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Summary

Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.

Abstract

Salmonella Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien sind schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthielt in Vesikel genannt Phagosom um abgebaut werden. Isolierung von S. Typhimurium-enthaltenden Phagosom studieren verbreitet wie S. Typhimurium Infektion verändert den Prozess der Reifung Phagosom, bakteriellen Abbau zu verhindern. Klassisch, die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom von Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung durchgeführt wurde. Aber dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert spezialisierte Ausrüstung und ein gewisses Maß an Geschicklichkeit. Hier ist eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit magnetischen Beads Biotin-Streptavidin-konjugiert. Phagosom erhalten durch diese Methode können in jeder Puffer der Wahl, so dass die Verwendung von isolierten Phagosom für ein breites Spektrum von Assays, wie Eiweiß, Metaboliten und Lipid-Analyse ausgesetzt werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist spezifisch, effizient, schnell, erfordert eine minimale Ausstattung und ist vielseitiger als die klassische Methode der Isolation von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation.

Introduction

Makrophagen im Umlauf sind spezialisierter phagocytic Zellen, die erkennen, verschlingen und Fremdkörper in peripheren Geweben, von apoptotischen Zellen bis hin zu eindringenden Mikroorganismen wie Bakterien abgebaut. Auf Oberfläche Rezeptor-vermittelte Anerkennung Erreger spezifischer Marker auf der Oberfläche von Mikroorganismen (bekannt als Pathogen-assoziierte molekulare Muster oder PAMPs) häufig vorhanden initiieren Makrophagen eine komplexe Reorganisation der Zellmembran in Bestellung zu umgeben und phagocytize der Erreger-¹.

Die verschlungen Erreger ist dann durch die Makrophagen in einem intrazellulären Vesikel genannt Phagosom enthalten. Durch eine Reihe von Kernfusion und Kernspaltung Veranstaltungen mit anderen Vesikel wie Endosomen und Lysosomen erwirbt die Erreger-haltigen Phagosom eine Reihe von Proteinen, die für die Beseitigung des phagosomal Inhalts erforderlich. Daher ist die enzymatische Zusammensetzung der Phagosom im Laufe dieses Prozesses, bekannt als Phagosom Reifung²sehr variabel.

Kurz nach der Phagozytose, Multimeric, die komplexe vacuolar ATPase (V-ATPase) durch Fusion mit Endosomen³Phagosom Membran integriert ist. Die Anlage nutzt ATP zu Pumpe Protonen aus dem Zytosol in das Lumen der Phagosom⁴. Versauerung der Phagosom ist unerlässlich für die Fusion-Veranstaltungen mit anderen Vesikel⁵ und für die Aktivierung einer großen Anzahl von pH-abhängigen abbauende Enzyme⁶. Ein weiterer Multimeric enzymatischen Komplex, die schnell auf der Membran Phagosom montiert ist ist der NADPH-Oxidase (NOX) Komplex. Komplexe NOX oxidiert NADPH um reaktive Sauerstoffspezies (ROS), werden in das Phagosom Lumen abgesondert und, die wesentlich dazu beitragen, die Tötung der verschlungen Mikroorganismen^7,zu produzieren.

Während die ersten Schritte der Reifung präsentieren Phagosom Marker in der Regel wie Rab5 und Rab7 der frühen und späten Endosomen bzw. zusammen mit der V-₀ -Untereinheit des V-ATPase⁸. Fusion von Phagosom mit Lysosomen und späten Endosomen führt die Belichtung der phagocytized Erreger, eine Vielzahl von hydrolytische Enzyme wie Cathepsin Proteasen, Lipasen und β-Galaktosidase⁹. Versauerung des lumens ist auch erforderlich für die Aktivierung dieser Enzyme. Beispielsweise ist die Spaltung von Cathepsin D, die aktive Kurzform zu produzieren pH-abhängigen¹⁰. Diese Enzyme erniedrigen den Erreger und vermitteln die Herstellung von Pathogen-abgeleitete kurze Peptide, die durch die Makrophagen große Histocompatibility Komplexes (MHC) Klasse II Moleküle auf T-Zellen eine adaptive Immunantwort¹¹auslösen dargestellt werden.

Daher Phagosom Reifung ist entscheidend für die angeborene Immunantwort und verbindet die angeborene und adaptive Waffen des Immunsystems. Es ist keine Überraschung, dass die Erreger Strategien zur Beseitigung von Makrophagen durch den oben beschriebenen Prozess der Reifung Phagosom Überwindung entwickelt haben. Beispielsweise verhindert die intrazellulären Bakterien Mycobacterium Tuberculosis und Legionella Pneumophila Phagosom Reifung durch hemmende V-ATPase Montage- und konsequente Lumen Versauerung^12,13 . Andere Bakterien wie Listeria Monocytogenes oder Shigella Flexneri induzieren Porenbildung in der Phagosom Membran in die Zellflüssigkeit^14,15zu entkommen. Auf der anderen Seite, Salmonella Enterica Serovar Typhimurium (S. Typhimurium) zum Ändern der Eigenschaften von Phagosom in die Vakuole, es in einen geeigneten Standort für ihre Replikation¹⁶verwandeln kann. Diese Fähigkeit macht S. Typhimurium ein sehr interessantes Modell Erreger-vermittelte Störungen von Phagosom Reifung zu studieren.

S. Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien werden schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthaltenen Phagosom¹⁷. Einige Berichte haben, dass S. oben beschrieben. Typhimurium-enthaltenden Phagosom präsentieren Hersteller für Endosomen und Lysosomen¹⁸, und andere Studien ergaben Phagosom-Lysosomen Fusion verhindert auf S. Typhimurium Infektion¹⁹.

Zunächst Phagosom Reifung auf S. Typhimurium Infektion ist durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht worden. Die Entwicklung von Techniken für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ermöglichte eine genauere Studie über das Phagosom Inhalte in Bezug auf Endosom und Lysosomen Marker. Bis heute ist die main-Methode verwendet für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ist der subzellulären Fraktionierung auf Saccharose Schritt Steigungen^18,20. Diese Methode erfordert jedoch mehrere Zentrifugation Schritte, die Phagosom mechanische beschädigen können, beeinflussen die Stabilität der phagosomal Komponenten (Proteine und Lipide) und nimmt Zeit in Anspruch. Darüber hinaus erfordert die Verwendung einer Ultrazentrifuge: ein Stück von Spezialausrüstungen, die nicht für jedes Labor zugänglich ist.

Vor kurzem ein neuer Ansatz zur Isolierung der Bakterien-haltigen angewendet wurde Phagosom, in denen bakterielle Erreger mit biotinylierte Lipopetide (Lipobiotin) und später beschriftet sind mit Streptavidin-konjugiert magnetische Beads^{21 extrahiert} . Wir schlagen eine alternative komplementäre Methode durch bakterielle Oberfläche Amin-haltigen Makromoleküle mit NHS-Biotin labeling von Streptavidin konjugiert magnetische Beads gefolgt. Phagosom erhalten durch diese Methode sind hochangereichertes im Endosom und Lysosomen Marker und können für eine breite Palette von Assays aus Protein-Analyse, Analyse der Omics verwendet werden. Darüber hinaus erfordert es keine Spezialausrüstung wie Ultrazentrifugen. Darüber hinaus werden durch den Wegfall der Zentrifugation Schritte, die mechanische Beschädigung Phagosom und der Höhe der Zeit beschäftigt erheblich reduziert. Diese Methode kann leicht für die Isolierung von Phagosom mit anderen Bakterien, wie z. B. die grampositive Staphylococcus Aureus, ebenfalls in dieser Handschrift angepasst werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist eine einfache, kostengünstige, und weniger zeitaufwändig als die klassische Trennung von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation, Rendern sehr bereichert Bakterien-haltigen Phagosom.

Protocol

alle Schritte, die die Verwendung von pathogenen S. Typhimurium muss in einem BSL-2 oder höhere biologische Sicherheit Ebene Anlage durchgeführt werden. Die Kultur und die Beschichtung von S. Unter einem Laminar-Flow-Haube um Kontaminationen zu vermeiden muss Typhimurium sowie die Infektion des Knochenmarks abgeleitet Makrophagen (BMDMs) durchgeführt werden. Die Isolation der S. Typhimurium-mit Phagosom durchgeführt werden kann, auf jedem Labortisch BSL-2. die Gewinnung von Knochenmark von Mäusen für seine Differenzierung in Makrophagen war in Übereinstimmung mit Richtlinien im Bereich des Tierschutzes durchgeführt und genehmigt von der Nordrhein-Westfälischen Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt und dieser (LANUV) Nordrhein-Westfalen; AZ.: 84-02.05.40.14.082 und 84-02.04.2015.A443] und der Universität zu Köln. 1. Culturing S. Typhimurium Impfung S. typhimurium (SL1344 Stamm) aus einer einzigen bakterielle Kolonie in 5 mL des Gehirns Herz Infusion (BHI) Brühe mit einer bakteriellen Schleife. Brüten die Bakteriensuspension in einem Inkubator bei 37 ° C über Nacht mit zitternden. Am folgenden Tag 1 mL der Bakteriensuspension in 19 mL BHI Brühe in einem konischen Kolben und Inkubation bei 37 ° C in einem Inkubator mit zitternden. Überwachen die S. Typhimurium Wachstum durch die Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm (OD 600) mit einem Spektrophotometer. Messungen sollten etwa alle 30 min. Bei OD 600 erreicht 1.0, entfernen Sie Bakteriensuspension aus dem Inkubator und Transfer in 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie Bakterien bei 5.400 x g für 15 min bei 4 ° c Überstand zu entfernen und erneut in 10 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Zentrifuge bei 5.400 x g für 15 min bei 4 ° C. Entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Bakterien in 4,9 mL sterile PBS. 2. Beschichtung von S. Typhimurium mit magnetischen Beads NHS-Biotin/Streptavidin-konjugiert Hinzufügen 100 µL von 10 mg/mL Biotin Lösung (NHS-Biotin in Dimethyl Sulfoxid, DMSO gelöst) frisch zubereitet, um die Bakteriensuspension verknüpfen in der vorherigen Schritt vorbereitet. Verdünnen Sie beispielsweise 5 mg von NHS-Biotin in 0,5 mL sterile DMSO. Mix richtig von oben und unten mehrmals pipettieren. Unterteilt den Mix in fünf 1,5 mL Röhrchen. Für 2 h bei Raumtemperatur (RT) auf einen Thermoblock mit konstanter Schütteln bei 350 u/min inkubieren. Rohre bei 15.000 x g für 10 min bei RT Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. In 1 mL sterile PBS, Zentrifuge bei 15.000 x g für 10 min bei RT Aufschwemmen und entsorgen des Überstands. Wiederholen Sie Schritt 2.5 zwei weitere Male, um die überschüssiges Biotin Verknüpfung Lösung vollständig zu entfernen. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen das Pellet in 1 mL sterile PBS. Übertragen Sie 100 µL 10 mg/mL Streptavidin konjugiert magnetische Beads-Lösung in einem 1,5 mL-Tube und lassen Sie es auf dem magnetischen Rack für 5 min. Entfernen des Lösungsmittels mit einer Pipette, die Streptavidin-konjugiert magnetische Beads-Lösung aus der magnetischen Halterung zu nehmen und mit 1 mL Biotin beschichtet-bakterielle Suspension in Schritt 2.7 vorbereitet Aufschwemmen. Inkubation für 1 h bei RT auf einen Thermoblock mit konstanter Schütteln bei 350 u/min. Legen Sie die Lösung auf der magnetischen Zahnstange; 5 min warten und dann mit einer Pipette entfernen Bakterien, die nicht an die Wand gehalten haben (halten Sie es in ein Rohr mit der Bezeichnung als " nicht beschichteten Bakterien "). Der Anteil an der Wand des Rohres in Kontakt mit den Magneten ist Biotin/Streptavidin-beschichteten Bakterien. Das Rohr mit den beschrifteten Bakterien aus der magnetischen Halterung entfernen und in 1 mL sterile PBS Aufschwemmen. Der magnetischen Zahnstange wieder aufsetzen, 5 min warten und die PBS entfernen mit einer Pipette. Wiederholen Sie die Schritte 2.13 und 2.14 zwei weitere Male, um die Bakterien zu entfernen, die nicht mit der Streptavidin konjugiert magnetischen Kügelchen beschichtet werden. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen beschichtet-Bakterien in 500 µL steriler PBS und beschriften Sie das Rohr als " Bakterien beschichtet ". Zählen die Koloniebildenden Einheiten (KBE) beider " nicht beschichteten Bakterien " und " Bakterien beschichtet " Lösungen durch Ausplattieren Verdünnungsreihen auf Agarplatten BHI. Ca. 2 x 10 8 KBE/mL der beschichteten Bakterien stammen aus 20 mL der ursprünglichen Bakteriensuspension mit OD 600 von 1,0. Halten Sie die beschichtet, bakterieller Aussetzung bei 4 ° C am nächsten Tag verwendet werden, um Makrophagen infizieren. 3. Infektion von BDMDs am selben Tag, wenn die Bakterien mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetischen Kügelchen beschichtet, Platte voll differenzierte BMDMs 22 in 6 cm Gerichte bei einer Dichte von 5 x 10 6 Zellen pro Schale. Am nächsten Tag, Zentrifugieren beschichtet-bakterielle Aussetzung bei 15.000 x g für 5 min bei 4 ° c Den Überstand zu entfernen und erneut in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einer Konzentration von 10 x 10 6 KBE/mL. , Infizieren Makrophagen an einer Vielzahl von Infektionen (MOI) 10, entfernen Sie das Medium aus der BMDMs und 5 mL beschichtet-bakterielle Suspension vorbereitet. Optimale MOI für jeden Zelltyp oder experimentelle Zwecke von isolierten Phagosom beurteilt werden kann. Inkubation bei RT für 10 min Phagozytose synchronisieren. Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO 2 Inkubator für 30 min, Phagozytose zu initiieren. Andere Zelltypen erfordern unterschiedliche Inkubationszeiten zur Internalisierung der Bakterien zu gewährleisten. Der Bakterien-haltigen Medium vom Geschirr entfernen und Waschen der Zellen mit RPMI dreimal nicht verinnerlicht Bakterien entfernen. Schließlich fügen Sie 10 mL RPMI mit 10 % FBS und 50 µg/mL Gentamycin nicht phagozytiert Bakterien zu töten. Inkubieren der infizierten BMDMs bei 37 ° C mit 5 % CO 2, bis der gewünschte Zeitpunkt. Der gewünschte Zeitpunkt muss nach den Bakterien und Zelltyp verwendet und dem Zweck der Analyse experimentell ermittelt werden. Für die Studie der frühen Phagosom Endosom Fusion Events in S. Typhimurium-infizierten BMDMs, empfiehlt sich eine 30 min Inkubation. Für die Analyse der späteren Ereignisse können nach 2 h oder 4 h Inkubation Phagosom extrahiert werden. Längere Inkubationszeit von Makrophagen mit S. Tod von den Makrophagen führt Typhimurium über 24 h. Intrazelluläre Infektion verlängert, bevor die Phagosom Extraktion wahrscheinlich zu einer Verschlechterung der Biotin-Moleküle führen könnte. Aber wir waren nicht darauf bedacht Verlust von Biotin auf beschichteten Bakterien bis 24 Uhr 4. Isolierung von S. Typhimurium-Phagosom mit bereiten Sie das Volumen der erforderlichen Phagosom Isolierung Puffer ein (50-mM-Rohre, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT), eine Endkonzentration von 1 mM, Cytochalasin B, um eine endgültige Konzentration von 10 µM und Protease und Phosphatase-Inhibitoren, wie vom Hersteller empfohlen. Hinweis: DVB-t und Cytochalasin B muss hinzugefügt werden das Phagosom Isolierung Puffer A immer unmittelbar vor dem Gebrauch. Cytochalasin B stört das Zytoskelett den Bruch der Zellmembran zu erleichtern. Zum gewünschten Zeitpunkt zeigen, das Medium aus den infizierten Zellen zu entfernen und waschen Sie mit sterilen PBS erwärmt, RT. Fügen Sie 750 µL phagosome-Isolierung Puffer A pro Schale und inkubieren Sie 20 min auf Eis. Bei der Verwendung von verschiedenen Zellzahlen sollte das Volumen der Isolierung Puffer A proportional angepasst werden. Fügen Sie 250 µL Phagosom Isolierung Puffer B (50-mM-Rohre, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol und 68 mM Saccharose). Rocken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass der Puffer die gesamte Oberfläche der Schale erreicht. Bei der Verwendung von verschiedenen Zellzahlen sollte das Volumen der Isolierung Puffer B proportional angepasst werden. Entfernen Sie die Zellen aus der Schale durch vorsichtig abkratzen mit einem Kautschuk-Polizisten und übertragen Sie sie auf einem vorgekühlt 1,5 mL-Tube. Die Zellsuspension durchlaufen eine 26G-Nadel mit einer 1 mL Spritze mindestens 15 Mal (eine Aspiration plus ein Auswurf der Aussetzung Zellzahlen als einmal). Dies ist genug, um die cytosolische Inhalte von BMDMs freizugeben. Die Anzahl der Durchläufe durch die Nadel muss für jeden Zelltyp optimiert werden. Legen die Zellsuspension auf dem magnetischen Rack und 5 min warten. Die Partikel an den Magneten befestigt sind die Phagosom mit beschichteten – S. Typhimurium. Die Suspension enthält den Rest der Zellkomponenten. Übertragen die Suspension in einem 1,5 mL Röhrchen beschriftet als " Zytosol ". Entfernen Sie das Rohr mit der isolierten Phagosom aus der magnetischen Rack und ihnen in 1 mL sterile PBS Aufschwemmen. Legen die Phagosom Aussetzung der magnetischen Zahnstange, 5 min warten und entfernen die PBS. Wiederholen Sie die Schritte 4.9 und 4.10 zu isolierten S. waschen Typhimurium-mit Phagosom. Endlich die PBS zu entfernen und Aufschwemmen der Phagosom in den erforderlichen Puffer; z. B. in einem Tests (RIPA) Testpuffer für Proteinanalytik. Ca. 50-200 µg des Proteins ergibt sich pro Probe nach diesem Protokoll abhängig von den ursprünglichen Betrag von Zellen und das MOI Infektion.

Representative Results

Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom durch dieses Protokoll erfordert die Biotinylierungen der Bakterien als ein erster Schritt. Wir beurteilen daher die Wirksamkeit von S. Typhimurium Biotinylierungen durch Analyse der konfokalen Mikroskopie der BMDMs infiziert mit biotinylierte mCherry -S. Typhimurium mit Cy5-Streptavidin beschriftet. Kurz, BMDMs infiziert wurden, wie in diesem Protokoll mit mCherry -Sbeschrieben. Typhimurium z…

Discussion

Eine neue Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und magnetische Beads Streptavidin konjugiert wird hier beschrieben. Nach sanften Unterbrechung der Zellmembran können Bakterien-haltigen Phagosom leicht mit einem magnetischen Rack extrahiert werden. Wir zeigen, dass die Kennzeichnung der Bakterien die Fähigkeit des Erregers induzieren Entzündungen bewahrt und ändert nichts an der phagocytic Eigenschaft der Wirtszelle. Wichtig ist, …

Materials

EZ-Link NHS Biotin	Thermo Fisher Scientific	20217
FluidMag Streptavidin	Chemicell	4205
PIPES	Carl Roth	9156.2
MgCl2	Carl Roth	A537.4
EGTA	Carl Roth	3054.3
Sucrose	Carl Roth	4621.1
Mannitol	Carl Roth	4175.1
DTT	Sigma	43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail	Thermo Fisher Scientific	1861280
Cytochalasin B	Sigma	C6762
DYNAL or DynaMag Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2501
Bacterial loop (10µl)	Sarstedt	86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344	Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMI	Biochrom	FG1415
PBS	Biochrom	L1825
Cy5-streptavidin	Invitrogen	SA1011
anti-beta-actin antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778
anti-mCherry antibody	Thermo Fisher Scientific	PA5-34974
anti-Rab5 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-46692
anti-Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-20943
anti-cathepsin D antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-6486
anti-Tomm20 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-17764
anti-calnexin antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-46669
anti-GAPDH antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-20357