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Methodenartikel

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

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DOI:

10.3791/56508

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6. Februar 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Zusammenfassung

Monoklonale Antikörper (mAbs) sind mächtige Werkzeuge nützlich für beide Grundlagenforschung und in der Biomedizin. Ihre hohe Spezifität ist unverzichtbar, wenn der Antikörper sehr ähnliche Strukturen (z.B., ein normales Protein und eine mutierte Version davon) unterscheiden muss. Der aktuelle Weg erzeugen solche diskriminierenden mAbs beinhaltet umfangreiche Screening von mehreren Ab-produzierenden B-Zellen, ist kostspielig und zeitaufwendig. Wir schlagen hier eine schnelle und kostengünstige Methode zur Erzeugung von diskriminierendem, vollständig humaner mAbs ausgehend von menschlichem Blut zirkulierenden B-Lymphozyten. Die Originalität dieser Strategie ist durch die Auswahl der spezifischen Antigen Bindung B Zellen kombiniert mit dem Counter Auswahl aller anderen Zellen, mit leicht verfügbaren peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC). Sobald bestimmte B-Zellen isoliert sind, stammen cDNA (ergänzende Desoxyribonukleinsäure) Sequenzen Codierung für die entsprechenden mAb Einzelzelle Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und anschließend ausgedrückt in der Human- Zellen. Innerhalb von weniger als 1 Monat ist es möglich, Milligramm hochgradig diskriminierend menschlichen mAbs gegen nahezu jede gewünschte Antigen natürlich erkannt durch die B-Zell-Repertoires zu produzieren.

Einleitung

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die schnelle und vielseitige Produktion vollständig humaner monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen eine gewünschte Antigen (Ag). mAbs sind unverzichtbare Werkzeuge in vielen Grundlagenforschung Anwendungen in Vitro und in Vivo: flow Cytometry, Histologie, Western-Blot und blockierende Experimente zum Beispiel. Darüber hinaus werden mAbs mehr und mehr in der Medizin zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Transplantation Ablehnung1Steuern eingesetzt. Anti-CTLA-4 und Anti-PD-1 (oder Anti-PD-L1) mAbs dienten zum Beispiel kürzlich als immun Checkpoint-Hemmern bei Krebs-Behandlungen2.

Der erste mAbs stammen von Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Hybridome aus der Milz Zellen der immunisierten Mäusen oder Ratten gewonnen. Allerdings behindert die starke Immunantwort gegen Murine oder Ratte mAbs ihre therapeutische Anwendung beim Menschen, durch ihre schnelle Abfertigung und die wahrscheinlich Induktion von Überempfindlichkeit Reaktionen3. Um dieses Problem anzugehen, haben teilweise tierisches Eiweiß-Sequenzen von mAbs menschlich, so genannte Chimäre Maus-Mensch oder humanisierte Antikörper erzeugen abgelöst. Diese Strategie verringert sich jedoch nur teilweise Immunogenität, während deutlich erhöht, die Kosten und die Zeit-Skala der Produktion. Eine bessere Lösung besteht darin, menschliche mAbs direkt aus humanen B-Zellen zu generieren und mehrere Strategien hierfür zur Verfügung. Eine davon ist die Verwendung von Phagen oder Hefe Display. Dies umfasst Anzeigen Variable Domänen aus einer kombinatorischen Bibliothek von zufälligen menschlichen Ig schwere und Licht Ketten auf Phagen oder Hefen und Durchführung einer Auswahlschritt mit den spezifischen Antigen des Interesses. Ein großer Nachteil dieser Strategie ist, dass schwere und leichte Kette nach dem Zufallsprinzip verbunden, was zu einer sehr großen Zunahme in der Vielfalt der erzeugten Antikörper sind. Antikörper, die erhalten sind voraussichtlich nicht denen entsprechen, die durch eine natürliche Immunantwort gegen ein bestimmtes Ag entstehen würde. Darüber hinaus sind menschliche Protein-Falte und post-translationalen Modifikationen nicht systematisch in Prokaryoten oder sogar in Hefen reproduziert. Eine zweite menschliche mAb-Produktions-Methode ist die Verewigung der natürlichen menschlichen B-Zellen durch Epstein - Barr-Virus-Infektion oder Ausdruck der Anti-apoptotische Faktoren BCL-6 und BCL-XL4. Allerdings ist diese Methode gilt nur für B-Gedächtniszellen und ist ineffizient, dass Screening von zahlreichen mAb-produzierenden verewigt B-Zellen, die nur wenige (wenn überhaupt) mAb-Klone mit der gewünschten Antigen-Spezifität zu identifizieren. Die Methode ist so teuer und zeitaufwändig.

Vor kurzem wurde ein neues Protokoll für die Produktion von menschlichen mAbs von isolierten einzelnen B Zellen5beschrieben. Es stützt sich auf eine optimierte einzellige Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Verstärkung der beiden die Heavy - und Lichterkette Codierung Segmente aus einer einzigen sortierten B-Zelle. Darauf folgt das Klonieren und die Expression dieser Segmente in einer eukaryotischen Expressionssystems, wodurch Wiederaufbau vollständig humaner MAB. Dieses Protokoll wurde erfolgreich ausgehend von B-Zellen von geimpften Spendern verwendet. Zellen wurden mehrere Wochen nach der Impfung zu höhere Frequenzen der B-Zellen gerichtet gegen die gewünschte Ag erhalten, und den Zeitaufwand für das screening von6geerntet. Anderen vollständig humaner mAbs wurden auch von+ (Human Immunodeficiency Virus) HIV-infizierten Patienten7 und Melanom Patienten8produziert. Trotz dieser Fortschritte gibt es noch keine Verfahren zur Verfügung, die die Isolation der Ag-spezifische B-Zellen unabhängig von ihrer Erinnerung Phänotyp oder Frequenz ermöglicht.

Hier beschriebenen Verfahrens führt zu effizienten ex Vivo Isolation der menschlichen zirkulierenden B-Zellen basierend auf ihre BCR Spezifität, gefolgt von der Produktion von vollständig humaner antigenspezifischen mAbs in hoher Ausbeute und mit einer niedrigen Screening-Zeit. Die Methode ist nicht zu B-Gedächtniszellen oder Antikörper-sezernierenden B-Zellen nach einer Immunantwort induziert beschränkt, sondern kann auch auf das menschliche naive B-Zelle Repertoire angewendet werden. Es funktioniert sogar ab Ag-spezifische B-Zellen bei sehr tiefen Frequenzen ist ein guter Indikator für die Effizienz. Das Prinzip der Methode ist wie folgt: periphere Blut mononukleären Zellen (PBMC) sind mit zwei Tetramers präsentiert das Antigen des Interesses befleckt, jeder gekennzeichnet mit einem unterschiedlichen Fluorochrom (z. B.Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC)), und eine dritte Tetramer präsentiert eine eng verwandte Antigen konjugiert mit einem dritten Fluorochrom (z. B.Brillant violett 421 (BV421)). Um für Antigen-bindenen Zellen anzureichern, Zellen werden dann mit Perlen mit Anti-PE beschichtet inkubiert und Anti-APC Abs, und in Zelle Trennung Spalten sortiert. Die APC PE+ + Zelle Bruchteil ausgewählt ist, gebeizt mit einer Vielzahl von mAbs spezifisch für verschiedene PBMC Zelltypen zur Identifizierung von B-Zellen und unterworfenen Zytometrie Zellsortierung fließen. B-Zellen sind PE+ und APC+, aber brillant violett-, sind isoliert. Dieser Schritt wählt gegen Zellen, die nicht B-Zellen oder binden Sie nicht an die tetramerized Antigen, sondern binden PE oder APC (diese Zellen werden PE+ APC– oder PE– APC+) oder zum Teil nicht-Antigen der Tetramers verwendet (diese Zellen werden BV421+). B-Zellen nicht hochspezifisch für das Epitop von Interesse sind auch Counter bei diesem Schritt ausgewählt (diese Zellen werden auch BV421+). Somit kann diese Methode hochspezifische B-Zellen, B-Zell-Rezeptoren (BCR) in der Lage ist zu unterscheiden zwischen zwei eng verwandte Antigene ausdrücken reinigen. Einzelne spezifische B-Zellen sind in Tuben gesammelt und ihre PCR verstärkt Ig cDNAs (ergänzende Deoxyribonucleic Säuren) geklont und durch eine menschliche Zelllinie als sekretierten IgG mAbs ausgedrückt.

Diese Studie beschreibt, wie ein Proof of Concept, die effiziente Erzeugung von menschlichen mAbs, die erkennen, eine Peptid mit einem großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül und kann unterscheiden dieses Peptid und anderen Peptiden beladen auf dem gleichen MHC-ich Allel. Obwohl der Grad der Komplexität dieser AG wichtig ist, können mit dieser Methode (i) high-Yield-Rückgewinnung von Ag-spezifische mAbs; (Ii) Produktion von mAbs in der Lage, zwischen zwei strukturell enger Ags zu unterscheiden. Dieser Ansatz zu geimpften oder infizierten Patienten ohne jegliche Änderung Protokoll erweitert werden und hat auch bereits in einem humanisierten Ratte System9erfolgreich umgesetzt. Diese Studie beschreibt also, eine vielseitige und effiziente Vorgehensweise um vollständig humaner mAbs, die verwendet werden können in Grundlagenforschung und Immuntherapie zu generieren.

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Protokoll

Alle menschlichen peripheren Blutproben stammen von anonymen Erwachsenen Spendern nach Einwilligung gemäß der lokalen Ethikkommission (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, Verfahren Les NTS-2016-08).

1. Isolierung der menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen

Hinweis: Ausgangsmaterial kann insgesamt menschlichen peripheren Blut oder Cytapheresis Proben sein. Proben sollten nicht älter als 8 h sein und mit Antikoagulantien (z.B. Heparin) ergänzt.

  1. Verdünnen Sie Blut mit 2 Bände (menschlichen peripheren Blut) oder 5 Bände (Cytapheresis Beispiel) von RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium.
  2. Sorgfältig Schicht 35 mL verdünnter Zellsuspension auf 15 mL Dichte Gradienten Medium in einem 50 mL konische Röhrchen. Machen Sie so viele Rohre wie nötig, um das verdünnte Blut verteilen. Zentrifugieren Sie bei 1.290 x g für 25 min bei Raumtemperatur in ein Schwingen-Eimer-Rotor mit Bremse ab.
  3. Vorsichtig aspirieren Sie der mononukleären Zellschicht an der Schnittstelle zwischen dem Dichte-Gradienten-Medium und der Plasmaschicht und übertragen Sie die Zellen auf ein neues 50 mL konische Rohr.
  4. Füllen Sie das Rohr mit RPMI Medium, mischen und Zentrifugieren bei 1.290 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den überstand.
  5. Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL RPMI Medium und Zentrifuge bei 200 X g für 10 min um die Thrombozyten zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in RPMI Medium mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS).
    Hinweis: Gehen Sie direkt zu Tetramer zu beschriften oder zu halten Sie Zellen bei 4 ° C über Nacht in einer Konzentration von 107 Zellen/mL.

2. Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung von Ag-spezifische B-Zellen

  1. Ag-Tetramers vorbereiten, indem man entweder PE oder APC-Label Premium Grade Streptavidin oder BV421-mit der Bezeichnung Streptavidin in einem Molverhältnis von 1:4 bis biotinylierte Antigen Monomere. Fügen Sie die entsprechende Menge an Streptavidin-Konjugat in drei getrennte Teile, Hinzufügen einer aliquoten alle 10 min bei Raumtemperatur.
  2. Zellen (bis zu 3 x 108 pro Röhre) in 15 mL konische Röhrchen zu verteilen und bei 460 X g für 5 min zentrifugieren.
    Hinweis: Das folgende Protokoll ist für eine Röhre.
  3. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) mit 2 % FBS. Hinzufügen von PE, APC und BV421 konjugiert Tetramers, jeweils um eine Endkonzentration von 10 µg/mL. Gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Bereiten Sie eiskalte Zelle Trennung Puffer (SB) mit PBS mit 0,5 % BSA (Bovine Serum Albumin) und EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Säure) 2 mM.
  5. 10 mL GBL Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 460 X g für 5 min zugeben.
  6. Zellen in 500 µL eiskalte SB hinzufügen 50 µL Anti-PE und 50 µL Anti-APC magnetische Microbeads aufzuwirbeln.
  7. Gut mischen und 20 min bei 4 ° c inkubieren
  8. Wiederholen Sie Schritt 2.5 zweimal.
  9. Den Überstand sorgfältig beseitigen Andresuspend Zelle Pellet in einer Konzentration von 2 x 108 Zellen/mL in Eis kalt SB.
  10. Equilibrate eine große magnetische Spalte auf einen Magneten mit 3 mL SB positioniert.
  11. Übertragen Sie Zellsuspension von 2,9 auf den oberen Teil der äquilibriert Spalte und lassen Sie ihn vollständig zu entleeren. WICHTIGER Schritt: Zur Vermeidung von Verklumpung der Spalte durchlaufen Sie Zellen eine 70 µm-Nylon-Netzgewebe.
  12. Spülen Sie das Rohr enthielt die Zellen mit 3 mL Eis kalt SB und übertragen Sie den Puffer direkt auf die Spalte (bei Filtration, spülen die 70 µm Nylon-Mesh) zu.
  13. Wenn der Puffer in der Spalte vollständig entleert hat, ein weiteres 3 mL Eis kalt SB hinzufügen der Spalte.
  14. Wiederholen Sie Schritt 2.13 für ein anderes 3 mL waschen.
  15. Entfernen Sie die Spalte aus der Magnet und über eine 15 mL konische Sammelrohr.
  16. Fügen Sie 5 mL Eis kalt SB auf der Oberseite der Spalte hinzu und sofort spülen Sie die Zellen aus der Spalte mit den Kolben. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  17. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen (angereicherte relevanten Tetramer positive Zelle Bruch) bei 460 X g für 5 min und fahren Sie mit zusätzlichen Antikörper Färbung.
    Hinweis: Pool gesammelt Zellen aus allen Rohren, falls zutreffend.

3. Färbung des Ag-spezifischen menschlichen B-Zellen und Zellsortierung

  1. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit einem Cocktail aus Anti-Human-Antikörper gegen CD3 (Endverdünnung: 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50), und 7AAD (1: 1000) in einem Endvolumen von 100 µL PBS mit 2 % FBS. 30 min bei 4 ° c inkubieren
  2. Zellen, Zentrifuge bei 460 X g für 5 min, 10 mL PBS hinzu und beseitigen Sie den Überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS, Filter auf 70 µm-Nylon-Netzgewebe.
  3. Fahren Sie mit bestimmte B-Zellen auf der Ebene der einzelnen Zelle auf eine Zelle Sorter Cytometer 100 µm-Düse mit einem Druck von 20 Psi zu sortieren, ohne mehr als 1.000 Veranstaltungen/s9.
    Hinweis: Gating Strategie verwendet, ist in Abbildung 1. dargestellt. Zellen wurden zuerst auf CD14 gated–CD16–7AAD– -Zellen, Monozyten, NK und abgestorbenen Zellen (nicht in Abbildung 1dargestellt) auszuschließen. Dann CD19+ B Zellen vor Anspritzung auf doppelte gefärbten Zellen von PE und APC relevanten Ag-Tetramers ausgewählt wurden. Nicht-spezifische B-Zellen wurden durch Anspritzung auf BV421 negative Zellen (unbefleckt von irrelevanten Ag-Tetramer) ausgeschlossen.
  4. Sammeln Sie einzelne B-Zellen in 8 Streifen PCR Schläuche zuvor gefüllt mit 10 µL 1 X PBS und 10 Einheiten von RNAse-Inhibitor und platziert auf einem Gestell für 96 Mikroröhrchen. Sofort frieren Sie die PCR-Röhrchen bei-80 ° C ein.
    Hinweis: Die Art Masken auf dem Cytometer Instrument gewählt sind Ertrag Maske: 0, Reinheit Maske: 32 und Phase Maske: 0. einzellige Kaution könnte eine 96 oder 384-Well-PCR-Platte angepasst werden, wenn nötig. Einzelne B-Zellen müssen so schnell wie möglich eingefroren werden und können bei-80 ° C für mehrere Wochen gelassen werden, wenn nötig.

4. einzelne Zelle RT-PCR

  1. Lösen Sie Zellen durch direkt erhitzen die gefrorenen Proben in PCR-Streifen bei 70 ° C für 5 min in ein Trockenbad.
  2. Übertragen Sie Streifen um Eis und fahren mit reverse Transkription (RT) durch Zugabe von 10 µL pro Röhre eines 2 x master-Mix-Puffer mit 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) Primer 5 µM zufällige Hexamers, 20 Einheiten der RNAse-Inhibitor und 400 Einheiten der reversen Transkriptase.
    Hinweis: Nach dem Auftauen Zelle muss RT schnell durchgeführt, um RNA-Abbau zu vermeiden.
  3. Inkubation bei 25 ° C für 5 min um zufällige Hexamers zu hybridisieren, dann 1 h bei 50 ° C inkubieren und enden mit einer Inkubation bei 95 ° C für 3 min um die Reaktion zu stoppen zu ermöglichen.
  4. Fahren Sie mit zwei Runden der verschachtelten PCR Verstärkung für jede der Regionen Codierung für Variable schwere (vH) und Kappa (vLκ) oder Lambda-Leichtketten (vLλ).
    Hinweis: Alternativ RT Proben können bei-20 ° C eingefroren und gehalten werden für eine Woche.
    1. Für die erste Runde der PCR hinzufügen 3 µL cDNA für eine 40 µL Endvolumen mit 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase und 200 nM von äußeren Primern (siehe Abbildung 2 und Tabelle der Materialien für Primer-Sequenzen).
      Hinweis: Zusammensetzung der äußeren Primern Mischung. Für die Verstärkung der schweren Kette: 4 vorwärts Primer (5' LVH Mix) und 2 reverse Primer (3' CµCγ Mix). Für leichte Kappa Kette Verstärkung, 3 vorwärts Primer (5' LV | mischen) und 1 Rückwärtsgang Grundierung (3' Cκ543-566). Für leichte Lambda-Kette Verstärkung 7 forward Primer (5' LVl Mischung) und 1 Rückwärtsgang Grundierung (3' Cl).
      Hinweis: Tiller Et Al. zur Verstärkung von allen schweren und leichten Kette Familie Gene5wurden Grundierungen entworfen.
    2. Gelten die folgenden Bedingungen wie Radsport: 94 ° C für 4 min, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 58 ° C VH und VLκ (60 ° C für VLλ) und 55 s bei 72 ° C, mit einer endgültigen Dehnung Schritt bei 72 ° C für 7 Minuten.
    3. Verwenden Sie für die zweite Runde PCR 3 µL das erste Amplifikationsprodukt für einem Endvolumen von 40 µL mit 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase und 200 nM inneren Zündkapseln mit Restriktionsenzym Standorten für das Klonen in Ausdruck Vektoren (siehe Abbildung 2 und Tabelle der Materialien für Primer-Sequenzen).
      Hinweis: Zusammensetzung des inneren Primer-Mix. Für schwere Kette Verstärkung: 9 vorwärts Primer (5' AgeIVH-Mix) und 3 reverse Primer (3' SalIJH Mix). Für leichte Kappa Kette Verstärkung, 9 vorwärts Primer (5' AgeIV | mischen) und 3 reverse Primer (3' BsiWIJκ Mix). Für leichte Lambda-Kette Verstärkung 6 forward Primer (5' AgeIVl Mischung) und 1 Rückwärtsgang Grundierung (3' XhoICl).
      Hinweis: Tiller Et Al., zur Verstärkung aller von der schweren und leichten Kette Familie Gene5wurden Grundierungen entworfen.
    4. Gelten die folgenden Bedingungen wie Radsport: 94 ° C für 4 min, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94° C, 30 s bei 58 ° C VH und LCκ (60 ° C für LCλ) und 45 s bei 72 ° C mit einer endgültigen Dehnung Schritt bei 72 ° C für 7 Minuten.
  5. Identifizieren Sie positive Vertiefungen durch Migration von 5 μl des PCR-Produkte von vH, vLκ und vLλ auf einem 1,5 % Agarosegel (500 bp Produkte für Variable schwere Codierung Kettensegmente) und ein 350 bp-Produkt für Variable Lichterkette Codierung Segmente.
  6. Reinigen Sie die restlichen 35 µL PCR-Produkte aus positiven Vertiefungen mit Ultrafiltration Membranen für die Reinigung der PCR Produkte entwickelt.
  7. Eluieren Sie PCR-Produkte mit 60 µL H2O.

(5) Ausdruck Klonen

  1. Vorbereiten der Einsätze
    Hinweis: Verdauen 60 µL jeder gereinigten PCR Produkt in einem Endvolumen von 100 µL, enthält des entsprechende Restriktionsenzym Puffers.
    1. Für vH-PCR-Produkte 50 Einheiten von AgeI und 50 Einheiten von SalI und 1 h bei 37 ° c inkubieren
    2. Für vLλ-PCR-Produkte 50 Einheiten von AgeI und 50 Einheiten von XhoI und 1 h bei 37 ° c inkubieren
    3. VLκ-PCR-Produkte fügen Sie 50 Einheiten von AgeI und 1 h bei 37 ° c inkubieren Reinigen mit 96 PCR Membranen verdaut und eluieren mit 60 µL H2O. Digest 60 µL Eluat in einem Endvolumen von 100 µL der BsiWI Restriktionsenzym Puffer, 50 Einheiten von BsiWI und 1 h bei 55 ° c inkubieren
    4. Deaktivieren Sie die Enzyme durch Erhitzen auf 80 ° C für 15 Minuten.
  2. Vorbereitung des Ausdrückens Vektoren
    Hinweis: vH-PCR-Produkte werden in einem Ausdruck Vektor (HCγ1), enthält die ständige schwere Kette Cγ1 IgG1 geklont. vLκ-PCR-Produkte werden in einem Ausdruck Vektor (LCκ), enthält die ständige leichte Kette Cκ geklont. vLλ-PCR-Produkte werden in einem Ausdruck Vektor (LCλ), enthält die ständige leichte Kette Cλ geklont.
    1. Führen Sie die folgenden Verdauung:
      1. Mix 1 µg der Ausdruck Vektor-HCγ1 mit 10 Einheiten von AgeI und 10 Einheiten von SalI jedoch in einem Gesamtvolumen von 20 µL Einschränkung Puffer vom Hersteller empfohlenen und 1 h bei 37 ° c inkubieren
      2. Mix 1 µg der Expressionsvektor LCκ mit 10 Einheiten von AgeI Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 20 µL Einschränkung Puffer vom Hersteller empfohlenen und 1 h bei 37° c inkubieren Fügen Sie 10 Einheiten des BsiWI Restriktionsenzym, und 1 h bei 55 ° c inkubieren
      3. Mix 1 µg der Expressionsvektor LCλ mit 10 Einheiten von AgeI und 10 Einheiten von XhoI jedoch in einem Gesamtvolumen von 20 µL Einschränkung Puffer vom Hersteller empfohlenen und 1 h bei 37 ° C inkubieren
    2. Erhitzen Sie die Mischung jedes Verdauung bei 65 ° C für 10 min, die Beschränkung-Enzyme zu inaktivieren.
    3. Unterbindung von 5 µL der verdauten PCR-Produkt mit 2 µL durchführen (100 ng) der entsprechenden linearisierten Expressionsvektor in einem Gesamtvolumen von 20 µL 1 x DNA Ligase Puffer mit 1 Einheit des T4 DNA-Ligase durch Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
      Hinweis: Alternativ Ligatur für 3 h bei 4 ° c erfolgt
  3. Klonen
    1. Electroporate 1 µL 20 µL Ligatur Mischung in 45 µL hausgemachte Electrocompetent TOP10 E. Coli (Current Protocols in der Molekularbiologie, Abschnitt 1.8.4-1.8.8). Sofort 500 µL 2 X YT Medium hinzufügen und Ausbreitung verwandelt Bakterien auf 2 x YT Ampicillin Platten in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. inkubieren. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    2. Für jede Transformation Bildschirm acht Kolonien durch PCR.
      1. Eine Vormischung Reaktion auf Eis wie folgt eingerichtet: 45 µL 5 x PCR-Puffer, 12 µL MgCl2 (25 mM), 4 µL von dNTPs (ab ein Lager mit 10 mM von jedem), 10 µL vorwärts Grundierung (Lager 10 µM) Hybridisierung der Vektor-Sequenz (Primer Ab-Vec-Sense) , und 10 µL des rückwärts-Primer (Lager 10 µM) die ständige schwere oder leichte Kette Region (siehe Tabelle der Materialien für Primer-Sequenzen). Make-up zu einem Endvolumen von 200 µL mit H2O. Dann fügen Sie 4 µL des Enzyms DNA-Polymerase (5 U/µL).
      2. Verteilen Sie 25 µL Reaktion Premix pro 8-Streifen PCR-Röhrchen auf dem Eis.
      3. Benutzen Sie einen sterilen Zahnstocher zu einzelnen Kolonien holen. Streifen Sie den Zahnstocher auf einen 2 X TY Ampicillin Teller bilden eine Replicate Platte und Tauchen Sie es in einer PCR-Reaktion-Röhre.
      4. Führen Sie das Screening PCR unter den folgenden Bedingungen Radsport: 94 ° C für 10 min, gefolgt von 25 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 55 ° C und 50 s bei 72 ° C.
      5. Identifizieren Sie positive Bakterien durch Migration von 5 µL des PCR-Produkte auf einem 1,5 % Agarosegel.
        Hinweis: Positive Kolonien ein PCR-Produkt geben rund 850 bp für die schwere Kette Vektor und 600 bp für die Lichterkette Vektor.
    3. Vier positive Kolonien von der replizieren Platte in 2 mL LB-Medium zu impfen und über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min inkubieren.
    4. Extrahieren Sie Plasmide aus flüssigen Kulturen mit einem Plasmid-Reinigung-Kit, wie vom Hersteller angegeben.
    5. Überprüfen Sie die korrekte Einfügen von Variablen Domänen von Sanger Sequenzierung der Plasmide mit Ab-Vec-Sense Primer.
      Hinweis: Plasmide mit dem richtigen Einsatz (Codierung der HC und die entsprechenden LC) sollen cotransfected in 293A Zellen für Sekretion. Die Besonderheit des kleinen Maßstab produziert mAbs ist durch ELISA untersucht. Anschließend wird die Produktion in großem Maßstab ggf. durchgeführt.

6. Herstellung von mAbs

  1. Kleinserienfertigung für die Überprüfung der Spezifität
    1. Am Vortag die Transfektion, Samen 15.000 menschlichen embryonalen Niere 293A (HEK 293A) Zellen in 200 µL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS pro Bohrloch in 96-Well Platten. Über Nacht in eine CO2 Inkubator (5 % CO2) bei 37 ° c inkubieren
    2. Cotransfect 293A Zellen in DMEM Medium mit 10 % FBS mit einem linear Polyethylenimine-Derivat als Transfection Reagens.
      Hinweis: Führen Sie die Transfektion in Triplicates. Das folgende Protokoll ist für einen Brunnen von einem Flachboden-96-Well-Platte.
      1. Verdünnen Sie 0,5 µL DNA Transfection Reagens in 10 µL 150 mm NaCl. 0,125 µg vH und 0,125 µg vL mit dem Ausdruck ihrer Vektoren in 10 µL 150 mm NaCl zu verdünnen. Vortex jeder Verdünnung für 10 s.
      2. Fügen Sie 10 µL DNA Transfection Reagens in 10 µL DNA-Lösung verdünnt. S Wirbel 15 und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinzufügen der 20 µL Mischung tropfenweise 293A Zellen, und durch die Platte vorsichtig umschwenken mischen.
    3. Ersetzen Sie die mittlere 16 h nach Transfektion und Zellkulturen für 5 Tage in serumfreien Medium.
      Hinweis: Verwenden Sie serumfreien Medium Serum Igs verunreinigen die produzierten Antikörper zu vermeiden.
    4. Beseitigen Sie Zellen und Schmutz durch Zentrifugation bei 460 X g für 5 min.
    5. Überstände durch Absaugen mit einem Multi-Kanal-Pipette zu ernten und in einem V-Boden-96-Well-Platte übertragen.
    6. Mantel relevanten Ag über Nacht bei 4 ° C in 100 µL pro Bohrloch rekonstituierte ELISA/ELISPOT Beschichtung Puffer 1 X auf eine Endkonzentration von 2 µg/mL in 96-Well-ELISA-Platten. Siehe Beispiele in 9.
    7. Block-Brunnen mit 10 % FBS DMEM Medium für 2 h bei 37 ° C
    8. Fügen Sie 50 µL Überstände 293A transfizierten Zellen aus Schritt 6.1.5 und 2 h bei RT inkubieren
    9. Fügen Sie 100 µL eines Anti-Menschen, die IgG Ab konjugiert mit Meerrettich Peroxidase (HRP) Enzym bei 1 µg/mL und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 50 µL chromogenen Substrat (TMB) und 20 min inkubieren.
    10. Lesen der optischen Dichte bei 450 nm auf einem Spektrophotometer.
      Hinweis: Die spezifischen mAbs durch ELISA-Test enthüllt weiter in großem Maßstab hergestellt werden können und gereinigtes Protein eine Spalte präsentiert Affinität für menschliche IgG.
  2. Produktion in großem Maßstab und Reinigung von bestimmten mAbs
    1. Am Vortag die Transfektion, Samen 6 x 106 menschlichen embryonalen Niere 293A (HEK 293A) Zellen in 175 cm2 Fläschchen mit 25 mL DMEM mit 10 % ergänzt FBS. Über Nacht in eine CO2 Inkubator (5 % CO2) bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Zellen sollte 70 % Zusammenfluss bei transfiziert.
    2. Cotransfect 293A Zellen in DMEM Medium mit 10 % FBS mit einem linear Polyethylenimine-Derivat als Transfection Reagens.
      1. Verdünnen Sie 50 µL DNA Transfection Reagens in 450 µL 150 mm NaCl. 10 µg vH und 10 µg vL mit dem Ausdruck ihrer Vektoren in 500 µL 150 mm NaCl zu verdünnen. Vortex 10 s jeder Verdünnung.
      2. Die DNA-Lösung verdünnt DNA Transfection Reagens hinzufügen. S Wirbel 15 und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 1 mL Mischung tropfenweise auf die Zellen, und durch den Kolben vorsichtig umschwenken mischen.
    3. Ersetzen Sie die mittlere 16 h nach Transfektion und Zellkulturen für 5 Tage in serumfreien Medium.
    4. Ernten Sie Medium durch Absaugen mit einer 25-mL-Pipette.
    5. Beseitigen Sie Zellen und Schmutz durch Zentrifugation bei 460 X g für 5 min.
    6. Reinigen Sie die Antikörper mit einer 1 mL-Spalte mit Protein A auf einem schnellen Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System bei 4 ° c beschichtet
      1. Equilibrate das Protein eine Sepharose-Säule mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7).
      2. Filtern Sie das Zellkulturmedium von 6.2.5 mit 1,22 µm Filter, dann einen 0,45 µm-Filter.
      3. Laden Sie die gefilterten Medium auf die Säule.
      4. Waschen mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7) und eluieren mit einem 0,1 M Citrat-Puffer (pH 3,5).
      5. Lesen der optischen Dichte bei 280 nm auf eine Absorption Spektrofotometer und sofort neutralisieren proteinhaltigen Fraktionen mit 1 M Tris-Puffer (pH 9).
    7. Dialyse gereinigten Ab über Nacht bei 4 ° C in einer Kassette mit einem Molekulargewicht von 3,5 K cutoff gegen PBS-Puffer (pH 7,4).
    8. Sterilisieren von 0,2 µm Filtrierung und Kontrolle Reinheit von Größe-Ausschluss-Chromatographie, wie vom Hersteller angegeben.

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Ergebnisse

Ausgehend von PBMC von gesunden Spendern dieses Projekt stellt die Erzeugung von menschlichen mAbs, die das Peptid Pp65495 erkennen (Pp65, von menschlichen Zytomegalievirus) durch die großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül HLA - A * 0201 () HLA-A2). Diese mAbs können zwischen diesem Komplex und aus anderen Peptiden verladen der gleichen MHC-komplexe unterscheiden-ich Molekül.

PBM...

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Diskussion

Das vorgeschlagene Protokoll ist eine leistungsfähige Methode für die Erzeugung von menschlichen mAbs direkt vom Ag-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden. Es vereint drei wichtige Aspekte: (i) die Verwendung von ein Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung, wodurch eine ex-Vivo -Isolierung auch seltene Ag-Bindung B-Zellen; (Ii) eine gating Strategie, die drei Ag-Tetramers (zwei relevante und irrelevante eins) beschriftet mit drei verschiedenen Fluorochromes verwendet, um durch Durchflusszytometrie, nu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken der Zytometrie Anlage "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für kompetente technische Unterstützung. Wir danken auch das gesamte Personal der Produktion rekombinanter Proteine (P2R) und der Auswirkungen Plattformen (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für ihre technische Unterstützung. Wir danken Emmanuel Scotet und Richard Breathnach für konstruktive Kritik am Manuskript. Diese Arbeit wurde von der IHU-Cesti-Projekt gefördert durch die «Investissements Avenir» französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005) finanziell unterstützt. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Métropole und Région Pays De La Loire unterstützt. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Programms LabEX IGO unterstützt vom nationalen Institut über die Investition des zukünftigen Programms ANR-11-LABX-0016-01 realisiert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HEK 293A ZelllinieThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco von life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Natriumpyruvat
(-) L-Glutmine
RPMI Medium1640 (1X)Gibco von life technologies31870-025
Rinderserumalbumin (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 0,5M pH=8Invitrogen von Life Technologies15575-020
Fötales Rinderserum (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - Trennung von Lymphozyten mittelEuroBioCMSMSL01-01Dichte 1,0777+/-0,001
Streptavidin R-Phycoerythrin KonjugatInvitrogen von Life TechnologiesS21388Premium-Qualität 1mg/ml enthält 5 mM Natriumazid
Streptavidin, Allophycocyanin-KonjugatInvitrogen von thermoFisher scientificS323621 mg/ml
2 mM Azid Premium-Brillantviolett
421 StreptavidinBiolegend405225Konz : 0,5mg/ml
Anti-PE konjugierte magnetische MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-801
Anti-APC konjugierte magnetische MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs oder QuadroMACS SeparotorMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
LS SäulenMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Gebrauchte Verdünnung 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Gebrauchte Verdünnung 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Gebrauchte Verdünnung 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Gebrauchte Verdünnung 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Verwendete Verdünnung 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter ZytometerBD Biosciences
8-Streifen PCR RöhrchenAxygen321-10-061
Racks für 96 MikroröhrchenDominique Dutscher45476
RNAseOUT Ribonuklease-Inhibitor (rekombinant)Invitrogen von thermoFisher scientific10777-019Menge:5000U (40U/ul)
Destilliertes Wasser Dnase/RNASE-freiGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Zufällige HexamereInvitrogen von thermoFisher scientificN8080127Menge: 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse TranskriptaseInvitrogen von thermoFisher scientific18080-044Menge : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA-PolymerasePromegaM7805
dNTP Set, MolekularbiologieThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von Schwerketten - Äußere Primer - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		Erste PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		Erste Runde der PCR - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Reverse Primer für humanes Ig - Bakterien PCR-Screening
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		Erste Runde der PCR - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Reverse Primer für humanes Ig
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer -Forward Primer
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärts-Primer
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
Zweite		PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGAGGGTGACCGTG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer -Vorwärtsprimer
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Äußere Primer - Vorwärtsprimer
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTCTG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer -Vorwärtsprimer
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer - Reverse Primer - Bakterien-PCR-Screening
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT Zweite		PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer -Vorwärtsprimer
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer -Vorwärtsprimer
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
Zweite		PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTGTTGACCAGTCT		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärts-Primer
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Forward Primer
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTC Zweite		Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Forward Primers
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		Erste Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten λ - Äußere Primer -Forward Primer
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten λ - Äußere Primer -Forward Primer
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer - Forward Primer
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Forward Primer
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Forward Primer
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten λ - Innere Primer - Forward Primer
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten λ - Innere Primer - Forward Primer
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Vorwärtsprimer
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Vorwärtsprimer
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Reverse Primer - Bakterien-PCR-Screening
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Bakterien-PCR-Screening
QA Agarose-TM, Molekularbiologie MPBio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR-PlatteMacherey Nagel743.100.100
Enzym Alter I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzym SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzym Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzym BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (Genbank-Zugangsnummer FJ475055)
LCk (Genbank-Zugangsnummer FJ475056 )
LCl (Genbank-Beitritt Anzahl FJ517647)
T4 DNA-LigaseInvitrogen von thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT mediumSigma AldrichY1003-500ML
AmpicillinSigma Aldrich10835242001
LB (Luria Bertani) Bouillon (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nukleospin Plasmid DNA, RNA und ProteinaufreinigungMacherey Nagel740588.250
Jet PEI DNA-TransfektionsreagenzPolyPlus101-40
96-Well-Platte mit flachem BodenFalcon353072
96-Well-Platte mit V-BodenNunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 cm2 KolbenNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT BeschichtungspuffereBiosciences00-0044-59
Nunc Maxisorp mit flachem Boden 96 Well ELISA-PlattenNunc/Thermofisher44-2404-21hohe Proteinbindung
Anti-Human-IgG Ab konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
TMB-SubstratBD Biosciences555214
StreptavidinSigmaS0677
1 mL-HiTrap-Protein A HP-SäuleGE Healthcare17-0402-01
Ä KTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GL SäuleGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatographie SystemBioRad7880003

Referenzen

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Tags

Periphere mononukleäre BlutzellenEinzelzell-RT-PCRDurchflusszytometrie-SortierungHLA-A2/Pp65-TetramereTrennung mittels magnetischer MikroperlenELISA-AssayOberflächenplasmonenresonanzAmplifikation von Immunglobulingenen
Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden
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