Methodenartikel

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

DOI:

10.3791/56487

⸱

18. Oktober 2017

 ,  , 
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir zeigen eine Methode mit Caenorhabditis Elegans als Modell Host, um mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Mikroben sind über die Ernährung machen dem Darm den primären Speicherort für die Krankheit eingeführt. Die Nematoden Darm strukturell und funktionell imitiert Säugetier-Darm und ist transparent macht es zugänglich für mikroskopische Untersuchung von Besiedlung. Hier zeigen wir, dass Krankheitserreger Krankheit und zum Tod führen können. Wir sind in der Lage, mikrobielle Mutanten zu identifizieren, die veränderten Virulenz zu zeigen. Seine erhaltenen angeborene Reaktion auf biotische betont macht C. Elegans ein ausgezeichnetes System Facetten des angeborenen Immunsystems Wirt Interaktionen zu untersuchen. Wir zeigen, dass Hosts mit Mutationen im gen duale Oxidase nicht reaktiven Sauerstoffspezies produzieren und sind nicht in der Lage, mikrobielle Beleidigung zu widerstehen. Weiter zeigen wir die Vielseitigkeit des vorgestellten überleben Tests zeigen, dass es zur Untersuchung der Auswirkungen von Inhibitoren des mikrobiellen Wachstums verwendet werden kann. Dieser Test kann auch verwendet werden, entdecken Pilz Virulenzfaktoren als Ziele für die Entwicklung von neuartigen Antimykotika, sowie bieten die Möglichkeit, weitere Host-Mikroben-Interaktionen aufzudecken. Das Design dieser Assay eignet sich gut für hohen Durchsatz Vollständiggenom Bildschirme, während die Fähigkeit, Cryo-Konserve Würmer für zukünftigen Gebrauch es eine kostengünstige und attraktive ganze Tiermodell macht zu studieren.

Einleitung

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C. Elegans hat seit mehr als 50 Jahren als leistungsstarke Modellorganismus eingesetzt. In den 1960er Jahren Pionier südafrikanischer Biologe Sydney Brenner im Einsatz von C. Elegans , neuronale Entwicklung zu studieren ebnet den Weg für eine lange Linie von Wissenschaftlern, verschiedene Aspekte der Zell- und Biologie in Nematoden zu studieren. Diese Linie umfasst Nobelpreisträger Craig Mello und Andrew Fire für ihre RNAi Arbeit1, Robert Horvitz und John Sulston für ihre Arbeit über die Organentwicklung und Apoptose2,3,4, und Martin Chalfie für seine Arbeiten über grün fluoreszierendes Protein5. Obwohl diese Modellorganismus traditionell verwendet wurde, um Entwicklungsstörungen Molekularbiologie, in den vergangenen 15 Jahren zu studieren, haben Forscher damit begonnen, C. Elegans zu verwenden, um die Biologie der verschiedenen menschlichen Krankheitserreger einschließlich Pseudomonas untersuchen Aeruginosa, Staphylococcus Aureus, Salmonellen Entericaund Serratia Marcescens6,7,8,9,10. Diese Studien zeigten, dass viele der Mechanismen der Interaktion Mensch-Erreger beteiligt sind konserviert in Nematoden, aber auch das gibt es einige Immunität-Mechanismen, die einzigartig für dieses Modell Organismus11,12. In der Natur C. Elegans Begegnungen einer Vielzahl von Bedrohungen aus aufgenommenen Krankheitserreger im Boden vorhanden, und dies hat einen starken Selektionsdruck zu entwickeln und zu pflegen eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem in seiner Darmlumen zur Verfügung gestellt. Viele der Gene und Mechanismen, die im Bereich des Darmlumens werden durch hoch konserviert Elemente orchestriert, die gibt es auch in höheren Säugetiere11,13. C. Elegans stellt daher ein großes Modell, Magen-Darm-Erreger wie Salmonella Enterica14, Shigella Boydii15oder Vibrio Cholera16zu studieren.

Hier heben wir die bemerkenswerte Vielseitigkeit von C. Elegans als Modell Host Infektionserreger wie C. Albicanszu studieren. C. Elegans als Modell Host ermöglicht Hochdurchsatz-Screening für Virulenz, das ist weniger teuer und zeitaufwändig als ein Mausmodell, das häufig verwendet wird, um Candidiasis42zu studieren.

In dieser Studie zeigen wir, dass dieses Modell und ihre überleben Assay zuverlässig genutzt werden können, für das Studium Host angeborenen Immunsystem Effektoren wichtig gegen Infektionen, Erreger Determinanten, die Virulenz, fahren und pharmakologischen Verbindungen können in Pathogenese eingreifen. Ähnlich wie zuvor beschriebenen Tests diese Methode bietet eine Möglichkeit des Studiums Exposition gegenüber einem Krankheitserreger über die gesamte Lebensdauer des Tieres, vom Larvenstadium bis ins Erwachsenenalter, anstatt nur Erwachsenenalter bis Tod43,44. Zusammenfassend unsere C. Elegans - ist C. Albicans -Modell ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug, das verwendet werden kann, nicht nur die genetischen Grundlagen zu studieren, die Infektion und Immunität zu fahren, sondern auch neue Verbindungen für eine therapeutische Intervention zu identifizieren.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Nematode Wachstum Medium (NGM)

  1. für 1 L der Medien, zu kombinieren, 20 g Agar, 2,5 g organischer Stickstoff-Quelle (z.B., Bacto-Pepton) und 3 g Natrium-Chlorid in eine 2 L Flasche. 975 mL sterilem Wasser hinzugeben.
    1. Add in einer sterilen Stir Bar. Wenn eine automatische Media Ausgießer, Autoklaven Tubing und Medien für 15 min; Medien sollten Autoklaven für mehr wenn ein höheres Volumen erfolgt.
  2. Medien auf Platte rühren und abkühlen lassen.
    1. Sobald Medien warm an (ca. 60 ° C) aseptisch ist fügen Sie 1 mL 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, 25 mL KPO 4 und 1 mL 0,5 % Cholesterin im Äthanol.
    2. Medien (von hand oder durch automatische Pumpe) unter Laminar-Flow in Gießen 35 mm x 10 mm sterile Petrischalen. Unter Haube für 1-2 Tage vor dem Gebrauch trocknen lassen.
      Hinweis: Platten sollten gespeichert werden, bei 4 ° C um Kontaminationen zu vermeiden.

2. Macht ein Wurm holen

  1. schneiden Sie ein 1,5 cm Stück von Aluminiumdraht. Legen Sie ca. 0,5 cm Länge in der Spitze einer Pasteurpipette.
    1. Mit einem Bunsenbrenner oder Alkohol-Lampe, schmelzen die Pipettenspitze Glas durch langsam in der Flamme drehen, bis der Draht sicher auf die Pipette eingehalten wird, ohne die ursprüngliche Form des die Pipettenspitze.

3. Vorbereitung der E. Coli-Kultur

  1. mit einer sterilen Schleife, einzige Kolonie von E. Coli-Stamm OP50 in 200 mL Brühe Luria impfen. Inkubation über Nacht unter Schütteln bei 37 ° c
  2. Die Flüssigkultur ist bereit für den Einsatz am Folgetag und bei 4 ° C bei Nichtgebrauch gespeichert werden können.
    Hinweis: Die E. Coli-Stamm, OP50, dient als Nahrungsquelle für C. Elegans. Dieser Kultur verwendet werden, für bis zu mehrere Monate bei 4 ° c

4. Wesentlichen C. Elegans Wartung

  1. Samen NGM Agarplatten mit E. Coli von Schmierblutungen etwa 50-100 µL bereit OP50 Flüssigkultur in die Mitte des Tellers vorbereitet.
  2. Abdeckplatten und bei Raumtemperatur für 24 Std. trocknen lassen. Nach dem Trocknen legen Platten bei 37 ° C über Nacht für ein schnelles Wachstum oder halten bei Raumtemperatur, wenn langsameres Wachstum gewünscht wird.
  3. Der Platte Würmer hinzufügen, indem entweder " chunking, " (siehe Protokoll Schritt 5 " Chunking und Kommissionierung Würmer "), Kommissionierung Würmer einzeln oder Wurm Eiern direkt auf den Teller zu platzieren (siehe Protokoll Schritt 6 " Ei Vorbereitung ").

5. Chunking und Kommissionierung Würmer

Hinweis: " Chunking, " bezieht sich auf eine Praxis, die häufig in C. Elegans Wartung. Dabei schneiden einen Abschnitt der NGM-Agar-Platte, die Würmer enthält, und dieses Stück auf eine neue Platte zu übertragen, damit auch eine große Anzahl von Würmern im Prozess übertragen. Verschmutzung kann auch aus der Platte auf diese Weise geschnitten werden. Bei der Kommissionierung Würmer, ist es wichtig, die Integrität des Nährbodens zu pflegen, denn Würmer in Löcher im Agar verloren gehen können. Darüber hinaus ist es wichtig, damit die Abholung abkühlen, bevor Sie die Platte, um zu verhindern, dass der Agar schmelzen oder brennen die Würmer berühren können.

  1. Um schnell große Mengen an Würmern auf neue Teller übertragen schneiden Sie ein Stück der NGM-Agar, enthält die ausgewählten Würmer mit einem Spatel. Entfernen Sie das geschnittene Stück und legen Sie es Gesicht nach unten am Rand des Rasens OP50 auf eine neue Platte.
  2. Transfer Würmer einzeln wie folgt im Protokoll Schritt 8.2, " Survival Test, " mit einem Wurm nehmen. Flamme des Drahtes in der Wurm holen bis es rot ist. Von der Flamme entfernen und für ein paar Sekunden abkühlen lassen.
  3. Mit den Draht auf die Abholung, sanft den Rasen der OP50 Kultur angebaut auf der neuen Platte, über den Draht auf die Pick kratzen.
  4. Die Viskose Kultur über die Spitze des Drahtes macht Würmer halten Sie sich an die Spitze der Abholung, so sanft ausgewählten Würmer mit einer swiping Bewegung abholen.
  5. Nach ausgewählten Würmer versammelt sind, legen Sie sie auf eine neue Platte durch sanft streichen Kultur auf Agar. Legen Sie den Draht in die Flamme, verbleibenden Kultur bei der Abholung zu entfernen.

6. Ei-Vorbereitung

  1. Ort etwa 20 ausgewachsene Tiere (ca. 2-3 Tage nach dem Schlupf, wenn gewachsen bei 20 ° C) durch entweder Abnehmen oder chunking gemäß Protokoll Schritt 5, " Chunking und Kommissionierung Würmer, " auf einen Teller mit 50 ausgesät µL der E. Coli-Stamm, OP50.
  2. Zu die Eiern sammeln, überfluten die Platte mit 10 mL der M9 Puffer nach 1-2 Tagen. Mit Hilfe einer serologischen Glaspipette, wirbeln Sie und schütteln Sie sanft den Inhalt auf der Agarplatte freizugebende Eiern OP50 oder Erwachsene Tiere stecken. Sammeln Sie alle Flüssigkeit, die mit den Eiern und Erwachsene.
  3. Transfer M9 und OP50 Lösung in einem 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie 15 mL konische Rohr bei 2.100 x g für 2 min.
  4. Ca. 9 mL überstand ohne störende OP50 Pellet Aspirieren.
  5. Das Pellet in 2 mL sterilem Wasser, 1 mL der Bleichmittel und 1 mL von 0,25 M NaOH Aufschwemmen.
  6. Vorsichtig mischen durch umdrehen, bis die Mehrzahl (ca. 70 Prozent) der erwachsenen Tiere lysierten erscheinen, in der Regel Eiern bleiben während dieser kurzen Bleichmittel Behandlung wegen ihrer Schale. Das konische Rohr auf 990 X g für 2 min. Zentrifugieren
  7. Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Wieder aussetzen das Pellet in 10 mL Puffer M9.
  8. Zentrifuge das konische Rohr in 990 X g für 2 min. Aspirat überstand ohne störende Pellet. Wieder aussetzen Pellet mit 200 µL Puffer M9.
    Hinweis: Ei Vorbereitung kann mehrere Versuche erforderlich. Eiern können zerstört werden, wenn sie zu lange bleichen ausgesetzt sind. Wenn nicht schlüpfen, verringern Sie die Konzentration der Bleichmittel in Lösung oder verringern die Dauer der Exposition zu bleichen.

7. Infektion Teller Set-up

  1. 3-5 mL YPD in ein steriles Röhrchen zu verzichten und mit einer einzigen Kolonie von Candida Albicans mit einer sterilen Schleife zu impfen.
    1. Legen Sie das Rohr auf einer rotatorischen Trommel für ca. 16-18 h bei 30 ° c
  2. Label eine 1,5 mL Microfuge Röhre zu C. Albicans und anderen OP50 enthalten enthalten. Nehmen Sie das Gewicht jedes Leerrohr.
    1. Ort 500 µL der Übernachtungen C. Albicans Kultur in Rohr gekennzeichnet C. Albicans und 1.500 µL der Nacht OP50 Kultur (aus Schritt 3.1) in das Rohr mit der Bezeichnung OP50.
    2. Zentrifuge für 10 min bei 16.100 x g. Aspirat überstand ohne störende Pellet.
    3. Wieder aussetzen jedes Pellet mit 500 µL steriles Wasser. Zentrifuge für 5 min bei 16.100 x g.
    4. Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Aufnehmen das Endgewicht von Microfuge Rohren.
    5. Bestimmen das Gewicht jedes Pellet durch Subtraktion das Ausgangsgewicht der Microfuge Rohre aus der Auswaage.
  3. Mit sterilem Wasser wieder auszusetzen, C. Albicans Pellet bis 10 mg/mL und die OP50 Pellet bis 200 mg/mL. Machen Sie eine master-Infektion durch die Kombination von 10 µL einer Lösung von 50 mg/mL von Streptomycin, 2,5 µL OP50 Kultur, 0,5 µL von C. Albicans Kultur und 7 µL steriles Wasser mischen.
    1. Für Steuerplatten, einen master-Mix zu schaffen, indem die Lautstärke von C. Albicans Kultur mit sterilem Wasser. Seed 20 µL der Infektion Mix oder OP50-Control-Lösung auf die Mitte der NGM-Teller mit einer Mikropipette.
      Hinweis: Rund 100 Würmer sind erforderlich, um statistische Signifikanz bei der Analyse bestimmen. Dieser Test ist in der Regel in dreifacher Ausführung ausgeführt. Somit erfolgt eine 3,2 x Infektion Mischung sowie eine 3,2 x Kontrolllösung. Diese Mischungen sind gemacht, um etwas mehr als 3 x das Original um sicherzustellen, dass eine volle 20 µL auf jede Platte, so dass Raum für Fehler ausgesät wird. Dieses master-Mix entsteht, weil der Rachen des Wurms im ersten Larvenstadium (L1-L3), C. Albicans konsumieren zu klein ist. Für die Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen wie Fluconazol ( Abb. 3 b) wird der Agent auf die Infektion Mischung eingeführt. Die Konzentration des Agenten wird empirisch bestimmt. Zum Beispiel in Abbildung 3 b, 50 µM Fluconazol vertreten ist, jedoch 0, 12.5, 25, 50 und 100 µM Fluconazol waren auch mit dem gleichen Protokoll getestet.

8. Analyse der Analbereich verformt (Dar) Phänotyp und Survival Test

  1. visualisieren den Dar-Phänotyp
    Hinweis: Dar ist am besten visualisiert, in die L3-Stadium und darüber hinaus. Dar präsentiert sich als eine kleine Vorwölbung im Analbereich Post des Wurms ( Abbildung 2A), die im Laufe der Zeit stärker wird.
    1. Bestätigen, falls ein Tier Dar, indem man schnell die Platte auf der Bühne des Mikroskops Dissektion; Tiere ohne Dar Willen rückwärts sofort bewegen, während Tiere mit Dar entweder werden wiederholt runden klopfen, oder sie ihre Richtung umkehren wird das auch gar nicht tun.
  2. Überleben Assay
    1. komplette Ei Vorbereitung wie oben beschrieben im Protokoll Schritt 6, " Ei Vorbereitung ". Zählen Sie die Eizellen im Rahmen der Dissektion und verdünnen Sie die Ei-Lösung mit M9 zu, bis eine Konzentration von ca. 5-6 gesunden Eizellen pro Mikroliter erreicht ist. Mit einer Pipette 20 µL Probe mit ca. 30 Eiern auf vorbereiteten NGM-Teller, im Bereich zwischen der bakteriellen Kultur und der Seite der Platte zu verzichten (Eiern und Wurm Essen, OP50, sind in zwei unterschiedlichen Spots).
    2. Platten Inkubation bei 20 ° C für 48 h. Zählen Sie unter dem Mikroskop Dissektion die Anzahl der Leben und tot Erwachsene Würmer auf jeder Platte, sowie die Anzahl der Würmer mit Dar. Aufzeichnen der Prozent mit Dar.
    3. Ein Tier tot betrachten, wenn es nicht antwortet, wird auf den Kopf von einem Aluminiumdraht oder durch Tippen auf die Platte angezapft.
    4. Jeden zweiten Tag transfer restlichen Erwachsenen Würmer mit Kommissionierung, wie im Protokoll Schritt 5 beschrieben " Chunking und Kommissionierung Würmer, " auf eine neue Infektion oder Kontrolle. An dieser Stelle bei Bedarf einen Überlebens-Assay durch tracking-Nummer live, Tote und vermisste Würmer pro Tag durchführen.
      Hinweis: Dieser Test kann für zwei Wochen laufen beginnend mit Ei-Vorbereitung. Darüber hinaus sollte die Ei-Lösung auf die Bakterienkultur nicht verzichtet werden, da die Lösung kann Spuren von Bleichmittel enthalten, die die OP50 töten kann. Die Lösung sollte ca. 0,5 cm vom Rand der Platte verzichtet, wie Eiern zwischen den Seiten der Platte und der Agar geklebt werden können. Darüber hinaus aufgrund der schnellen Verbreitung von Würmern, Übertragung von Erwachsenen auf neue Teller ist entscheidend für die sie von ihren Nachkommen zu trennen.
  3. Analysieren überleben
    1. Ergebnisse mit überleben Kurve Analysesoftware zu analysieren (siehe Materialliste).
    2. Vergleichen Überleben Kurven mit der Grehan Breslow Wilcoxon-Methode (unter der Annahme, dass die Daten vom frühen Überlebenszeiten genauer als die späteren Zeiten, Gewicht die Daten entsprechend) sowie Form Statistikwerkzeugen 45.
      Hinweis: Zum Beispiel in Abbildung 4 b -C, das Überleben der Würmer mit Mutant C. Albicans behandelt ist im Vergleich zu den behandelten mit isogenen Wildtyp Steuerelemente oder Complementarystrains.

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Ergebnisse

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Eine Pathogenese-Assay (Abb. 1) mit C. Albicans und C. Elegans wurde zuvor von unserem Labor17,18 und andere Labors19,20beschrieben. Wir zeigen die Bereitschaft der Verwendung von C. Elegans , um C. Albicans Virulenz zeigen, dass C. Albicans Zellen von den Würmern schnell aufgenommen werden und reic...

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Diskussion

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Die Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Infektion und das Überleben Lebensdauer Überbelichtung zu C. Albicans , die wir beschrieben haben können geändert werden, um eine andere Erreger zu testen. Flüssige Kulturen anderer Bakterien oder Pilze können gemacht und C. Elegans in ähnlicher Weise zugeführt. Darüber hinaus können serielle Infektionen untersucht werden durch die Larve zu einem Erreger zunächst auszusetzen, wie beschrieben, und dann die Übertragung der Tiere auf eine neue Platte mi...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durchgeführt und unterstützt von Worcester Polytechnic Institute.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agar (granuliert, bakterilogische Qualität)Apex BioResearch Products20-248
Aluminiumdraht (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverses MikroskopAxiovision Zeiss
Bacto-PeptonFisher BioReagantsBP1420-500
C. elegans Stamm Bli-3Caenorhabditis Genetics CenterBli-3(e767) CB767
CalciumchloridFisher ScientificBP51-250
Cholesterin, Sigma Grade, mindestens 99SigmaC8667-25G
Einweg-Kulturröhrchen (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissektionsmikroskop (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GraphPad Prism (Software zur Analyse der Überlebenskurve)GraphPad Software
LB Bouillon (Miller's)Apex BioResearch Products11-120
MagnesiumsulfatFisher Scientific10034-99-8
Medium Petrischalen (35 x 10 mm)Falcon
Kaliumphosphat monobasischSigmaP0662-500G
NatriumchloridFisher ScientificBP358-1
NatriumphosphatFisher ScientificBP332-500
Wildtyp C. albicans SC5314ATCCSC5314
Wildtyp C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
%353001

Referenzen

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