Methodenartikel

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

DOI:

10.3791/56514

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25. Oktober 2017

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1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, University of Cologne, 2Cologne Cluster of Excellence in Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.

Zusammenfassung

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Salmonella Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien sind schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthielt in Vesikel genannt Phagosom um abgebaut werden. Isolierung von S. Typhimurium-enthaltenden Phagosom studieren verbreitet wie S. Typhimurium Infektion verändert den Prozess der Reifung Phagosom, bakteriellen Abbau zu verhindern. Klassisch, die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom von Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung durchgeführt wurde. Aber dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert spezialisierte Ausrüstung und ein gewisses Maß an Geschicklichkeit. Hier ist eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit magnetischen Beads Biotin-Streptavidin-konjugiert. Phagosom erhalten durch diese Methode können in jeder Puffer der Wahl, so dass die Verwendung von isolierten Phagosom für ein breites Spektrum von Assays, wie Eiweiß, Metaboliten und Lipid-Analyse ausgesetzt werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist spezifisch, effizient, schnell, erfordert eine minimale Ausstattung und ist vielseitiger als die klassische Methode der Isolation von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation.

Einleitung

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Makrophagen im Umlauf sind spezialisierter phagocytic Zellen, die erkennen, verschlingen und Fremdkörper in peripheren Geweben, von apoptotischen Zellen bis hin zu eindringenden Mikroorganismen wie Bakterien abgebaut. Auf Oberfläche Rezeptor-vermittelte Anerkennung Erreger spezifischer Marker auf der Oberfläche von Mikroorganismen (bekannt als Pathogen-assoziierte molekulare Muster oder PAMPs) häufig vorhanden initiieren Makrophagen eine komplexe Reorganisation der Zellmembran in Bestellung zu umgeben und phagocytize der Erreger-1.

Die verschlungen Erreger ist dann durch die Makrophagen in einem intrazellulären Vesik....

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Protokoll

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alle Schritte, die die Verwendung von pathogenen S. Typhimurium muss in einem BSL-2 oder höhere biologische Sicherheit Ebene Anlage durchgeführt werden. Die Kultur und die Beschichtung von S. Unter einem Laminar-Flow-Haube um Kontaminationen zu vermeiden muss Typhimurium sowie die Infektion des Knochenmarks abgeleitet Makrophagen (BMDMs) durchgeführt werden. Die Isolation der S. Typhimurium-mit Phagosom durchgeführt werden kann, auf jedem Labortisch BSL-2.

die Gewinnung von Knochenmark von Mäusen für seine Differenzierung in Makrophagen war in Übereinstimmung mit Richtlinien im Bereich des Tier....

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Ergebnisse

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Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom durch dieses Protokoll erfordert die Biotinylierungen der Bakterien als ein erster Schritt. Wir beurteilen daher die Wirksamkeit von S. Typhimurium Biotinylierungen durch Analyse der konfokalen Mikroskopie der BMDMs infiziert mit biotinylierte mCherry -S. Typhimurium mit Cy5-Streptavidin beschriftet. Kurz, BMDMs infiziert wurden, wie in diesem Protokoll mit mCherry -Sbeschrieben. Typhimurium z.......

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Diskussion

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Eine neue Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und magnetische Beads Streptavidin konjugiert wird hier beschrieben. Nach sanften Unterbrechung der Zellmembran können Bakterien-haltigen Phagosom leicht mit einem magnetischen Rack extrahiert werden. Wir zeigen, dass die Kennzeichnung der Bakterien die Fähigkeit des Erregers induzieren Entzündungen bewahrt und ändert nichts an der phagocytic Eigenschaft der Wirtszelle. Wichtig ist, Phago.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Forschung in der Robinson Lab wird unterstützt durch Mittel aus Köln-Exzellenz-Cluster auf zelluläre Stressreaktionen im Aging-Associated Krankheiten, Universität zu Köln, Deutschland (CECAD; gefördert durch die DFG im Rahmen der Exzellenzinitiative des Bundes und staatliche Regierungen) und Zuschüsse aus der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune und Maria Pesch-Stiftung der Universität zu Köln.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EZ-Link NHS BiotinThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
PIPESCarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SaccharoseCarl Roth4621.1
MannitolCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Halt Protease und Phosphatase Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific1861280
Cytochalasin BSigmaC6762
DYNAL oder DynaMag MagnetThermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 SpektralphotometerBio-Rad170-2501
Bakterienschleife (10µ l)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-StreptavidinInvitrogenSA1011
Anti-Beta-Aktin-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-47778
Anti-mCherry AntikörperThermo Fisher ScientificPA5-34974
Anti-Rab5 AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-46692
Anti-Rab7 AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-10764
anti-v-ATPase (V0) AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-28801
anti-v-ATPase (V1)-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-20943
Anti-Cathepsin-D-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-6486
anti-Tomm20 AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-17764
anti-Calnexin-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-46669
anti-GAPDH-AntikörperSanta Cruz BiotechnologySC-20357

Referenzen

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  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-79....

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Schlagwörter

Isolierung von Salmonella PhagosomenMagnetbead TrennungAnalyse der PhagosomenreifungBiotin Streptavidin MarkierungMakrophagen InfektionsmodellValidierung mittels KonfokalmikroskopieProteomik und Metabolomik AssaysGentamicin ProtektionsassayTrennung der Cytosol FraktionMethode zur Phagosomen Anreicherung

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