Summary
I denne protokol viser vi anvendelsen af seriel-sektion elektron tomografi at belyse mitokondrie struktur i Drosophila indirekte flyvning muskel.
Abstract
Mitokondrier er cellulære kraftcentre, der producerer ATP, lipider og metabolitter samt regulere calcium homeostase og celle død. Unikke cristae-rige dobbelt membran ultrastruktur af denne organelle er elegant indrettet til at udføre flere funktioner ved partitionering biomolekyler. Mitokondrie ultrastruktur er nært forbundet med forskellige funktioner; de fine detaljer af disse struktur-funktion relationer er dog kun begyndelsen til at blive beskrevet. Her, viser vi anvendelsen af seriel-sektion elektron tomografi at belyse mitokondrie struktur i Drosophila indirekte flyvning muskel. Seriel-sektion elektron tomografi kan tilpasses studere ethvert cellulære struktur i tre dimensioner.
Introduction
Elektronmikroskopi er et værdifuldt redskab til at studere den strukturelle forbindelse subcellulært forsamlingers og organeller, der udfører cellulære processer. Metoder er blevet udviklet for at bevare ultrastruktur af væv eller celler enten ved kemisk fiksering med aldehyder eller af højtryk frysning (HPF) efterfulgt af fryse substitution (FS)1,2. De integrerede model blokke kan derefter sectioned, farves og observeret med et transmissions-elektronmikroskop (TEM). HPF modellen kunne også behandles under cryo-tilstand, som ved cryo-skæring eller fokuseret ion beam (FIB) fræsning, og observeret af cryo-EM3,4.
Selv om tynde-sektion EM giver informativ morfologiske indsigt, kan de resulterende 2D billeder kun afsløre ultrastruktur af et bestemt udsnit. Hvordan ultrastruktur er organiseret i en 3D-version forbliver skjult. For at visualisere cellulære ultrastruktur i tre dimensioner, blev en elektron tomografi metode udviklet hvor serie af tilt billeder blev erhvervet og tilbage forventes for at generere en tomografisk genopbygning5 (figur 1). En dobbelt tilt serie kan indsamles af roterende prøve 90° og erhverve en anden tilt serie. Dette vil minimere mangler kile artefakter, der skyldes begrænset prøveudtagning vinkler og forbedre løsningen af tomogram.
Her, beskriver vi anvendelsen af seriel-sektion elektron tomografi at studere mitokondrie ultrastruktur af Drosophila indirekte flyvning muskel (IFM)6,7,8,9 . For at få 3D rekonstruktioner dækker hele mitokondrier (ca 2,5 µm-tyk), blev seriel afsnit indhentet fra Drosophila IFM væv blokke. Tomogrammer hver sektion blev indsamlet individuelt med automatisk data collection software. Tomografisk rekonstruktioner blev genereret og seriel Tomogrammer blev forenet med pakken IMOD at opnå en rekonstrueret volumen af en hel mitochondriet. De joinforbundne Tomogrammer blev analyseret af 3D-software. Tætheder af mitokondrie cristae blev opdelt for at generere en segmentering model, der afslørede organisation i tre dimensioner.
Protocol
1. afsnit Drosophila væv ved hjælp af en vibrerende klinge mikrotomen
- Bedøver Drosophila på is og fordybe hver enkelt flyve i 1 mL af 4% lavt smeltepunkt Agarosen i fosfat buffer. Tillad Agarosen størkne på is. Typisk blev 4-6 fluer behandlet.
- Bruge en vibrerende klinge mikrotom til afsnit agarosegel integrerede Drosophila i skiver med 100 µm tykkelse og fordybe i Fikseringsvæske løsning indeholdende 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfat-buffer.
Bemærk: Vibratome skæring foretrækkes, fordi væv arkitektur er mere intakt sammenlignet med andre metoder. Alternativt kan dissekere pincet bruges til at dissekere IFM i Fikseringsvæske løsning indeholdende 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfat-buffer.
2. klargør EM prøver af højtryks frysning og fryse kalibreringsfase (HPF/FS)
- Vask væv sektioner i 3 dråber (~ 150 µL) af fosfat buffer, efterfulgt af 2 dråber (~ 100 µL) af fosfat buffer med 20% BSA. Derefter placere sektioner i guld luftfartsselskaber for HPF fyldt med buffer og 20% BSA.
- Indlæse den prøve, der indeholder luftfartsselskaber i en højtryks fryseskibe ifølge brugsanvisningen.
- Efter frysning, frigive luftfartsselskaber fra indehaveren under flydende kvælstof og overføre til en fryse-substitution enhed afkølet til-140 ° C.
- Udføre fryse-substitution protokollen som vist i tabel 1, med FS cocktail, der indeholder 2% glutaraldehyd, 2% osmium dinitrogentetraoxid og 0,1% uranyl acetat i acetone.
- Forsigtigt fjerne enhederne fra luftfartsselskaber med en nål og integrere enhederne i harpiks ved stuetemperatur. Polymerisere harpiks på 65 ° C i 16 h.
Bemærk: FS protokoller bør ændres for at forberede andre typer af prøver. HPF/FS er foretrukket at bevare ultrastruktur og minimere tabet af cellulære indholdet.- Alternativt kan du anvende en kemisk fiksering protokol. Fix prøver med 2,5% glutaraldehyd natten, vask med buffere og derefter rette med 1% osmium dinitrogentetraoxid for 2 h. vask og dehydrere med stigende koncentrationer ethanol og derefter infiltrere og integrere prøver i Spurrs harpiks før polymeriserende på 65 ° C i 16 h.
3. Forbered serie-sektioner af enhederne for elektron tomografi
- Trim prøven blokke for at udsætte den ønskede blok ansigt, der indeholder væv.
- Forbehandle guld partikler (10 nm i diameter) med 1% BSA i 30 min. vask og suspendere guld partikler i PBS buffer. Overlay guld partikler på kobber slot gitre belagt med carbon folie til at oprette fiducial markører.
- Indtjekning under TEM at have tilstrækkelig fiducial markører (mindst 5-10 markører) synsfelt tomografi erhvervelse.
- Skær seriel sektioner, 200-250 nm i tykkelse, ved hjælp af en ultramicrotome.
- Indsamle seriel sektioner på slot gitre ved hjælp af en perfekt sløjfe for tynde sektioner.
- Pletten sektioner med Reynolds bly citrat i 10 min.
- Overlay en anden lag af fiducial guld partikler på toppen af afsnittene.
4. indsamle dobbelt-tilt elektron tomografi
- Indlæse gitter på en dual-aksen tomografi indehaveren og indsætte i transmissions-elektronmikroskop opererer på 200 kV.
- Juster mikroskop på eucentric fokus.
- Konfigurer automatisk data collection software. Justere og tilpasse elektronstråle på multi-skala imaging indstilling. Henvise til brugervejledning til drift detaljer10 (figur 2).
- Erhverve kamera mørke og lyse referencer i et tomt område uden kulstof film under indstillingen tomografi samling.
- Indsamle et gitter atlas ved lav forstørrelse. Vælg mitokondrier på serielle sektioner som mål for tomografi samling.
- Erhverve en tilt serie fra-60 ° til + 60 ° med 2 ° intervaller på aksen-en for hvert mål.
Bemærk: Tilt vinkler vil blive mekanisk begrænset af design af prøveholder. Indehaveren vil blokere stråle på høj tilt vinkler. - For at indsamle den anden tilt serie, rotere præparatholderen 90°. Erhverve en ny atlas. Vælg tilsvarende positioner og erhverve tilt serien på akse-B for hvert mål.
Bemærk: Andre softwarepakker, som SerialEM og Xplore3D, er tilgængelige for automatiske dataindsamling.
5. rekonstruere 3D Tomogrammer og Segment sub diskenheder ved hjælp af Software
- Rekonstruere Tomogrammer af dual-akse tilt billeder ved hjælp af IMOD software11.
- Henvise til brugervejledning til drift detaljer.
- Tilpasse den enkelte tilt serie af positioner i guld fiducial markører. Rekonstruere Tomogrammer enten ved metoden tilbage projektion eller samtidige iterativ genopbygning teknik (SIRT) metode for begge akse-A og akse-B, henholdsvis (figur 3).
- Kombinere Tomogrammer akse-a og akse-B til at generere en dobbelt-tilt tomogram med reduceret mangler kile artefakt.
- I fællesskab dobbelt-tilt Tomogrammer seriel afsnit at opnå rekonstruktioner dækker hele mitochondriet volumen. Model huller mellem seriel afsnit af programmet IMOD.
- Trim de joinforbundne Tomogrammer og bin til en ønskede størrelse for volumen segmentering.
- Analysere joinforbundne seriel Tomogrammer ved hjælp af 3D-software.
- Henvise til brugervejledning til drift detaljer.
- Filtrer Tomogrammer med en Gaussisk filter (eller andre ønskede metode) at forbedre kontrasten i funktioner og reducere baggrund tætheder.
- Segmentere ultrastruktur af mitochondrier, enten manuelt eller automatisk.
- Vise segmentering modeller til at give inspektion i 3D.
- Generere film ved hjælp af værktøjerne i 3D.
Representative Results
Vi anvendte serie-sektion elektron tomografi til at analysere strukturelle egenskaber af mitokondrie cristae der afspejler dens energiske og aldring. Vi viste, at mitokondrier af Drosophila IFM udgør en integreret cristae og matrix netværk i 3D (figur 4)7. Derudover akkumuleret mutant fluer med mitokondriel DNA replikation defekt og en accelereret ældning fænotype mitokondrier, der indeholdt undersektioner af løg-lignende hvirvlende core (figur 5)7.
Fig. 1: Illustration af elektron tomografi genopbygning fra en tilt serien. I eksperimentet, er en elektronstråle gået gennem et 3D-objekt, som objektet vippes til forskellige grader. For hver tilt betingelse, er en 2D projektion genereret og taget med et kamera. 2D fremskrivningerne ventes derefter tilbage for at rekonstruere 3D-objekt baseret på centrale skive Teorem. I illustrationen vises den samme proces for en oprindelige 2D-billede, der projiceres ind i en enkelt dimension under forskellige tilt vinkler. 1D fremskrivninger er derefter bruges til at rekonstruere den 2D billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: automatisk dataindsamling. En viewer visning af software viser atlas over en slot gitter, der indeholder serie sektioner, multi-skala målretning af mitokondrier og erhvervet vippe billeder. Skalalinjen = 500 µm (venstre øverste panel), 100 µm (nederste venstre panel), 1 µm (højre panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Seriel-sektion elektron tomografi af en enkelt mitochondriet i Drosophila indirekte flyvning muskel. (A) 2D micrographs og (B) 3D Tomogrammer fra seriel afsnit dækker hele omfanget af en mitochondriet. (C) de joinforbundne serie-afsnit Tomogrammer forventes for at skabe et længdesnit, med z-aksen vises lodret. Navnlig førte væv skæring til tab af materiale, forlader huller mellem joinforbundne Tomogrammer. Skalalinjen = 500 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: integreret intra-mitokondrier cristae og matrix netværk afsløret i 3D. (A) skiver af mitokondrie elektron tomografisk rekonstruktioner viser skifter mellem gråt membraner gennem z-aksen. (B) illustrationer af observerede cristae skifte mønstre af højre hånds og/eller venstrehåndet spiraler. (C) tomografisk segmentering illustrerer en venstrehåndet spiral i 3D (D) Cristae skifte mønstre blev analyseret og farve gengives på modellens segmentering (E, F). Tomografisk skive viser laterale matrix confluency (mørk tætheder, røde) på tværs af cristae membraner (hvid tætheder). (G) segmentering model af tomogram i (E) viser laterale matrix confluency (med rødt) og repræsentative cristae (i gråt). Skalalinjen = 50 nm (A), 200 nm (C), og 300 nm (D, E, F, G). Tallet var genoptryk fra Jiang et al. 7 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: mitokondrier med løg-lignende hvirvlende kerner akkumuleret i fluer med mitokondriel DNA replikation defekter under aldring. Repræsentative tomografisk skiver og den tilsvarende segmentering (højre paneler) viser en tværsnitsundersøgelse se (øverst) og et længdesnit visning (nederst) en hvirvlende kerne. Volumen segmentering angives ved hjælp af vilkårlige farvegengivelse at fremhæve den hvirvlende kerne. Skalalinjen: 200 nm. Tallet var genoptryk fra Jiang et al. 7 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Temp | Tid | Løsning | |||
| 1 | -140 ° C til-9 0 ° C | 30 min | Flydende kvælstof | |||
| 2 | -90 ° C | 96 hr | FS cocktail | |||
| 3 | -90 ° C til-60 ° C | 6 timer (5 ° C/hr) | FS cocktail | |||
| 4 | -60 ° C | 12 hr | FS cocktail | |||
| 5 | -60 ° C-25 ° C | 7 t (5 ° C/hr) | FS cocktail | |||
| 6 | -25 ° C | 12 hr | FS cocktail | |||
| 7 | -25 ° C til 0 ° C | 5 hr (5 ° C/hr) | FS cocktail | |||
| 8 | 0 ° C | 1 hr x 3 gange | Acetone | |||
| 9 | Værelse temp | Harpiks infiltration | ||||
Tabel 1: Fryse-substitution protokol.
Discussion
I denne protokol beskriver vi en optimeret arbejdsprocessen for at anvende serie-sektion elektron tomografi for at studere 3D mitokondrie ultrastruktur af Drosophila indirekte flyvning muskel. Bevarelse af ultrastruktur i prøveopløsningen er den primære tekniske udfordring for denne form for analyse. Bedste bevare ultrastruktur to metodologiske blev skridt inkluderet. Først, væv blev samplet af skæring med vibrerende klinge mikrotom for at opretholde væv arkitektur så meget som muligt. For det andet var en HPF/FS protokol optimeret til at bevare organelle ultrastruktur under udarbejdelsen af integrerede modellen blokke. Prøver var frosset under højt tryk, hvilket sænker frysepunktet for vand og reducerer dannelsen af iskrystaller, der skader ultrastruktur1. Prøver så tyk som 0.1 mm kan forglasset øjeblikkeligt, og derefter udsat for at fryse substitution for at generere modellen blokke til EM analyse. Forbedret bevarelse af ultrastruktur af HPF/FS blev bemærket, i forhold til kemisk fiksering metoder. Ved hjælp af denne serie af trin for prøveforberedelse, var bevarelse af mitokondrie dobbelt membraner og cristae membraner dramatisk forbedret.
At opnå seriel dele af modellen er den mest udfordrende skridt af metoden. Da elektronstrålen har begrænset penetration magt, tykkelse af afsnittet er begrænset til enten 250 nm eller 500 nm med en TEM opererer på 200 kV eller 300 kV, henholdsvis. Fordi tykkelsen af en mitokondriet muligvis mere end 2 µm, skal seriel sektioner opnå fuld volumen rekonstruktioner. Men at inddrive et tilstrækkeligt antal serielle sektioner til at spænde en hele organelle er en teknisk udfordring. Trimning blok ansigtet for at være så fladt som muligt mellem baserne af trapez kan tillade et slot gitter til at rumme flere sektioner og dermed dække større mængder. Derudover øger bruger en perfekt sløjfe for tyndslib succesraten for overførsel seriel sektionerne til gitteret.
Seriel-sektion elektron tomografi kan opnås med EM core standardudstyr. Men metoden har visse uundgåelige begrænsninger, der skyldes tekniske begrænsninger. En er, at materialet er uundgåeligt tabt mellem seriel sektioner, forlader huller i den joinforbundne genopbygning. For det andet er den manglende kile artefakt, der opstår på grund af de begrænsede tilt vinkler, der er opnåelige. Denne begrænsning opstår, fordi præparatholderen ikke kan slås i en fuld rotation uden at blokere elektronstrålen. På trods af disse begrænsninger giver seriel-sektion elektron tomografi nok opløsning til at afsløre cellulære og organelle ultrastruktur i 3D.
For mindre skala imaging er cryo-elektron tomografi en ny teknologi, der kan bruges til at få struktur i makromolekylære komplekser og samlinger uden for levestedet ved nm eller sub Ångstrøm opløsning i kombination med sub-tomografisk genopbygning3. I denne ansøgning, er celler tyndet ved skæring eller fokuseret ion beam fræsning under flydende kvælstof. Tomogrammer indsamles cryo-betingelser hvor molekylære strukturer er bevaret tæt på hjemstat uden kemisk fiksering, dehydrering, eller integrering. I anden enden af skalaen, til at analysere store væv diskenheder på bekostning af opløsning, er seriel blok-ansigt scanning elektronmikroskopi en tiltalende modalitet selvom det kræver et særligt instrument4.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Undersøgelserne blev udført i EM kernen på Institut for Cellulær og organismens biologi og cryo-EM kernen i Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Arbejdet var støttet af Academia Sinica og de fleste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
