Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

Zusammenfassung

In der Handschrift beschreiben wir die Verwendung eines Hefe-basierte Fluoreszenz Reporter Assays, zelluläre Komponenten des Menschenhandels beteiligt und Tötung Prozesse von der zytotoxischen eine Untereinheit der Pflanze Toxin Rizin (RTA) zu identifizieren.

Zusammenfassung

Bakterien- und Werk A / B Toxine nutzen die natürlichen Handel Wege in eukaryotischen Zellen, deren intrazellulären-Zielen in das Zytosol zu erreichen und letztlich töten. Solche A / B Toxine bestehen in der Regel von einer enzymatisch aktive Asubunit (z.B. Ricin Toxin (RTA)) und mindestens eine Zelle, die Bsubunit(s), die verantwortlich sind für Toxin Bindung an bestimmte Oberfläche Rezeptoren Zelle binden. Unseren derzeitigen Kenntnissen wie A / B-Toxine sind in der Lage, effizient berauschenden Zellen half Wissenschaftler um grundlegenden zellulären Mechanismen wie Endozytose und intrazelluläre Protein Sortierung in höhere eukaryotische Zellen zu verstehen. Aus medizinischer Sicht ist es ebenso wichtig, die großen Toxin Handelsrouten, angemessene Behandlungslösungen für Patienten zu finden oder entwickeln schließlich therapeutische Toxin-basierten Anwendungen für die Krebstherapie zu identifizieren.

Seit genomweite Analysen von A / B Toxin in Säugetierzellen Menschenhandel ist komplex, zeitaufwändig und teuer, mehrere Studien an A / B Toxin Transport bei Modellorganismus der Hefe Saccharomyces Cerevisiaedurchgeführt wurden. Obwohl Sie weniger komplex, grundlegende zelluläre Prozesse in Hefe und höhere eukaryotische Zellen sind ähnlich und sehr häufig Ergebnisse, die in der Hefe die Säugetier-Situation übertragbar auf.

Hier beschreiben wir einen schnell und einfach zu bedienen-Reporter Assay zur Analyse der intrazellulären Handel mit RTA in der Hefe. Ein wesentlicher Vorteil des neuen Tests ist die Möglichkeit, nicht nur RTA Retro-Translokation aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol zu untersuchen, aber eher Endozytose und retrograde Toxin transport von der Plasmamembran in der Notaufnahme. Der Test nutzt ein Reporter Plasmid, die indirekte Messung der RTA Toxizität durch Fluoreszenzemission von das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann nach der in-Vivo -Übersetzung. Da RTA effizient die Einleitung der Protein-Biosynthese von 28 s rRNA Depurinierung verhindert, ermöglicht dieser Assay die Identifikation von Host Zellproteinen intrazellulären RTA-Beförderung durch die Erkennung von Veränderungen in Fluoreszenzemission.

Einleitung

Patienten mit Infektionen durch Toxin produzierenden Bakterien stellen eine schwere medizinische und finanzielle Belastung für jeden sozialen Gesundheitssystem, insbesondere, da effiziente therapeutische Behandlungen noch weitgehend fehlen. Entwicklung neue therapeutische Strategien, die komplexe Rausch-Mechanismen der medizinisch relevanten A / B Giftstoffe wie Cholera Toxin oder Shiga Toxin Rizin vollständig verstanden werden, auf molekularer Ebene basierend auf neuartige leistungsfähige Assays, die umgesetzt werden müssen.

In den letzten Jahren mehrere Studien versucht, analysieren, A / B Toxin Transport in Hefe und Säugerzellen mit Zeit....

Protokoll

Hinweis: Eine Übersicht über die allgemeine experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

Achtung: RTA ist sehr giftig für den Menschen. Sicherheit Labor Erlaubnis S2 (Biosafety level 2 Äquivalent) ist erforderlich. Bitte tragen Sie Handschuhe während des gesamten Experiments.

(1) heterologen Expression von sein-tagged RTA in Escherichia coli

1. E. Coli Zellen mit Ausdruck Plasmid pET24-RTA_{(His) 6} oder leerer Vektor pET24a⁽⁺⁾ mit standard Elektroporation Protokolle^9,10....

Ergebnisse

Die allgemeine Workflow des Protokolls beschrieben in diesem Manuskript wird in Abbildung 1, etwa fasst die einzelnen Schritte zur erfolgreichen RTA-Reinigung und das anschließende GFP Reporter Assay Experiment veranschaulicht. Eine ausführlichere Beschreibung jedes einzelnen Schritts finden Sie im Protokoll. Abbildung 2 zeigt das erwartete Ergebnis des erfolgreichen RTA Reinigung durch Affinitätschromatographie (

Diskussion

Wenn Sie die oben genannten Protokoll durchführen, empfehlen wir die folgenden Vorschläge zu ein erfolgreiches Ergebnis des Experiments zu erreichen.

Für heterologe Proteinexpression ist es wichtig, die IPTG-Konzentration von 1 mM nicht überschreiten. IPTG Konzentrationen > 1 mM zu hemmen, Promotor-induzierte RTA Ausdruck und führen zu geringeren Erträgen Toxin. Darüber hinaus sollten Zellen bei Temperaturen über 28 ° C zur Verhinderung Einbeziehung Körper Bildung, ineffiziente Falten und .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bakterien- und Hefestämme
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 Deletionsmutanten	Dharmacon	YSC1054	gesamte Kollektion
Name	Company	Katalognummer	<>Kommentare
Plasmide, die in diesem Protokoll verwendet werden
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Katalognummer	Comments
Reagenzien
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytisches Enzym für die Zellwand Entfernung
LB Bouillon Medium	Thermo Scientific	10855021	15 g Agar wurde für die Plattenherstellung hinzugefügt
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammoniumsulfat	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Hefe Drop-out Mix Supplemts ohne Leucin	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-Glukose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-Raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-Sorbit	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-Galaktose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazol	Roth	3899.1
PAGE Lineal vorgefärbt	Fermentas	26616	Proteinleiter für die westliche Analyse
Name	Company	Katalognummer	Kommentare
Material für RTA-Reinigung, Entsalzung und Reader-Messungen
Spektralphotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150			altes Modell, andere Modelle verfügbar
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	altes Modell, nicht mehr
lieferbar& Auml; KTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Produkt wird abgekündigt und ersetzt
HisTRAP HP Säule	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP Entsalzungssäule	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart Sterilfilter	Sartorius	16534K	0,2 µ m Porengröße
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225
660 nm Assay Kit	Thermo Scientific	22660
96 Well Platten	Thermo Scientific	260860
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikörper (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	Primärantikörper; 1:1.000 Verdünnung
Anti-Maus-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	Sekundärantikörper, 1:10.000 Verdünnung