Methodenartikel

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

DOI:

10.3791/56493

⸱

25. September 2017

 , 
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Synaptische Ströme können fokal aus visualisierten synaptischen Boutons bei der Drosophila dritte Instar Larven neuromuskulären Synapse aufgenommen werden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Tätigkeit von einem einzigen synaptische Bouton.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein ausgezeichnetes Modell, glutamatergen synaptische Übertragung zu studieren. Wir beschreiben die Technik der fokalen Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme von visualisierten Boutons bei der Drosophila Larven NMJ. Diese Technik erfordert maßgeschneiderte Herstellung von Aufnahme Mikropipetten sowie ausgestattet mit einer hohen Vergrößerung, Fernverkehr Wasser eintauchen Ziel, differential Interferenz Kontrast (DIC) Optik und eine fluoreszierende Verbindung Mikroskop Anlage. Die Aufnahme-Elektrode befindet sich auf der Oberseite eine ausgewählte synaptische Bouton visualisiert mit DIC Optik, Epi-Fluoreszenz oder beides. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es ermöglicht die Überwachung der synaptischen Aktivität von einer begrenzten Anzahl von Standorten der Veröffentlichung. Die Aufnahme-Elektrode hat einen Durchmesser von mehreren Mikrometern und die Freigabe-Websites außerhalb der Elektrode Felge beeinflussen nicht signifikant die aufgezeichneten Strömungen. Die aufgezeichneten synaptische Ströme haben schnelle Kinetik und können leicht gelöst werden. Diese Vorteile sind besonders wichtig für das Studium der mutierten Fliegenschnüre mit verstärkten spontan oder asynchronen synaptische Aktivität.

Einleitung

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Drosophila ist ein ausgezeichnetes Modell, die molekularen Mechanismen, die Kontrolle der synaptischen Übertragung zu studieren. Das neuromuskuläre System in Drosophila ist glutamatergen und die Drosophila neuromuskuläre Synapse (NMJ) kann daher verwendet werden, um die konservierten Funktionen des glutamatergen Release zu studieren. Seit Jan und Jan Studie1die dritte Instar Larven weitgehend genutzt, evozierte und spontane synaptische Übertragung durch die Überwachung der exzitatorischen Kreuzung Potentiale (EJPs) oder Strömungen (EJCs) zu studieren. EJPs werden häufig mit einem scharfen Mikro-Glaselektrode intrazellulär aufgezeichnet, und sie reflektieren die Aktivität der gesamten NMJ, einschließlich alle Boutons Synapsen bei der gegebenen Muskelfaser machen.

Im Gegensatz dazu kann die Aktivität von einer begrenzten Anzahl von Standorten der Veröffentlichung fokal durch die Positionierung eines Mikropipette Tipp in der Nähe von neuronalen Terminals oder synaptischen Krampfadern aufgezeichnet werden. Diese Technik wurde ursprünglich von Katz und Miledi2eingesetzt und fokale extrazelluläre Aufnahmen haben erfolgreich an mehreren NMJ Vorbereitungen, einschließlich Frosch3,4,5, Maus6 eingesetzte , 7 , 8, Krustentier9,10,11,12,13,14,15,16und Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Dieser Ansatz wurde von Dudel, weiterentwickelt, die Umkodierung Elektroden24,25Macropatch optimiert. Diese Technik abgestimmt Dudel Umsetzung eng locker-Patch-Clamp-Methode26.

Die Drosophila Larven NMJ hat klar definierte synaptischen Boutons und transgene Linien mit genetisch codierte neuronalen fluoreszierende Tags (siehe Tabelle der Materialien) sind leicht zugänglich. Diese Vorteile konnten wir EJCs und mEJCs aus einer ausgewählten synaptische Bouton20,21,22aufnehmen. Hier beschreiben wir diese Technik im Detail.

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Protokoll

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1. Herstellung der Aufnahme Elektroden

    1. Gebrauch der folgenden ziehen die Glaselektroden Protokoll für die Mikroelektrode Puller (siehe Tabelle der Materialien):
      1. Linie 1: Wärme 510 ziehen - Geschwindigkeit 30 mal 250; Linie 2: Erhitzen 490 Pull - Geschwindigkeit 30 mal 250.
        Hinweis: Zeiteinheiten entsprechen 0,5 ms pro Einheit; die anderen Geräte sind relativ. Der Wert der Wärme sollte für jedes Filament angepasst werden, nachdem die Rampe-Test durchgeführt wird.
    2. Mikroskop (35 X Vergrößerung) verwenden, um sicherzustellen, dass der Innendurchmesser der gezogenen Elektrode im Bereich von 7 bis 10 µm ( Abbildung 1A). Speichern Sie die Kapillaren in dicht verschlossenen Behältern, Staub zu verhindern.
  2. Polieren Feuer
    1. Fire Polnisch Kapillaren (80-90 % der maximalen Heizwert für 1-2 s) mit einer Mikro-Schmiede (siehe Tabelle der Materialien). Sicherzustellen, dass der endgültige Innendurchmesser der polierten Elektrode 5 µm ( Abbildung 1A) 27.
  3. Biegen
    Hinweis: zwei Biegungen werden vorgenommen, um die Elektrode an der Oberseite des Muskels unter einer hohen Vergrößerung Ziel zu positionieren.
    1. Verwendung der Apparat in Figur 1 b gezeigt. Korrigieren Sie die Elektrode in der Manipulator und positionieren Sie die Spitze über den Faden, nicht berühren, it.
    2. Set Erhitzen zu 60-70 % der maximalen Wert und drücken Sie das Pedal der Mikro-Schmiede für 1-2 s (siehe Tabelle der Materialien), das Filament zu heizen. Verwenden Sie eine L-förmigen Nadel vorsichtig herunterziehen der Elektrodenspitze ( Abbildung 1 b vergrößert). Die Biegemarkierung bei ca. 90 o ( Abbildung 1).
    3. Halten die Elektrode über die Flamme des Brenners von Hand mit Pinzette und machen die zweite Kurve in einem Abstand von 7-10 mm aus der ersten Kurve und in einem Winkel von ca. 120 o ( Abbildung 1).

figure-protocol-1
Abbildung 1. Letzte Schritte der Herstellung Mikropipette. (A) Elektrode Tipps nach ziehen und Feuer zu polieren. (B. 1) die Einrichtung für Spitze biegen. (B. 2) Box Bereich ist auf der rechten Seite vergrößert dargestellt. Die Elektrode und das Filament sind fixiert, so dass die Elektrodenspitze leicht über den Draht und nicht berührend ist. (C. 1) die Aufnahme-Elektrode. (C. 2) Box Bereich ist auf der rechten Seite vergrößert dargestellt. Die erste Kurve hat einen Winkel von etwa 90 Grad, und der Abstand zwischen der ersten Kurve und die Spitze der Elektrode ist ca. 1 mm. Maßstab bar = 3 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. zusätzliche vorbereitende Schritte

  1. Prepare Heamolymph erinnernden (HL3) Lösung (in mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2 10 Nahco3 3, 5 Trehalose, 115 Saccharose, 5 HEPES und 1 mM CaCl 2; Einstellung des pH-Wertes auf 7,3 - 7.4. die Lösung im Kühlschrank aufbewahren und machen es jede Woche frisch.
  2. Stimulation Mehrkanalpipette die gleiche Art und Weise wie Aufnahme Glas machen Mehrkanalpipette, außer es keine Notwendigkeit gibt, sie verbiegen.
    Hinweis: Die Vorbereitung der Stimulation Elektroden ist in 28 und 27 detailliert beschrieben. Den endgültigen Durchmesser nach Feuer polieren sollte im Bereich von 5 bis 7 µm.
  3. Insert eine Stimulation-Pipette in einer Mikroelektrode Halterung mit einer Spritze verbunden.
  4. Herstellung Dissektion Platten aus kleinen Petrischalen (35 x 10 mm) mit Silikon-Kautschuk-Epoxid beschichtet (siehe Tabelle der Materialien), wie unter 28.
    Hinweis: Silikon-Kautschuk sollte vor Gebrauch vollständig ausgehärteten.
  5. Wählen Sie einen wandernden Larven dritte Instar und sezieren, wie beschrieben in 27 , 28 , 29 , 30.
    Hinweis: Um Boutons visualisieren, verwenden die Fliege Belastung CD8-GLP (siehe Tabelle der Materialien)
    1. mit Zange (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie die 3 rd Instar Larven aus einem Fläschchen.
    2. Pin die Larven, die Platzierung des ersten Pins posterior und anderen pin anterior (Nähe Mund Haken).
    3. Lösung hinzufügen HL3.
    4. Machen Sie einen Schnitt mit Feder Schere (siehe Tabelle der Materialien) ganz aus den oberen Bolzen an der Unterseite eines an der dorsalen Seite der Larven.
    5. Pin-Larven-Filet, platzieren 2 zusätzliche Pins auf der linken und rechten Seiten der Larven.
    6. Die Eingeweide und Tracheas mit Pinzette entfernen.
    7. Die Nerven direkt vor den ventralen Nervenstrang mit Feder Schere geschnitten.

3. Elektrische Aufnahmen von EJCs

figure-protocol-2
Abbildung 2. Die Recording-Setup. Die Probe NMJ angeheftet, das Silizium beschichteten Petrischale (Pfeil) über die bewegliche Bühne des aufrechten Verbindung Mikroskops ausgestattet mit Epifluoreszenz Fähigkeiten, eine hohe Vergrößerung Objektive und zwei Mikromanipulatoren positioniert ist. Das Mikroskop ist auf eine Anti-Vibrationstisch stationiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Aufnahme
    1. Ort der Petrischale mit der Vorbereitung auf den Mikroskoptisch ( Abbildung 2). Legen Sie die Bezugselektrode in der Badewanne.
    2. Füllen Sie die Aufnahme-Elektrode mit HL3 Lösung. Unter dem Objektiv 10 X (siehe Tabelle der Materialien), die Elektrode in die Wanne Tauchen und legen Sie es über Muskeln 6 und 7 der Abdominalsegmente 2, 3 oder 4 verwenden der Mikromanipulator () (siehe Tabelle der Materialien) Abbildung 3 A. 1 und a. 2).
    3. Schalten Sie das Ziel auf 60 X (siehe Tabelle der Materialien). Konzentrieren Sie sich auf den gewünschten Bereich mit Epi-Fluoreszenz oder DIC Optik. Setzen Sie die Spitze der Elektrode auf synaptische Bouton ( Abbildung 3 b. 1-3).
    4. Drücken Sie die Elektrode sehr sanft auf den Muskel. Übermäßiger Druck kann den NMJ beschädigen oder induzieren eine Erhöhung in spontane synaptische Aktivität. Sicherstellen, dass die Spitze der Elektrode ist nicht verstopft - wenn es it. ersetzen,
    5. Schalten Sie den Verstärker, A/D-Board und dem Computer.
    6. Klemme Spannungsmodus am Verstärker wählen.
    7. Software zur Datenerfassung starten und wählen Sie die ' spaltfreie ' Modus.
    8. Das Aussehen der mEJCs auf dem Computerbildschirm zu beobachten.
    9. Stellen Sie sicher, das ist die Amplitude der mEJCs im Bereich von 0,2 - 0,7 na
      Hinweis: Kleinere EJCs anzugeben, dass die Aufnahme Elektrode Mängel hat oder es nicht richtig positioniert ist.

figure-protocol-3
Abbildung 3. Visualisierung der synaptischen Boutons. (A) A Hellfeld Bild eines Hemi-Segments unter 10 x Vergrößerung (a. 1) und den erweiterten Box Bereich zeigt Muskeln 6 und 7 (a. 2, der Pfeil markiert die Aufnahme-Elektrode). Maßstabsleiste = 50 µm. (B) synaptischen Boutons sind in eine Drosophila-Linie mit einem genetisch codierte neuronalen Marker (CD8-GFP) visualisiert mit Epi-Fluoreszenz-Bildgebung (b. 1) oder DIC Optik (b. 2). Bilder sind mit 60 x Objektive und Filter-Cube für die GFP Bildgebung genommen (siehe Tabelle der Materialien). SynaptiC Boutons sind mit Pfeilen gekennzeichnet, und eine Überlagerung von Leuchtstofflampen und DIC Bildern zeigt sich in b. 3. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Stimulation
    1. mit einem Mikromanipulator unter Sichtkontrolle, legen Sie die Stimulationselektrode in der Nähe der Axon innervieren Abdominalsegmente 2-4.
    2. Anwenden Unterdruck durch ziehen den Kolben der Spritze, Elektrodenhalter, verbunden, so dass das Axon, im Inneren der Elektrode ( Abbildung 2 gezogen wird).
    3. Schalten Sie den Stimulator. Drehen Sie den Knopf am Gerät isoliert (siehe Tabelle der Materialien) einen Null Strom festlegen und dann vorsichtig erhöhen, bis EJCs erscheinen (oder der Schwellenwert erreicht ist).
    4. Führen die Stimulation in einem überschwelligen Regime, mit dem Reizstrom ca. zweimal erhöht, im Vergleich zu den Schwellenwert für die Beobachtung der EJCs.
      Hinweis: Nach unserer Erfahrung ist solche Reizintensität optimal zur Vermeidung von Aktionspotential Ausfälle und Aktionspotential ausgelöst. Zum Beispiel, wenn EJCs erscheinen bei der Stimulation Strom von 0,2 mA, verwenden Sie einen Strom von 0,4 mA während des Experiments.
  2. Dichtung Widerstand
    1. messen Sie den Siegel-Widerstand der Aufnahme Macropatch Elektrode durch Drehen des Elektrode Widerstand Schalters des Verstärkers zu " Dichtung Test " Position. Beachten Sie, dass der Dichtung Widerstandswert in GΩ in angezeigt wird die " aktueller " Fenster.
    2. Sicherstellen, dass die Dichtung Widerstand ist im Bereich von 0,5 - 2 M Ω. Werte außerhalb dieses Bereichs zeigen, dass die Elektrode nicht richtig poliert oder nicht richtig positioniert ist.
    3. Dichtung Widerstand während der Aufnahme zu überwachen, damit es während des Experiments konstant bleibt.

4. Analyse

  1. Analyze Aufnahmen beschäftigt maßgeschneiderte Software für die Analyse (siehe Tabelle der Werkstoffe).
    Hinweis: Unser Labor verwendet eigenen Software Quantan 31, die für die Erkennung von EJCs und mEJCs fokal aufgenommen ( Abbildung 4) angepasst ist. Diese Software beinhaltet eine Gaußsche Digitalfilter und ermöglicht die Erkennung von Quanten Gipfeln in überlappenden Multi-Quanten Ereignisse ( Abb. 4A). Andere Ansätze sind beschrieben im 17.

figure-protocol-4
Abbildung 4. Quanten-Analyse. Erkennung von mEJCs (A) und (B) EJCs von Quantan Software. Das Veranstaltungsgelände ist grün markiert, und Spitzen zeichnen sich durch roten Pfeilspitzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Ergebnisse

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Fokale Macropatch Aufnahmen ermöglichen Überwachung synaptische Aktivität von ausgewählten synaptischen Boutons (Abbildung 5). Wenn die Elektrode an der Oberseite eine synaptische Bouton (Abbildung 5A, Seite 1) positioniert ist, die aufgenommenen mEJCs (Abbildung 5, Seite 1) haben eine Amplituden, die deutlich über den Geräuschpegel und scharf steigende Phasen (bei einer Sub-Millisekunden-Bereich). W...

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Diskussion

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Drosophila ist eine vorteilhafte Modellorganismus synaptische Übertragung zu studieren. Mehrere Aufnahme Konfigurationen wurden bei den Larven NMJ, einschließlich intrazelluläre Aufnahmen der synaptischen Potentiale, Aufnahmen der synaptischen Ströme mit zwei Elektroden Spannung Klemme33,34und fokale Macropatch verwendet Aufnahmen der synaptischen Ströme, die hier beschrieben. Diese Technik ermöglicht die präzise Quantifizierung der synaptischen Übertrag...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Unterstützt von der NIH Grant R01 MH 099557

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Sutter P-97Sutter InstrumentP-97Mikroelektrodenabzieher
Narishige MF-830NarishigeMF-830Microforge
WPI MF200WPIMF200Microforge
GlaskapilareWPIB150-86-10Glaskapilare
Microtorch 1WG61Grainer1WG61Microtorch
Sylgard 184 Silikon-Elastomer-KitDow CorningSYLGARD 184Silikon zur Vorbereitung von Sezierplatten
PräpariernadelnAmazonB00J5PMPJAStifte zum Positionieren von Larven
PinzetteWPIINC500342Pinzette zum Platzieren von Stecknadeln, Entfernen von Eingeweiden und Luftröhren.
SchereWPIINC501778Schere zum Schneiden der Nagelhaut der Larven und Nerven.
Olympus BX61WIOlympusBX61WIAufrechtes Mikroskop
Olympus Lumplan FL N 60xOlympusUPLFLN 60XMikroskop Objektiv 60X
Olympus UPlan FL N 10xOlympusUplanfl N 10XMikroskop Objektiv 10X
Narishige MikromanipulatorNarishigeMHW-3Dreiachsiger Wasser Hydraulischer Mikromanipulator
npi Electronic GmbH ELC-03XSnpi Electronic GmbHELC-03XSElektrophysiologischer Verstärker
A.M.P.I Master 8A.M.P.I.Master 8Elektrischer Stimulator
A.M.P.I Iso-FlexA.M.P.I.Iso-FlexStimulus-Isolator
TMC AntivibrationstischTMC63-9090Antivibrationstisch
TMC Faradayscher KäfigTMC81-333-90Faradayscher Käfig
Digidata 1322AAxon InstrumentsDigidata 1322ADigidata
ComputerDellDell Dimension 5150Computer mit Win XP OS
ElektrodenhalterWPIMEH3SWElektrodenhalter
Optischer FilterOmega optischXF 115-2Filterwürfel für die Detektion von grün fluoreszierendem Protein (GFP)
pCLAMP 8Axon Instruments8.0.0.81Software zur Signalaufzeichnung
QuantanHauseigeneSoftware-Softwarezur Signalverarbeitung
Canton-S (Wildtype)Bloomington Stock Center64349Control Fliegenschnur
cpx SH1Großzügiges Geschenk von J.T. Littleton-ComplexinKnock-out-Fliegenschnur mit erhöhter spontaner Exozytose
CD8-GFPBloomington Stock Center5137Fliegenschnur mit neuronaler Fluoreszenz (GFP) Tag

Referenzen

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Neuromuskul re Endplatte von Drosophilaberwachung von Synapsenstr menHerstellung von MikropipettenDifferenzialinterferenzkontrasthochaufl sende Optikelektrophysiologische TechnikenVisualisierung synaptischer Boutonsminiature Endplattenstr meVorbereitung der Stimulationspipette

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