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Methodenartikel

Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

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DOI:

10.3791/56588

⸱

15. Dezember 2017

 , 
1Molecular and Cell Biology, Department of Biosciences and Center of Human and Molecular Biology (ZHMB), Saarland University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In der Handschrift beschreiben wir die Verwendung eines Hefe-basierte Fluoreszenz Reporter Assays, zelluläre Komponenten des Menschenhandels beteiligt und Tötung Prozesse von der zytotoxischen eine Untereinheit der Pflanze Toxin Rizin (RTA) zu identifizieren.

Zusammenfassung

Bakterien- und Werk A / B Toxine nutzen die natürlichen Handel Wege in eukaryotischen Zellen, deren intrazellulären-Zielen in das Zytosol zu erreichen und letztlich töten. Solche A / B Toxine bestehen in der Regel von einer enzymatisch aktive Asubunit (z.B. Ricin Toxin (RTA)) und mindestens eine Zelle, die Bsubunit(s), die verantwortlich sind für Toxin Bindung an bestimmte Oberfläche Rezeptoren Zelle binden. Unseren derzeitigen Kenntnissen wie A / B-Toxine sind in der Lage, effizient berauschenden Zellen half Wissenschaftler um grundlegenden zellulären Mechanismen wie Endozytose und intrazelluläre Protein Sortierung in höhere eukaryotische Zellen zu verstehen. Aus medizinischer Sicht ist es ebenso wichtig, die großen Toxin Handelsrouten, angemessene Behandlungslösungen für Patienten zu finden oder entwickeln schließlich therapeutische Toxin-basierten Anwendungen für die Krebstherapie zu identifizieren.

Seit genomweite Analysen von A / B Toxin in Säugetierzellen Menschenhandel ist komplex, zeitaufwändig und teuer, mehrere Studien an A / B Toxin Transport bei Modellorganismus der Hefe Saccharomyces Cerevisiaedurchgeführt wurden. Obwohl Sie weniger komplex, grundlegende zelluläre Prozesse in Hefe und höhere eukaryotische Zellen sind ähnlich und sehr häufig Ergebnisse, die in der Hefe die Säugetier-Situation übertragbar auf.

Hier beschreiben wir einen schnell und einfach zu bedienen-Reporter Assay zur Analyse der intrazellulären Handel mit RTA in der Hefe. Ein wesentlicher Vorteil des neuen Tests ist die Möglichkeit, nicht nur RTA Retro-Translokation aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol zu untersuchen, aber eher Endozytose und retrograde Toxin transport von der Plasmamembran in der Notaufnahme. Der Test nutzt ein Reporter Plasmid, die indirekte Messung der RTA Toxizität durch Fluoreszenzemission von das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann nach der in-Vivo -Übersetzung. Da RTA effizient die Einleitung der Protein-Biosynthese von 28 s rRNA Depurinierung verhindert, ermöglicht dieser Assay die Identifikation von Host Zellproteinen intrazellulären RTA-Beförderung durch die Erkennung von Veränderungen in Fluoreszenzemission.

Einleitung

Patienten mit Infektionen durch Toxin produzierenden Bakterien stellen eine schwere medizinische und finanzielle Belastung für jeden sozialen Gesundheitssystem, insbesondere, da effiziente therapeutische Behandlungen noch weitgehend fehlen. Entwicklung neue therapeutische Strategien, die komplexe Rausch-Mechanismen der medizinisch relevanten A / B Giftstoffe wie Cholera Toxin oder Shiga Toxin Rizin vollständig verstanden werden, auf molekularer Ebene basierend auf neuartige leistungsfähige Assays, die umgesetzt werden müssen.

In den letzten Jahren mehrere Studien versucht, analysieren, A / B Toxin Transport in Hefe und Säugerzellen mit Zeit- und kostenintensive Methoden wie radioaktive Toxin zu beschriften,1,2 sowie SiRNA-basierten Screening 3nähert. In einigen Fällen ist die Toxin Menschenhandel visualisierte in Vivo durch Fluoreszenz-Mikroskopie nach chemische und/oder genetische Kopplung der einzelnen Toxin Untereinheiten mit Fluorophore, Quantenpunkte oder fluoreszierende Proteine4,5gewesen. Leider, solche Änderungen führen oft zu inaktiv und/oder veränderten natürlichen Eigenschaften der Giftstoffe. Eine weitere elegante Möglichkeit, indirekt eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten ist die Verwendung von Reporter-Systeme auf Basis von Enzymen wie LacZ, Luciferase oder fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder Discosoma sp. rot fluoreszierenden Proteins () DsRed)).

In diesem Manuskript ist ein einfaches Protokoll beschrieben die zelluläre Komponenten für den intrazellulären Transport von extrazellulär angewandte RTA in S. Cerevisiaeidentifiziert. Dabei fungiert ein Fluoreszenz-Reporter-Plasmid enthält eine N-terminale ER-Import-Signal gefolgt von GFP als ein Protein-Biosynthese-Sensor, der indirekt RTA-vermittelten Protein Übersetzung Hemmung von GFP Fluoreszenzemission nach in-vivo misst Übersetzung6. RTA Endozytose oder intrazellulären Handel ist negativ (oder positiv) in eine bestimmte Hefe Löschung Mutante im Vergleich zu Wildtyp betroffen, so kann dies durch eine Erhöhung (oder Verringerung) GLP Fluoreszenz Emission6erkannt werden.

Bisher beschränkten sich alle Methoden analysieren RTA Transport in Hefezellen, den ER zum Zytosol Retro-Translokation Prozess der RTA. In solch ein künstliches System drückt sich RTA mit ein ER-Import-Signal von einem induzierbaren Promoter wiederum eine selbstmörderische Phänotyp1,7. Obwohl die Zelle binden B-Untereinheit Ricin ebenfalls in der Versuchsaufbau beschrieben in dieser Handschrift fehlt ist und somit vollständig nicht die natürliche Situation von Ricin Holotoxin Rausch8, Toxin-Transport aus dem Plasma repräsentiert Membran durch den Golgi Apparat in die Notaufnahme kann eng mit dieser neuartigen Assay nachgeahmt werden. Interessanterweise zeigen die vorläufigen Ergebnisse der Pilotstudie, dass die Handel Wege von RTA verwendet auffallende Ähnlichkeiten mit den Rausch-Route von Ricin Holotoxin offenbaren.

Zusammenfassend lässt sich sagen kann das beschriebene Verfahren verwendet werden, zu bestimmen, die spezifische Rolle der ausgewählten zelluläre Proteine im RTA Endozytose und des Handels in der Hefe. Darüber hinaus könnte diese Versuchsanordnung leicht andere Ribosom Inaktivierung Toxine produziert und abgesondert von verschiedenen Hefen und Bakterien-Spezies wie Zymocin oder Shiga Toxin angepasst werden.

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Protokoll

Hinweis: Eine Übersicht über die allgemeine experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

Achtung: RTA ist sehr giftig für den Menschen. Sicherheit Labor Erlaubnis S2 (Biosafety level 2 Äquivalent) ist erforderlich. Bitte tragen Sie Handschuhe während des gesamten Experiments.

(1) heterologen Expression von sein-tagged RTA in Escherichia coli

  1. E. Coli Zellen mit Ausdruck Plasmid pET24-RTA(His) 6 oder leerer Vektor pET24a(+) mit standard Elektroporation Protokolle9,10zu verwandeln. Zellen mit dem leeren Plasmid dienen als Negativkontrolle.
  2. Nach Auswahl des positiven Klone auf Kanamycin-haltigen (100 µg/mL) LB-Platten Zellen, in denen das RTA-Expressionsplasmid oder der leere Vektor in 5 mL LBkan Medium (LB-Medium mit 100 µg/mL Kanamycin) zu impfen und Inkubation bei 37 ° C und 220 u/min für 24 h.
  3. Ergänzen Sie 1 L LBkan Medium mit 5 mL Vorkultur zu und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 220 u/min bis Zellen eines OD600 von 0,8-1,0 (ca. 3-4 h) erreicht haben. Danach reduzieren Sie Kultur Temperatur 28 ° c und bereiten Sie eine 1 M Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) Stammlösung in H2O.
  4. RTA-Ausdruck von E. Coli durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zu induzieren.
  5. Waschen Sie nach 3,5 h bei 28 ° C und 220 u/min, Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min das Pellet zweimal mit 5 mL Bindung Puffer (500 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min und Aufschwemmen Pellet in 5 mL Bindung Puffer.
    Hinweis: Protokoll kann in dieser Phase angehalten werden und Zellen können für mehrere Tage bei 80 ° C gelagert werden.

2. Reinigung des sein-tagged RTA über Affinitätschromatographie

  1. Beschallen Sie Zellen auf Eis mit das folgende Protokoll: 15 s-Pulse (20 Mikron), 30 s Pause. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.
  2. Zentrifugieren Sie Zelle lysate auf 21.000 x g und 4 ° C für 15 min und Filtern Sie überstand eine sterile Spritze-Filter-System (0,2 µm Porengröße) verwenden.
    Hinweis: Zelle Pellets erfolgreich beschallten Proben zeigen transparente Ränder.
  3. Verwenden Sie ein automatisches Reinigungssystem ausgestattet mit einer 5 mL Ni2 +-basierte Affinität Spalte um die sein-tagged RTA-Fraktion aus der steril filtriert E. Coli überstand zu reinigen. Im Allgemeinen verwenden Sie eine Elution Geschwindigkeit von 1 mL/min und kühl das ganze Reinigungssystem zur Vermeidung von nicht-effiziente Toxin Bindung und Verlust der Toxin-Aktivität.
    Hinweis: Parameter für die effiziente Reinigung der RTA sind in Tabelle 1aufgeführt. Siehe auch Becker Et Al. für weitere Informationen9.
    1. Kurz, equilibrate der Affinität Spalte mit 20 mL Bindung Puffer, Speicher-Puffer zu entfernen. Wenden Sie steril filtriert Überstand auf die Affinität Säule mit einer Spritze.
    2. Waschen Sie die Spalte mit 25-35 mL Bindung Puffer, die ungebundenen Proteine aus der Spalte zu entfernen. Führen Sie den Waschschritt bis UV-Absorption bei 280 nm liegt in der Nähe der UV-Anfangswert.
    3. Eluieren gebundene RTA Bruchteil in 20-35 mL Elution Buffer (500 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7,2) und halten Sie die Probe auf Eis (Abb. 2A und 2 b).
      Hinweis: Elution der RTA-Fraktion zeichnet sich durch eine Zunahme der UV-Absorption. Hinweis: um diese Fraktion zur Vermeidung von Kontamination mit unspezifischen gebundene Proteine ausschließlich zu sammeln.
    4. Verwenden Sie 20 µL des eluierten Proben Coomassie blaue Färbung11 oder Western-Blot Analyse12,13 (Optional) durchführen. Verwenden Sie primär Anti-His Antikörper (1:1 000) und sekundären anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) zur Erkennung von RTA und überprüfen Probe Reinheit (Abbildung 3).
    5. Entsalzen eluierten RTA Bruchteil einer 5 mL Entsalzung Spalte und equilibrate Probe in 0,8 M Sorbit.
      1. Ersetzen der Affinität Spalte das Reinigungssystem der Entsalzung spaltenweise und equilibrate zuerst die Spalte mit 20 mL 0,8 M Sorbit.
      2. Wenden Sie den eluierten RTA-Bruch in die Spalte über eine Spritze an. Waschen Sie die Spalte mit 100 mL 0,8 M Sorbit und eluieren Sie entsalzten RTA-Bruch in der 15 mL Tube, sobald die UV-Absorption beginnt zu erhöhen (Abbildung 2).
      3. Speichern Sie den eluierten RTA-Bruch bei 4 ° C.
        Hinweis: Hören Sie RTA Bruchteil Probenahme direkt auf, wenn Leitfähigkeit steigt auf um Salz Kontamination zu vermeiden. Parameter für die Entsalzung Verfahren sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  4. Eluierten RTA Bruchteil bei 10.000 x g und 4 ° C für 30-180 min mit einer 10 kDa Cutoff Spin Spalte zu einem Endvolumen von ca. 1-2 mL zu konzentrieren und Probe bei 4 ° C für 3-4 Wochen aufbewahren.
    Achtung: Nicht Einfrieren der Probenmaterials seit Einfrieren führt zu einem vollständigen Verlust des RTA-Aktivität.
  5. Proteinkonzentration mit einem konventionellen Protein Entschlossenheit-Kit zu bestimmen. Proteinkonzentration sollte im Bereich von 1-1,5 mg/mL sein.
    Hinweis: RTA tendenziell herbeiführen, wenn die Proteinkonzentration zu hoch ist (> 5 mg/mL).

3. Hefe-Transformation und Zellwand entfernen

  1. Wildtyp oder ausgewählte Hefe Löschung Mutanten mit der GFP Reporter Plasmid pRS315-K28SP- GLP6 mit standard-Lithium-Acetat Umwandlung Methoden14zu verwandeln. Inkubieren Sie Zellen auf Leucin Drop-out (d/o) Glukose-Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % Hefe Stickstoff Basis (YNB) und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin) bei 30 ° C für ca. 2-3 Tage für positive Klon-Auswahl.
  2. Wählen Sie 3 verschiedene Hefe Klone von jeder Platte und impfen die Klone in 100 mL Leucin d/o Raffinose Medium (2 % Raffinose, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o ohne Leucin mix) bei 220 u/min und 30 ° C bis OD600 = 1,0-2,0 (2-4 x 107 Zellen/mL).
    Hinweis: Zellwachstum von den verschiedenen Hefestämme Löschung unterscheidet. Monitor OD600 über einem Spektrophotometer.
  3. Um600 OD-Werte zu berechnen, verdünnen Sie Proben auf OD600 = 0,1-0,3 (1:5 bis 01:10 Verdünnungen) und OD600 in einem Spektrophotometer zu messen. Als Referenz verwenden Sie H2O, ergänzt mit der entsprechenden Menge an Leucin d/o Raffionose Medium.
Zu guter Letzt Aufschwemmen OD600 = 125 in 5 mL sterilem Wasser (5 x 108 Zellen/mL).
  • Zellen bei 25 ° C für 5 min bei 10.000 x g Zentrifugieren und waschen Zellen zweimal mit 5 mL sterilem Wasser Aufschwemmen Zellen in 50 mL Spheroplasting Puffer (0,8 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl2, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 200 µg/mL lytische Enzym).
  • Inkubieren Sie die 50 mL-Kultur bei 100 u/min und 30 ° C für 90 min. Optional: Spheroplast Bildung alle 15 min von Phasenkontrastmikroskopie zu überwachen. Unter dem Mikroskop sollte Zellen eine transluzente dunkelgraue Farbe haben. Bright (strahlenbrechende) Zellen sind nur unzureichend verdaut, während Geister (hellgrau Zellen mit wenig, wenn überhaupt, interne Struktur) over verdaut.
  • Spheroplast Vorbereitung Wirksamkeit für jede Probe zu überprüfen.
    1. Nach Fertigstellung Schritt 3.5, 4 µL der spheroplasted 50 mL Kultur mit 496 µL Spheroplasting-Puffer (ca. 2 × 106 Spheroplasts) mischen und für 10 min bei 400 X g zentrifugieren.
    2. Aufschwemmen Pellet in 10 mL H2O destilliert, Vortex Probe für 30 s und Platte aus 10 µL der Probe auf Leucin d/o Glukose Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin).
    3. Inkubieren Sie Zellen für 3 Tage bei 30 ° c Zählen Sie die Gesamtzahl der Erwachsenen Zelle Kolonien auf der Platte. Zur Datenauswertung, verwenden nur Proben mit mehr als 98 % Wirkungsgrad (Gesamt Kolonie Handynummer < 40 Kolonien/Platte).
  • Zentrifugieren Sie Zellen aus Schritt 3.5 bei 400 x g und 4 ° C für 10 min und waschen Zellen zweimal mit 5 mL stabilisiert Leucin d/o Raffinose Medium (0,8 M Sorbit, 2 % Raffinose, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % Drop-out-Mix ohne Leucin). Aufschwemmen Sie Zellen in 5 mL stabilisierte Leucin d/o Raffinose Medium (1 x 108 Zellen/mL) und verwenden Sie Zellen für die GFP Reporter Assay Messungen (Abschnitt 4) direkt zu.

    • (4) GLP Reporter Assay Messung in 96-Well-Platten

    1. Samen aus der Hefe Zelle Spheroplasts in Schritt 3,7 in 96-Well-Platten (200 µL/Well) erhalten.
    2. Fügen Sie 70 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose-haltigem Medium Negativkontrolle (Eluat eines Ni2 +-Affinität gereinigten Zelle lysate aus IPTG induziert E. Coli Zellen mit dem Ausdruck des leere Vektors) oder RTA in einer Endkonzentration von RTA von 5 µM (gereinigt entsprechend 160 g/L RTA) in jede Vertiefung.
    3. Fügen Sie sofort 30 µL stabilisiert Galaktose Lösung (30 % Galaktose, 0,8 M Sorbit) induzieren GFP Ausdruck und anschließend starten Sie die Messung.
      Hinweis: Führen Sie mindestens 3 Technische Wiederholungen pro Experiment und 3 biologische repliziert pro Hefestamm.
    4. Nach Abschluss der Probenvorbereitung (Schritte 4.1-4.3), die 96-Well-Platte in einem Fluoreszenz-Reader setzen und starten Sie die Messung. Verwenden Sie die 475/509 nm Filtersatz für GLP-Fluoreszenz-Detektion erforderlich. Messungen Sie bei 30 ° C, 120 u/min, und mit einem schütteln Durchmesser von 1 mm über ein Zeitfenster von 20 h (Messung von Abständen von 10 min).
      Hinweis: Die GLP-Filter-Set gibt es normalerweise in alle Lesesysteme. Temperatur, Zeitfenster, Messung von Abständen und RTA-Konzentration kann für die eigenen Bedürfnisse angepasst werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt.
    5. Optional: Verwenden Sie zusätzliche interne Kontrollen bei der Messung für die Qualitätskontrolle. Bereiten Sie eine Negativkontrolle durch Zugabe von 30 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose Medium anstatt 30 % Galaktose (keine GFP Induktion). Darüber hinaus fügen Sie 70 µL 0,8 M Sorbit stabilisiert G418 Lösung (300 µg/mL). Die Protein-Übersetzung-Inhibitor G418 dient als Positivkontrolle für Protein-Hemmung wie GFP Ausdruck in der Hefe verhindert.
    6. Relative GFP-Fluoreszenz in Prozent für die 20 h-Zeitpunkt nach der folgenden Gleichung berechnen (siehe Abb. 4A): figure-protocol-1 wo NC ist die negativ-Kontrolle
      1. Alternativ, bestimmen die relativen GFP Fluoreszenz für jeden Meßpunkt (in diesem Fall 10 min, siehe auch Schritt 4.4) unter Verwendung der obigen Gleichung. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, erstellen Sie ein Diagramm, indem die GFP-Fluoreszenz-Intensitäten (y-Achse) im Laufe der Zeit (x-Achse) beflecken.

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    Ergebnisse

    Die allgemeine Workflow des Protokolls beschrieben in diesem Manuskript wird in Abbildung 1, etwa fasst die einzelnen Schritte zur erfolgreichen RTA-Reinigung und das anschließende GFP Reporter Assay Experiment veranschaulicht. Eine ausführlichere Beschreibung jedes einzelnen Schritts finden Sie im Protokoll. Abbildung 2 zeigt das erwartete Ergebnis des erfolgreichen RTA Reinigung durch Affinitätschromatographie (

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    Diskussion

    Wenn Sie die oben genannten Protokoll durchführen, empfehlen wir die folgenden Vorschläge zu ein erfolgreiches Ergebnis des Experiments zu erreichen.

    Für heterologe Proteinexpression ist es wichtig, die IPTG-Konzentration von 1 mM nicht überschreiten. IPTG Konzentrationen > 1 mM zu hemmen, Promotor-induzierte RTA Ausdruck und führen zu geringeren Erträgen Toxin. Darüber hinaus sollten Zellen bei Temperaturen über 28 ° C zur Verhinderung Einbeziehung Körper Bildung, ineffiziente Falten und ...

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    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Danksagungen

    Teile dieser Studie wurden freundlicherweise unterstützt durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).

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    Materialien

    11811031
    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    Bakterien- und Hefestämme
    E. coli BL21 DE3(Gold)Aligent Technologies230130
    S. cerevisiae BY4742EuroscarfY10000
    S. cerevisiae BY4742 DeletionsmutantenDharmaconYSC1054gesamte Kollektion
    NameCompanyKatalognummer<>Kommentare
    Plasmide, die in diesem Protokoll verwendet werden
    pET24a(+) (Novagen)Millipore69772-3
    pET-RTA(His6)Becker et al. (2016)3
    NameCompanyKatalognummerComments
    Reagenzien
    Zymolyase 20TUSBioZ1000.250lytisches Enzym für die Zellwand Entfernung
    LB Bouillon MediumThermo Scientific1085502115 g Agar wurde für die Plattenherstellung hinzugefügt
    YNBThermo ScientificDF0335-15-9
    AmmoniumsulfatSigma-AldrichA4418-100G
    Hefe Drop-out Mix Supplemts ohne LeucinSigma-AldrichY1376-20G
    AgarSigma-Aldrich05040-100G
    D-GlukoseSigma-AldrichG8270-100G
    DTTSigma-Aldrich10197777001
    D-RaffinoseSigma-Aldrich83400-25G
    D-SorbitSigma-AldrichS1876-1KG
    D-GalaktoseSigma-AldrichG0750-10MG
    G418Thermo Scientific
    IPTGSigma-AldrichI6758-1G
    ImidazolRoth3899.1
    PAGE Lineal vorgefärbtFermentas26616Proteinleiter für die westliche Analyse
    NameCompanyKatalognummerKommentare
    Material für RTA-Reinigung, Entsalzung und Reader-Messungen
    Spektralphotometer Ultrospec 2100 proAmersham
    Soniprep 150altes Modell, andere Modelle verfügbar
    Fluoroskan AscentThermo Scientific5210470altes Modell, nicht mehr
    lieferbar& Auml; KTAPurifierThermo Scientific28406266Produkt wird abgekündigt und ersetzt
    HisTRAP HP SäuleGE Healthcare17-5248-02
    HiTRAP EntsalzungssäuleGE Healthcare11-0003-29
    Midisart SterilfilterSartorius16534K0,2 µ m Porengröße
    BCA Protein Assay KitPierce23225
    660 nm Assay KitThermo Scientific22660
    96 Well PlattenThermo Scientific260860
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    Antikörper (optional)
    Anti-Tetra-HisQiagen34670Primärantikörper; 1:1.000 Verdünnung
    Anti-Maus-HRPSigma-AldrichA9044-2MLSekundärantikörper, 1:10.000 Verdünnung

    Referenzen

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