Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Abstract

Studie der verschiedenen Ereignisse, Regulierung des Zellzyklus in einer Phase-abhängigen Weise liefert ein klares Verständnis über Zelle Wachstum und Teilung. Die Synchronisation von Zell-Populationen in bestimmten Phasen des Zellzyklus wurde festgestellt, als sehr nützlich in diesem experimentellen bemühen. Synchronisation von Zellen durch Behandlung mit Chemikalien, die relativ weniger toxisch sind kann vorteilhaft sein, über die Verwendung von pharmakologischen hemmenden Medikamenten für die Studie der konsequente Zellzyklus Ereignisse und spezifische Anreicherung von ausgewählten mitotischen Phasen zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Synchronisierung menschliche Zellen in den verschiedenen Phasen der Zelle Zyklus, einschließlich der beiden in S und M-Phase mit einem doppelten Thymidin-Block und Verfahren zur Untersuchung der Funktionalität der mitotischen Proteine im Chromosom Ausrichtung lassen und Segregation. Dieses Protokoll wurde äußerst nützlich für das Studium der mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die etablierten Interphase Funktionen besitzen. In unserem Fall kann die mitotische Rolle der Cdt1, entscheidend für die Replikation Herkunft Lizenzierung in G1-Phase, ein Protein effektiv studiert werden, nur wenn G2/M-spezifischen Cdt1 aufgebraucht werden können. Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Abbau der G2/M-spezifischen Cdt1 mit doppelten Thymidin-Synchronisation. Wir erklären das Protokoll der Zelle Fixierung auch live Cell Imaging mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie nach Thymidin-Release. Die Methode ist auch nützlich für die Analyse der Funktion der mitotischen Proteine unter physiologischen und gestörten Bedingungen wie z. B. für Hec1, ein Bestandteil der Ndc80 Komplex, da es eine zu große Stichproben der mitotischen Zellen für feste und live Zelle ermöglicht Analyse wie wir hier zeigen.

Introduction

In den Zellzyklus durchlaufen Zellen eine Reihe von stark regulierten und zeitlich gesteuerte Events für die genaue Vervielfältigung ihrer Genom und Verbreitung. Bei Säugetieren bestehend aus den Zellzyklus Interphase und M-Phase. In Interphase, bestehend aus drei Stufen - G1, S und G2, die Zelle seines Genoms dupliziert und Wachstum, die notwendig ist für normale Zellzyklus Progression^1,2erfährt. In der M-Phase, bestehend aus Mitose (Prophase, prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase) und Cytokinese, produziert eine elterliche Zelle zwei genetisch identische Tochterzellen. In Mitose, Schwester Chromatiden des doppelten Genoms sind verdichtete (Prophase) und sind an ihren Kinetochore von Mikrotubuli der montierten mitotischen Spindel (prometaphase) erfasst, das treibt ihre Ausrichtung an der Metaphase-Platte (Metaphase) gefolgt von ihrer gleich Trennung, wenn Schwester Chromatiden sind aufgeteilt in Richtung und transportiert zum gegenüberliegenden Spindel (Anaphase) Polen. Die zwei Tochterzellen sind räumlich getrennt von der Aktivität eines Actin-basierte kontraktilen Rings (Telophase und Cytokinese). Das Kinetochor ist eine spezialisierte proteinhaltige Struktur, die in der Zentromer-Region der Schwesterchromatiden montiert und dienen als Befestigung Standorte für Spindel Mikrotubuli. Seine Hauptfunktion ist zu fahren Chromosom erfassen, Ausrichtung, und Hilfe bei der Korrektur unsachgemäße Spindel Mikrotubuli Anlage, bei der Vermittlung des Spindel Baugruppe Prüfpunkt um die Treue des Chromosom Abtrennung^3,4zu erhalten.

Die Technik der Zelle Synchronisation dient als ideales Werkzeug für die molekulare und strukturelle Ereignisse im Zellzyklus Fortschreiten zu verstehen. Dieser Ansatz wurde zur Zell-Populationen in bestimmten Phasen für verschiedene Arten von Analysen, einschließlich der gen-Expression profiling Analysen der zelluläre biochemische Prozesse und Erkennung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen zu bereichern. Synchronisierte Säugerzellen können nicht nur für das Studium der einzelnen Gen-Produkte, sondern auch für Ansätze mit Analyse der ganzer Genome Microarray Analyse des Gens Ausdruck⁵, MiRNA Ausdruck Muster⁶einschließlich verwendet werden, Translational Regelung⁷und Proteomic Analyse von Protein-Modifikationen-⁸. Synchronisation kann auch verwendet werden, Studie zu den Auswirkungen der gen-Expression oder Protein Knock-down oder Knock-out- oder Chemikalien auf Zellzyklus Fortschreiten.

Zellen können in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus synchronisiert werden. Physikalische und chemische Methoden sind für die Zelle Synchronisation verbreitet. Die wichtigsten Kriterien für die Synchronisierung der Zelle sind, dass Synchronisation noncytotoxic und reversibel sein sollte. Wegen der potenziellen nachteiligen zellulären folgen Zellen durch pharmakologische Wirkstoffe zu synchronisieren können chemisch-abhängige Methoden für die Untersuchung wichtigen Zellzyklus Veranstaltungen vorteilhaft sein. Z. B. Hydroxyurea, Amphidicolin, Mimosine und Lovastatin, einsetzbar für Zelle Synchronisation am G1/S-Phase aber, wegen ihrer Wirkung auf die biochemischen Bahnen, die sie hemmen sie Zellzyklus Checkpoint Mechanismen zu aktivieren und töten einen wichtigen Bruchteil der Zellen^9,10. Auf der anderen Seite kann Feedback-Hemmung der DNA-Replikation durch Zugabe von Thymidin, Wachstumsmedien, bekannt als "Thymidin-Block" Zellzyklus bei bestimmten Punkten^11,12,13verhaften. Zellen können auch durch die Behandlung mit Nocodazole und RO-3306^9,14in G2/M-Phase synchronisiert werden. Nocodazole, die Montage von Mikrotubuli verhindert, hat eine relativ hohe Zytotoxizität. Darüber hinaus können Nocodazole verhaftet Zellen zurück altklug durch mitotische Schlupf interphase. Doppelte Thymidin Block Verhaftung-Zellen am G1/S-Phase und nach der Entlassung aus dem Block, sind Zellen gefunden, synchron durch G2 und in Mitose vorzugehen. Die normale Progression des Zellzyklus für Zellen befreit Thymidin-Block kann unter hochauflösenden konfokalen Mikroskopie durch Zelle Fixierung oder live Imaging beobachtet werden. Die Auswirkungen der Störung der mitotischen Proteine kann studiert werden, besonders dann, wenn Zellen eingeben und fahren Sie durch Mitose nach Entlassung aus dem doppelten Thymidin-Block. Cdt1, ein multifunktionales Protein ist beteiligt an der DNA-Replikation Herkunft Lizenzierung in der G1-Phase und ist auch während der Mitose¹⁵für Kinetochor-Mikrotubuli-Anlagen erforderlich. Um die Funktion des Cdt1 während der Mitose zu studieren, braucht man eine Methode zu verabschieden, die die Wirkung von seiner Erschöpfung zur Replikation Lizenzierung während der G1-Phase, während gleichzeitig bewirken seine Erschöpfung speziell in der G2/M-Phase nur vermeidet. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle basierend auf der doppelten Thymidin-Block zur Untersuchung der mitotischen Rolle von Proteinen, die mehrere Funktionen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus von festen und live-Cell Imaging.

Protocol

1. doppelter Thymidin sperren und freigeben: Reagenz Vorbereitungen

1. Machen 500 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin ergänzt.
2. Machen Sie 100 mM Lager von Thymidin in sterilem Wasser oder Store in Aliquote bei-80 ° C.

2. Protokoll für feste Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 1A)

1. Am Tag 1, Samen ~ 2 x 10⁵ HeLa-Zellen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einem Deckglas (mit 70 % Ethanol und UV-Bestrahlung sterilisiert) und 2 mL DMEM Medium. Wachsen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO₂.
2. 1^St Thymidin Block: am 2. Tag, mischen Sie die erforderliche Menge Thymidin in frischen DMEM Medien (100 mM Lager, 2 mM Endkonzentration).
3. Fügen Sie 2 mL Thymidin-haltigen Medien auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well Platte und 18 h inkubieren.
4. Am 3. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM; wachsen Sie Zellen in frisch vorgewärmte DMEM Medium für 9 h Zellen aus Block freizugeben.
5. 2^Nd -Thymidin-Block: erneut hinzufügen 2 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in jede Vertiefung des 6-Well-Platte.
6. Ein weiterer 18 h inkubieren.
7. Am Tag 4 aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.
8. Verdünnte SiRNAs (Kontrolle und Cdt1) und Transfection Reagens in Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.
9. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 9-10 h von der Blockierung lösen und befestigen der Zellen auf der Abdeckung rutscht mit 4 % PFA für 20 min bei RT
   Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.
10. Immunostain Zellen, nach dem permeabilizing mit 0,5 % (V/V) Reinigungsmittel für 10 min bei RT und die Zellen zweimal mit 1 X PBS für 5 min waschen.
    1. Sperren von Zellen mit 1 % BSA (w/V) mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei RT gefolgt von Behandlung von Zellen mit 50 µL Primärantikörper (Maus Anti-α-Tubulin Antikörper verdünnt 1:1, 000, Kaninchen-Anti-Zwint1-Antikörper verdünnt 1: 400 und Maus, die Anti-Phospho-ɣ H2AX bei 1: 300 verdünnt) bei 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei 37 ^oC.
    2. Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS dreimal, Behandlung von Zellen mit 50 µL Sekundärantikörper für jedes Cover-Glas (Alexa 488 und Rhodamine Red bei 1: 250 Verdünnungen in 1 % (w/V) BSA mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei RT
    3. Nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für jeweils 5 min., Behandlung von Zellen mit DAPI (0.1µg / mL in 1 X PBS) für 5 min bei RT
    4. Legen Sie nach dem Waschen der Zellen mit 1 X PBS zweimal für 5 min, das Deckglas mit Blick auf Zellen an die entsprechenden Montage-Medien auf einer klaren mikroskopische Folie.
11. Bild der Zellen für die Immunostained Proteine mit 60 X oder 100 X 1,4 NA Plan-apochromatische DIC Öl eintauchen Ziel auf eine invertierte hochauflösende confocal Mikroskop, ausgestattet mit einer geeigneten Kamera als notwendig für die Qualität der Bilder erforderlich montiert.
12. Abrufen von Bildern bei Raumtemperatur Z-Stapel von 0,2 µm Dicke mit Software für das Mikroskop nach Bedarf.

3. Protokoll für Live Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 3A)

1. Am 1. Tag Saatgut ca. 0,5-1 x 10⁵ HeLa-Zellen stabil mCherry-H2B und GFP-α-Tubulin (leicht variabel je nach Zelle Art und die Proteine, die sie zum Ausdruck bringen) in 35 mm unten Glasschalen mit 1,5 mL DMEM Medium ausdrücken und in eine befeuchtete wachsen Inkubator für 24 h bei 37 ^oC und 5 % CO₂.
2. 1^St Thymidin Block: am 2. Tag, fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien, um die Zellen in der Schale (100 mM Thymidin, 2 mM Endkonzentration).
3. 18 h inkubieren.
4. Am 3. Tag aspirieren Sie Thymidin-haltigem Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM.
5. Verdünnte SiRNAs (Kontroll- und Hec1) und Transfection Reagens mit Serum frei Wachstumsmedium für 10 min. separat mischen sie zusammen und 20 min bei RT inkubieren Die Endkonzentration von SiRNA verwendet in jeder Transfektion betrug 100 nM. Fügen Sie das Reaktionsgemisch auf die Zellen, die aus Thymidin gewaschen worden sind.
6. Wachsen Sie Zellen in 1,5 mL frisch vorgewärmte DMEM Medium für 8 h, Zellen aus Block freizugeben.
7. 2^Nd -Thymidin-Block: Fügen Sie 1,5 mL Thymidin-haltigen Medien (2 mM Endkonzentration) auf die Zellen in der Schale.
8. Ein weiterer 18 h inkubieren.
9. Am 4. Tag aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal, zweimal mit 2 mL 1 X PBS und einmal mit frischen vorgewärmte DMEM zu. Dann wachsen Zellen in frisch vorgewärmte Leibovitz ist (L-15) Medium ergänzt mit 10 % FBS und 20 mM HEPES bei pH 7,0 für 8 h, Zellen aus dem Block freizugeben.
10. Legen Sie die Schale in die Temperatur Kontrollkammer inmitten der hochauflösende confocal Mikroskop, die bereits auf mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung zur Stabilisierung der Temperaturen auf der Bühne und experimentelle gewechselt hat.
11. Fokussieren im Hellfeld mit Objektiv 60 X bis Zellen sichtbar sind, und klicken Sie dann manuell in die Region der Wahl der auf der Bühne zu sichten.
12. Licht und Kraft/Laserbelichtung, Erwerb Bildparameter und Dauer des Experiments mit der Mikroskop-Bild-Datenerfassungs-Software der Wahl einrichten. Verwenden Sie Filter für GFP (488 Erregung; 385 nm Emission) und mCherry (561 nm Anregung und 385 nm Emission) Bilder zu erwerben.
13. Führen Sie die Zeitraffer-Experiment durch gepulste Durchlicht separat zu erwerben und Fluoreszenz Bilder alle 10 Minuten für einen Zeitraum bis zu 16 h.
14. Abrufen von Bildern zwölf 1,0 µm getrennt Z-Ebenen um 9 Uhr nach der Entlassung aus der doppelten Thymidin-Block mit Software das Mikroskop nach Bedarf.
15. Analysieren Sie die Verfolgung einzelner Zellen für mitotischen Progression Bilder zu und schließlich montieren Sie den entsprechenden Film mit den Fidschi-Inseln/ImageJ-Source-Software.

Results

Studie der mitotischen Progression und Mikrotubuli Stabilität in den Zellen fest nach Entlassung aus dem Thymidin-block
Cdt1 engagiert sich bei der Lizenzierung der DNA-Replikation Ursprünge in der G1-Phase. Es wird abgebaut, während der S-Phase aber wieder sammelt sich im G2/M-Phase. Um ihre Rolle bei der Mitose zu untersuchen, muss der endogenen Cdt1 speziell auf die mit der am besten geeigneten Zelle Synchronisation Technik, die doppelte Thymidin Block

Discussion

Der wichtigsten Vorteil der doppelten Thymidin-Synchronisation ist, dass es eine höhere Stichprobengröße der mitotischen Zellen in einem kurzen Zeitfenster viele dieser Zellen in Mitose unisono bietet, wodurch auch Analysen von Chromosom Ausrichtung, bipolar Spindel-Bildung und Chromosom Segregation mit wesentlich höheren Wirkungsgrad.

Viele regulatorische Proteinkomplexe und Signalwege sind dafür normale Progression durch Mitose gewidmet und Deregulierung dieses Prozesses kann führte zu Tumor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 ° C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Filiale bei 4 > C
Leibovitz' s (1x) L-15 mittel	Life Technologies	21083-027	Lagern bei 4 > C
Serum reduziertes Medium (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Bei 4 > C
Penicillin und Streptomycin	Life Technologies	15070-063 (Pen-Streptogramm)	1:1.000 Verdünnung
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Bei 4 & Grad lagern; C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Gelöst in sterilem destilliertem Wasser
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa-Zellen, die GFP-H2B
HeLa-Zellen, die GFP-α-Tubulin exprimieren und mCherry H2B	Großzügiges Geschenk von Dr. Kozo Tanaka aus Tohoku Universität, Japan
Formaldehydlösung	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Giftig, erfordert Vorsicht
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Giftig, erfordert Vorsicht
Maus Anti-Α-Tubulin	Santa Cruz Biotechnologie	Sc32293	1:1.000 Verdünnung
Kaninchen Ameise-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 Verdünnung
Maus Anti-Phospho-& Gamma H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, Klon JBW301	1:300 Verdünnung
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 Verdünnung
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 Verdünnung
BioLite 6 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Glasbodenschale	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverses Mikroskop	Nikon Instruments
für konfokale	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Kamera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 Wellenlängenlaser	Agilent Technologies
Inkubationssystem für Mikroskope	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements Software	Nikon Instruments