Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.
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Methodenartikel
Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Studie der verschiedenen Ereignisse, Regulierung des Zellzyklus in einer Phase-abhängigen Weise liefert ein klares Verständnis über Zelle Wachstum und Teilung. Die Synchronisation von Zell-Populationen in bestimmten Phasen des Zellzyklus wurde festgestellt, als sehr nützlich in diesem experimentellen bemühen. Synchronisation von Zellen durch Behandlung mit Chemikalien, die relativ weniger toxisch sind kann vorteilhaft sein, über die Verwendung von pharmakologischen hemmenden Medikamenten für die Studie der konsequente Zellzyklus Ereignisse und spezifische Anreicherung von ausgewählten mitotischen Phasen zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Synchronisierung menschliche Zellen in den verschiedenen Phasen der Zelle Zyklus, einschließlich der beiden in S und M-Phase mit einem doppelten Thymidin-Block und Verfahren zur Untersuchung der Funktionalität der mitotischen Proteine im Chromosom Ausrichtung lassen und Segregation. Dieses Protokoll wurde äußerst nützlich für das Studium der mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die etablierten Interphase Funktionen besitzen. In unserem Fall kann die mitotische Rolle der Cdt1, entscheidend für die Replikation Herkunft Lizenzierung in G1-Phase, ein Protein effektiv studiert werden, nur wenn G2/M-spezifischen Cdt1 aufgebraucht werden können. Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Abbau der G2/M-spezifischen Cdt1 mit doppelten Thymidin-Synchronisation. Wir erklären das Protokoll der Zelle Fixierung auch live Cell Imaging mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie nach Thymidin-Release. Die Methode ist auch nützlich für die Analyse der Funktion der mitotischen Proteine unter physiologischen und gestörten Bedingungen wie z. B. für Hec1, ein Bestandteil der Ndc80 Komplex, da es eine zu große Stichproben der mitotischen Zellen für feste und live Zelle ermöglicht Analyse wie wir hier zeigen.
Einleitung
In den Zellzyklus durchlaufen Zellen eine Reihe von stark regulierten und zeitlich gesteuerte Events für die genaue Vervielfältigung ihrer Genom und Verbreitung. Bei Säugetieren bestehend aus den Zellzyklus Interphase und M-Phase. In Interphase, bestehend aus drei Stufen - G1, S und G2, die Zelle seines Genoms dupliziert und Wachstum, die notwendig ist für normale Zellzyklus Progression1,2erfährt. In der M-Phase, bestehend aus Mitose (Prophase, prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase) und Cytokinese, produziert eine elterliche Zelle zwei genetisch identische Tochterzellen. In Mitose, Schwester Chromati....
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Protokoll
1. doppelter Thymidin sperren und freigeben: Reagenz Vorbereitungen
- Machen 500 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin ergänzt.
- Machen Sie 100 mM Lager von Thymidin in sterilem Wasser oder Store in Aliquote bei-80 ° C.
2. Protokoll für feste Cell Imaging der mitotischen Progression (Abbildung 1A)
- Am Tag 1, Samen ~ 2 x 105 HeLa-Zellen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einem Deckglas (mit 70 % Ethanol und UV-Bestrahlung sterilisiert) und 2 mL DMEM Medium. Wachsen Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubato....
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Ergebnisse
Studie der mitotischen Progression und Mikrotubuli Stabilität in den Zellen fest nach Entlassung aus dem Thymidin-block
Cdt1 engagiert sich bei der Lizenzierung der DNA-Replikation Ursprünge in der G1-Phase. Es wird abgebaut, während der S-Phase aber wieder sammelt sich im G2/M-Phase. Um ihre Rolle bei der Mitose zu untersuchen, muss der endogenen Cdt1 speziell auf die mit der am besten geeigneten Zelle Synchronisation Technik, die doppelte Thymidin Block
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Diskussion
Der wichtigsten Vorteil der doppelten Thymidin-Synchronisation ist, dass es eine höhere Stichprobengröße der mitotischen Zellen in einem kurzen Zeitfenster viele dieser Zellen in Mitose unisono bietet, wodurch auch Analysen von Chromosom Ausrichtung, bipolar Spindel-Bildung und Chromosom Segregation mit wesentlich höheren Wirkungsgrad.
Viele regulatorische Proteinkomplexe und Signalwege sind dafür normale Progression durch Mitose gewidmet und Deregulierung dieses Prozesses kann führte zu Tumor.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierendes finanzielles Interesse haben.
Danksagungen
Wir sind dankbar, dass Dr. Kozo Tanaka der Tohoku University, Japan für den Austausch von HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck mCherry-Histon H2B und GFP-α-Tubulin. Diese Arbeit wurde durch ein NCI Zuschuss an DV (R00CA178188) und Starthilfe von der Northwestern University unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 ° C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Filiale bei 4 > C |
| Leibovitz' s (1x) L-15 mittel | Life Technologies | 21083-027 | Lagern bei 4 > C |
| Serum reduziertes Medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Bei 4 > C |
| Penicillin und Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen-Streptogramm) | 1:1.000 Verdünnung |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Bei 4 & Grad lagern; C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Gelöst in sterilem destilliertem Wasser |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa-Zellen, die GFP-H2B | |||
| HeLa-Zellen, die GFP-α-Tubulin exprimieren und mCherry H2B | Großzügiges Geschenk von Dr. Kozo Tanaka aus Tohoku Universität, Japan | ||
| Formaldehydlösung | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Giftig, erfordert Vorsicht |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Giftig, erfordert Vorsicht |
| Maus Anti-Α-Tubulin | Santa Cruz Biotechnologie | Sc32293 | 1:1.000 Verdünnung |
| Kaninchen Ameise-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 Verdünnung |
| Maus Anti-Phospho-& Gamma H2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, Klon JBW301 | 1:300 Verdünnung |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 Verdünnung | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 Verdünnung | |
| BioLite 6 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glasbodenschale | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverses Mikroskop | Nikon Instruments | ||
| für konfokale | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Kamera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 Wellenlängenlaser | Agilent Technologies | ||
| Inkubationssystem für Mikroskope | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements Software | Nikon Instruments |
Referenzen
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
