung der entsprechenden Belastung Steuern Band Intensitäten. Führen Sie statistische Auswertungen je nach Bedarf, um statistisch signifikante Änderungen im Protein-Ebene zu testen.

Ergebnisse

Begriff der menschlichen Plazenta aus Lean (vor der Schwangerschaft Body-mass-Index (BMI) < 25) Mütter mit unkomplizierten Schwangerschaften tragen weibliche Nachkommen wurden gesammelt und innerhalb von 15 Minuten nach Lieferung per Kaiserschnitt (keine Arbeit) abgetastet. Die Plazenta wurden für das Fehlen von Verkalkungen und typische Entwicklung untersucht: mit einem Gewicht zwischen 300-600 g mit der Nabelschnur und Membranen entfernt, in der Form, zwischen 15-25 cm im Durchmesser...

Diskussion

Die Plazenta, verantwortlich für die Regulierung des Wachstums des Fötus, weist auf kompromittierten Funktion in der übergewichtigen Umwelt⁶. Trotz der hohen metabolischen Anforderungen des Trophoblasten weisen Plazenta mit mütterliche Korpulenz dysfunktionalen mitochondriale Atmung^6,19. Veränderungen im Stoffwechsel der Plazenta können zu erhöhten Inzidenz von Komplikationen und unerwünschten fetalen Ergebnisse beobachtet in fettleibig Sc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10X HBSS	Gibco	14185-052
CaCl2 (anhyd.)	Sigma-Aldrich	C1016-100G
MgSO4 (anhyd.)	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
Trypsin	Gibco	15090-046
DNAse	Worthington Biochemical Corp.
Protease-/Phosphatase-Hemmer	Thermofisher Scientific	88668
Tris HCl	Invitrogen	15506-017
EDTA	Invitrogen	15576-028
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
SDS	Fisher Scientific	BP166-600
Natriumdesoxycholat.	Fisher Scientific	AAJ6228822
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Iscove' s Modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM)	Gibco	12440-046
Fötales Kälberserum (FBS)	Corning	35-010-CV
Kälberserum für Neugeborene (NCS)	Gibco	26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptomycin)	Gibco	15140-122
10% Formalin	Fisher Scientific	23-427-098
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
TNFα	Sigma-Aldrich	SRP3177-50UG
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	70013-032
K2EDTA Vacutainer-Blutentnahmeröhrchen	BD	366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM)	GE Healthcare	17-0891-01
6-Well-Platten	Corning	353046
Zellsiebe	Fisher Scientific	22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2,0 mL, natur	Fisher Scientific	22363352
Trypan Blue	Corning	25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System	Bio-Rad	1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell	Bio-Rad	1658033
TGX FastCast Acrylamid Kit, 12%	Bio-Rad	1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting-Kammer	Bio-Rad	1654112
4X Laemmli Probenpuffer	Bio-Rad	1610747
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-100ML
Glycin	Bio-Rad	1610718
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949-500ML
Instant fettfreie	Trockenmilch Nelke
Rubicon (D9F7) Kaninchen mAb	Cell Signalling Technology	8465S Monoklonaler
Anti-β-Aktin-Antikörper, hergestellt in Maus	Sigma-Aldrich	A2228-100UL
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper	Zellsignaltechnologie	7074S
Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper	Zellsignaltechnik	7076S
SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-Substrat	Thermo Scientific	34578