Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Summary

Hier ist ein Protokoll für die Probenahme der menschlichen Plazenta Zotten Gewebe gefolgt von Isolation der Cytotrophoblasts für die primäre Zellkultur. Behandlung von Trophoblasten mit TNF rekapituliert Entzündung in der übergewichtigen intrauterine Umwelt und ermöglicht die Entdeckung von molekularen Zielstrukturen, geregelt durch eine Entzündung in der Plazenta mit mütterliche Korpulenz.

Abstract

Mütterliche Korpulenz ist verbunden mit einem erhöhten Risiko von nachteiligen perinatale Ergebnisse, die wahrscheinlich durch kompromittierte plazentaren Funktion vermittelt werden, die, im Teil, die Dysregulation der Autophagie zugeschrieben werden kann. Anomale Veränderungen in der Expression der Autophagie Regulatoren in der Plazenta von adipösen Schwangerschaften können durch entzündliche Prozesse im Zusammenhang mit Übergewicht und Schwangerschaft geregelt werden. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zur Probenahme von Zotten Gewebe und Isolierung von Zotten Cytotrophoblasts aus der Begriff menschlichen Plazenta für primären Zellkulturen. Danach erfolgt eine Methode zur Simulation der entzündlichen Milieus in der übergewichtigen intrauterine Umwelt durch Behandlung von primären Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF), ein proinflammatorischen Zytokin, das bei Adipositas und in erhöht ist Schwangerschaft. Durch die Umsetzung des Protokolls, die hier beschrieben, es wird gefunden, dass Exposition gegenüber exogenen TNF reguliert die Expression von Rubicon, ein negativer Regulator der Autophagie in Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit weiblichen Föten. Während eine Vielzahl von biologischen Faktoren in der übergewichtigen intrauterine Umwelt halten das Potenzial, kritische Pfade im Trophoblasten modulieren, ist dieses ex-Vivo -System besonders nützlich für die Bestimmung, wenn Ausdruck beobachteten in Vivo Muster im menschlichen Plazenta mit mütterliche Adipositas sind ein direktes Ergebnis von TNF-Signalisierung. Letztlich bietet dieser Ansatz die Gelegenheit, analysieren die Regulierungs- und molekularen Auswirkungen der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Autophagie und andere kritische zelluläre Signalwege im Trophoblasten, die das Potenzial haben, beeinflussen plazentare Funktion.

Introduction

Adipositas ist eine entzündliche Zustand, gekennzeichnet durch eine chronische Entzündung der Low-Grade, aus überschüssigem Fettgewebe und Nährstoffverfügbarkeit. Bei Adipositas sind proinflammatorischen Zytokinen in metabolische Geweben sowie systemisch im Umlauf erhöht. Ein robusten Körper des Beweises hat gezeigt, dass TNF deutlich in der Umgebung von Fettleibigkeit mit Auswirkungen in Insulin-Resistenz und Stoffwechselstörungen¹erhöht ist. Aktivierung von TNF trägt auch zur Pathogenese der Krankheit bei Krankheiten wie Krebs und Autoimmunität, so dass es eine attraktive therapeutisches Ziel².

Protocol

Placentae wurden gesammelt von Arbeits- und Liefereinheit am Universitätsklinikum unter ein Protokoll durch die institutionelle Review Board of Oregon Health and Science University in Portland, Oregon, mit Einwilligung von genehmigt die Patienten.

1. Sammlung der plazentaren Gewebes

1. Vorbereitung
   Hinweis: alle Geräte, die Gewebe Begegnungen muss steril sein.
   1. Sterilisieren die sezierenden Ausrüstung durch Autoklavieren für 60 min bei 121 ° c
   2. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (PSA): Lab Jacken/Kleider/scheuert, Handschuhe und Maske mit einem Gesichtsschutz oder Schutzbrillen.

Results

Begriff der menschlichen Plazenta aus Lean (vor der Schwangerschaft Body-mass-Index (BMI) < 25) Mütter mit unkomplizierten Schwangerschaften tragen weibliche Nachkommen wurden gesammelt und innerhalb von 15 Minuten nach Lieferung per Kaiserschnitt (keine Arbeit) abgetastet. Die Plazenta wurden für das Fehlen von Verkalkungen und typische Entwicklung untersucht: mit einem Gewicht zwischen 300-600 g mit der Nabelschnur und Membranen entfernt, in der Form, zwischen 15-25 cm im Durchmesser.......

Discussion

Die Plazenta, verantwortlich für die Regulierung des Wachstums des Fötus, weist auf kompromittierten Funktion in der übergewichtigen Umwelt⁶. Trotz der hohen metabolischen Anforderungen des Trophoblasten weisen Plazenta mit mütterliche Korpulenz dysfunktionalen mitochondriale Atmung^6,19. Veränderungen im Stoffwechsel der Plazenta können zu erhöhten Inzidenz von Komplikationen und unerwünschten fetalen Ergebnisse beobachtet in fettleibig Sc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS	Gibco	14185-052
CaCl2 (anhyd.)	Sigma-Aldrich	C1016-100G
MgSO4 (anhyd.)	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
Trypsin	Gibco	15090-046
DNAse	Worthington Biochemical Corp.
Protease-/Phosphatase-Hemmer	Thermofisher Scientific	88668
Tris HCl	Invitrogen	15506-017
EDTA	Invitrogen	15576-028
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
SDS	Fisher Scientific	BP166-600
Natriumdesoxycholat.	Fisher Scientific	AAJ6228822
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Iscove' s Modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM)	Gibco	12440-046
Fötales Kälberserum (FBS)	Corning	35-010-CV
Kälberserum für Neugeborene (NCS)	Gibco	26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptomycin)	Gibco	15140-122
10% Formalin	Fisher Scientific	23-427-098
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
TNFα	Sigma-Aldrich	SRP3177-50UG
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	70013-032
K2EDTA Vacutainer-Blutentnahmeröhrchen	BD	366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM)	GE Healthcare	17-0891-01
6-Well-Platten	Corning	353046
Zellsiebe	Fisher Scientific	22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2,0 mL, natur	Fisher Scientific	22363352
Trypan Blue	Corning	25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System	Bio-Rad	1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell	Bio-Rad	1658033
TGX FastCast Acrylamid Kit, 12%	Bio-Rad	1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting-Kammer	Bio-Rad	1654112
4X Laemmli Probenpuffer	Bio-Rad	1610747
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-100ML
Glycin	Bio-Rad	1610718
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949-500ML
Instant fettfreie	Trockenmilch Nelke
Rubicon (D9F7) Kaninchen mAb	Cell Signalling Technology	8465S Monoklonaler
Anti-β-Aktin-Antikörper, hergestellt in Maus	Sigma-Aldrich	A2228-100UL
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper	Zellsignaltechnologie	7074S
Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper	Zellsignaltechnik	7076S
SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-Substrat	Thermo Scientific	34578