Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.
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Methodenartikel
Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Salmonella Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien sind schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthielt in Vesikel genannt Phagosom um abgebaut werden. Isolierung von S. Typhimurium-enthaltenden Phagosom studieren verbreitet wie S. Typhimurium Infektion verändert den Prozess der Reifung Phagosom, bakteriellen Abbau zu verhindern. Klassisch, die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom von Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung durchgeführt wurde. Aber dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert spezialisierte Ausrüstung und ein gewisses Maß an Geschicklichkeit. Hier ist eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit magnetischen Beads Biotin-Streptavidin-konjugiert. Phagosom erhalten durch diese Methode können in jeder Puffer der Wahl, so dass die Verwendung von isolierten Phagosom für ein breites Spektrum von Assays, wie Eiweiß, Metaboliten und Lipid-Analyse ausgesetzt werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist spezifisch, effizient, schnell, erfordert eine minimale Ausstattung und ist vielseitiger als die klassische Methode der Isolation von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation.
Einleitung
Makrophagen im Umlauf sind spezialisierter phagocytic Zellen, die erkennen, verschlingen und Fremdkörper in peripheren Geweben, von apoptotischen Zellen bis hin zu eindringenden Mikroorganismen wie Bakterien abgebaut. Auf Oberfläche Rezeptor-vermittelte Anerkennung Erreger spezifischer Marker auf der Oberfläche von Mikroorganismen (bekannt als Pathogen-assoziierte molekulare Muster oder PAMPs) häufig vorhanden initiieren Makrophagen eine komplexe Reorganisation der Zellmembran in Bestellung zu umgeben und phagocytize der Erreger-1.
Die verschlungen Erreger ist dann durch die Makrophagen in einem intrazellulären Vesik....
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Protokoll
alle Schritte, die die Verwendung von pathogenen S. Typhimurium muss in einem BSL-2 oder höhere biologische Sicherheit Ebene Anlage durchgeführt werden. Die Kultur und die Beschichtung von S. Unter einem Laminar-Flow-Haube um Kontaminationen zu vermeiden muss Typhimurium sowie die Infektion des Knochenmarks abgeleitet Makrophagen (BMDMs) durchgeführt werden. Die Isolation der S. Typhimurium-mit Phagosom durchgeführt werden kann, auf jedem Labortisch BSL-2.
die Gewinnung von Knochenmark von Mäusen für seine Differenzierung in Makrophagen war in Übereinstimmung mit Richtlinien im Bereich des Tier....
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Ergebnisse
Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom durch dieses Protokoll erfordert die Biotinylierungen der Bakterien als ein erster Schritt. Wir beurteilen daher die Wirksamkeit von S. Typhimurium Biotinylierungen durch Analyse der konfokalen Mikroskopie der BMDMs infiziert mit biotinylierte mCherry -S. Typhimurium mit Cy5-Streptavidin beschriftet. Kurz, BMDMs infiziert wurden, wie in diesem Protokoll mit mCherry -Sbeschrieben. Typhimurium z.......
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Diskussion
Eine neue Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und magnetische Beads Streptavidin konjugiert wird hier beschrieben. Nach sanften Unterbrechung der Zellmembran können Bakterien-haltigen Phagosom leicht mit einem magnetischen Rack extrahiert werden. Wir zeigen, dass die Kennzeichnung der Bakterien die Fähigkeit des Erregers induzieren Entzündungen bewahrt und ändert nichts an der phagocytic Eigenschaft der Wirtszelle. Wichtig ist, Phago.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Forschung in der Robinson Lab wird unterstützt durch Mittel aus Köln-Exzellenz-Cluster auf zelluläre Stressreaktionen im Aging-Associated Krankheiten, Universität zu Köln, Deutschland (CECAD; gefördert durch die DFG im Rahmen der Exzellenzinitiative des Bundes und staatliche Regierungen) und Zuschüsse aus der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune und Maria Pesch-Stiftung der Universität zu Köln.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease und Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL oder DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spektralphotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bakterienschleife (10µ l) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-Streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| Anti-Beta-Aktin-Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| Anti-mCherry Antikörper | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| Anti-Rab5 Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| Anti-Rab7 Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1)-Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| Anti-Cathepsin-D-Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-Calnexin-Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH-Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | SC-20357 |
Referenzen
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-79....
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Nachdrucke und Genehmigungen
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