Methodenartikel

Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

DOI:

10.3791/56589

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8. Januar 2018

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1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir eine dreidimensionale Kultur-Methode, um die Morphologie des primären Brustkrebs-Zellen, sowie deren direkte/indirekte Wechselwirkungen mit Monozyten und die Ergebnisse wie Kollagen-Abbau, Immunzelle Rekrutierung, Zelle studieren analysieren Invasion, und Förderung der Krebs-in Verbindung stehenden Entzündung.

Zusammenfassung

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Eingebettet in die extrazelluläre Matrix (ECM), normale und neoplastische epitheliale Zellen eng mit hämatopoetischen und nicht blutbildenden Zellen so stark beeinflussen Normalgewebe Homöostase und Krankheit Ergebnis kommunizieren. Bei Brustkrebs spielen Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) eine entscheidende Rolle im Krankheitsverlauf, Metastasierung und Wiederholung; Daher ist es wichtig zur Bekämpfung der Krankheit, Verständnis der Mechanismen des Monocyte Chemoattraction Tumor Mikroumgebung und deren Wechselwirkungen mit Tumorzellen. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung eines dreidimensionalen (3D) Kokultur Systems von menschlichen Brustkrebszellen (BrC) und menschlichen Monozyten. BrC-Zellen produziert hohe basale geregelten auf-Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert (RANTES), Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), während in Kokultur mit Monozyten, Pro-inflammatorische Zytokine Interleukin (IL) -1 Beta (IL-1β) und IL-8 wurden zusammen mit Matrix-Metalloproteinasen (MMP)-1, MMP-2 und MMP-10 bereichert. Dieser Tumor Stroma Mikroumgebung gefördert Widerstand gegen Anoikis in MCF-10A 3D Azini-ähnliche Strukturen, Chemoattraction von Monozyten und Invasion der aggressiven BrC Zellen. Die hier vorgestellten Protokolle bieten eine kostengünstige Alternative zur Intra-Tumor Kommunikation studieren und sind ein Beispiel für das große Potenzial, das in-vitro- 3D Zellsysteme bereitstellen, um die Besonderheiten der Tumorbiologie im Zusammenhang mit Tumor zu verhören Aggression.

Einleitung

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Tumorbiologie ist weit komplizierter, als bisher angenommen. Montage Beweise zeigt, dass Tumorzellen mehr als eine bloße Bulk unkontrolliert wuchernde Zellen; Vielmehr scheinen verschiedene neoplastische Zellen verschiedene Aufgaben anzeigen hoher Organisation und Hierarchie innerhalb der Tumor-1. Tumorzellen sind auch in intime Kommunikation mit nicht-transformierten Zellen: Makrophagen, Endothelzellen, Fibroblasten, Lymphozyten, Fettzellen zwischen den anderen Zellen sind alle eingetaucht in das Gerüst Proteine und Polysaccharide, die das ECM darstellen. Zahlreiche direkte und indirekte Wechselwirkungen entstehen zwischen den transformierten und nicht-transformierten Zellen und mit der ECM, die einen starken Einfluss auf die Krankheit Ergebnis2,3ausübt. Im konkreten Fall des BrC ist es besonders wichtig, die Kommunikation der BrC Zellen mit TAMs, wenn man bedenkt, dass TAMs gefunden wurden, um eine entscheidende Rolle in der Entwicklung des Tumors, wodurch das Risiko von Metastasen und Wiederauftreten der Krankheit4 zu zergliedern ,5.

Intra-Tumor Interaktionen und ihre möglichen Ergebnisse zu analysieren, neue 3D in-vitro- Ansätze wurden basierend auf den Einsatz von ECM-Extrakte, die eine sehr viel komplexere Mikroumgebung bieten näher an der Realität der Tumorbiologie, im Vergleich zu die konventionelle Monolage Zellkulturen, in denen die Zellen wachsen, befestigt an Kunststoff. Petersen und Bissell6 hat das erste Modell der Vorsteherdrüse und bösartige Mamma Epithelzellen kultiviert auf einer Basalmembran Laminin-reiche und waren die ersten, die 3D organotypischen Strukturen zu beschreiben, die Vorsteherdrüse Menschen diskriminieren Brust Epithelzellen von ihren bösartigen Pendants. Ein Jahrzehnt später, das Modell von Debnath, Muthuswamy, entwickelt und Brugge7,8,9 vorgesehen ein wertvolles Instrument um die biologischer Signalwege beeinträchtigt bei malignen Transformation von Drüsen Azini, erhellen diese als große Azini Formation durch Wildwuchs, Verlagerung der tight Junction-Proteine als Beweis für Sehbehinderte Zelle Polarisation und Verlust der Azini Lumen durch Zellresistenz, Anoikis, tritt ein programmierter Zelltod, die in Anchorage-abhängige Zellen, wenn sie von den umliegenden ECM zu lösen. Die Modelle der Sameni, Jedeszko und Sloane konzentrierten sich auf bildgebende proteolytische Aktivität von Zellen, die Invasivität, eine weitere wichtige Eigenschaft von Tumor Malignität10,11,12in engem Zusammenhang. Diese Modelle setzen auf Protein-Matrizen mit verschiedenen Fluoreszenz abgeschreckt Protein Substrate gemischt (DQ-Gelatine, DQ-Kollagen I und DQ-Kollagen IV), in welche fluoreszierende Signale sind bezeichnend für den proteolytischen Abbau von Kollagen. 3D-Modelle kann werden auch verwendet, um Stammzellen Eigenschaften beider nicht transformiert und Tumorzellen, in welcher Zelle Aggregate, auch genannt Sphäroide zu studieren, kultiviert in Suspension oder ECM-ähnliche Proteine für Mechanismen der Zelldifferenzierung, asymmetrische Verhören Zellteilung, Einhaltung von Zelle zu Zelle und Zelle Motilität13,14. Invasion-Assays ermöglichen testen die innere Aggressivität des Tumors und die Identifikation der Moleküle, die als Chemoattractants während der invasiven Verfahren15 dienen. Insgesamt, 3D Modelle repräsentieren eine erschwingliche Diversifikation in Vitro Zellkultur, die normal und onkogenen Gewebe Morphogenese genauer zu reflektieren.

Wir haben ein 3D Co Zellkultursystem basierend auf der oben genannten Modelle7,10,11, entworfen mit beiden menschliche kommerzielle BrC Zelllinien des bekannten aggressiven Potenzial (luminalen und Triple-negativen Typen) und primäre Zellen von BrC Patienten explantiert. Wir zuerst ein Modell entwickelt, wo waren entweder nicht-aggressive (MCF-7) oder aggressive (MDA-MB-231) BrC Zellen Co kultiviert mit U937 Monozyten im Auszug extrazelluläre Matrix (ECME)-basierten 3D System, das erlaubt direkten Zell-Zell-Interaktionen. Diese Ko-Kulturen wurden verwendet, um festzustellen, wie die Kommunikation zwischen diesen beiden Linien die Transkription einer Reihe von Genen im Zusammenhang mit Krebs aggressives Verhalten beeinflusst. Eine deutliche Steigerung der Cyclooxygenase-2 (COX-2) Abschrift wurde beobachtet, die fiel mit einer erhöhten Produktion von eines seiner Produkte, Prostaglandin E2 (PGE2), ein Befund, die die Rolle der Entzündung in der Tumorprogression hervorgehoben. Erhöhter Transkription von MMP wurde auch beobachtet, dass mit mehr Kollagen Proteolyse korreliert, wenn aggressive MDA-MB-231 Zellen zusammen mit U937 Monozyten in DQ-Kollagen IV-haltigen Kulturen gezüchtet wurden. Der Hinweis unterstützte unsere Ko-Kulturen nicht die Annahme, dass Zell-Zell-Interaktion-Mechanismen für den Abbau von Kollagen benötigt werden. Es schlug eher, dass die Kommunikation zwischen den beiden Linien durch sekretierten Moleküle vermittelt wurde. Darüber hinaus enthalten die Überstände geerntet aus dieser Kokultur Assays lösliche Faktoren, die Drüsen gebildet durch nicht-transformierten MCF-10A Zellen13Azini unorganisiert. Es wurde festgestellt, dass aggressive und primäre BrC Zellen abgesondert erhöhte Niveaus der Monocyte chemotaktische Moleküle MCP-1, GM-CSF und RANTES. So skizziert wir eine 3D Culture in der Zellen in Zelle Kultur Einsätze, Zell-Zell-Interaktionen zu verhindern getrennt wurden. Diese Kulturen wurden verwendet, um die indirekte Kommunikation zwischen BrC Zellen und Monozyten zu adressieren. Für diese Tests, nicht-aggressive und aggressive kommerzielle BrC-Zell-Linien und primären BrC Zellen und drei verschiedene Arten von menschlichen Monozyten: kommerzielle U937 und THP-1 Zellen und primäre Monozyten (PMs) aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern (alle isoliert Monozyten im nicht aktivierten Zustand verwendet wurden) wurden verwendet. Erhöhte Konzentrationen von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-8 wurden beobachtet, um in Kokultur angereichert werden. Ebenso wurde festgestellt, dass MMP-1, MMP-2 und MMP-10 auch in der BrC-Zellen-Monocyte-Ko-Kulturen und damit verstärkenden zurück Ergebnisse14erhöht wurden. In diesem Manuskript ist ein Punkt-für-Punkt-Workflow Erstisolierung BrC Zellen und Erprobung in 3D Kulturen zusammen mit repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Diese Arbeit ist ein gutes Beispiel für das große Potenzial, das in-vitro- 3D Zellsysteme bereitstellen, um spezifische Aspekte der Tumorbiologie zu befragen.

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Protokoll

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Proben von BrC Patienten wurden von der Gewebebank der Unidad de Investigación En Virología y Cáncer, Krankenhaus Infantil de México Federico Gómez erhalten. Diese Studie wurde von der wissenschaftlichen genehmigt, ethische und Biosicherheit review Boards der Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética de Investigación und Comité de Bioseguridad. Alle Patienten wurden prospektiv eingeschrieben und informierten sich über die Art der Studie: diejenigen zur Teilnahme bereit unterzeichnet eine schriftliche Einwilligungserklärung vor der Probenentnahme und wurden nach den ethischen Richtlinien und am besten klinischen Praxis behandelt die Institution. Die Identität der Teilnehmer war für die Dauer der Studie anonymisiert. Eingeschlossenen Patienten wurden mit invasives Duktales Karzinom, histologische Grad 2 und klinische Phase II, mit keine vorherigen neoadjuvante Therapie vor Resektion Gewebe diagnostiziert. Patienten waren alle Frauen im Alter von durchschnittlich 56,8 Jahre alt (Bereich 42 bis 75)14.

1. 3D Zellkulturen

  1. Samen 0,1 x 106 MCF-10A Zellen oder primäre BrC in 25 cm2 Kulturflaschen mit DMEM/F12 Kulturmedium ergänzt mit 5 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 100 ng/mL Cholera Toxin, 0,5 µg/mL Hydrocortison, 10 µg/mL Insulin und 20 ng/mL des Epidermal Growth Factor (EGF). 0,1 x 106 kommerzielle BrC Samenzellen, MCF-7 Zellen und MDA-MB-231 Zellen in 75 cm2 Kultur Fläschchen mit Kulturmedium DMEM/F12 mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt. Inkubation bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
  2. Spülen Sie nach 48 h die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL von sterilen 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Trypsinize die Zelle Monolage mit 3 mL Lösung 0,05 % Trypsin und 0,48 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Fügen Sie 200 µL des entsprechenden Serums, Trypsinization zu stoppen und 7 mL Medium ohne Zusätze. Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren und entfernen Sie ein Aliquot von 10 µL Zellen in einer Neubauer-Kammer zu zählen.
  3. Verbreiten Sie in jede Vertiefung eine Folie 8-Brunnen Kammersystem eine 40 µL Basis von reinen ECME, gefolgt von einer Inkubationszeit von 30 min bei 37 ° C.
  4. In jede Vertiefung Platzzellen 800 Nukleinsäuretablette in 400 µL DMEM/F12 (ohne Phenol rot) ergänzt, wie in Schritt 1.1 aber mit folgenden Änderungen: für primäre BrC Zellen und MCF-10A, fügen Sie 4 ng/mL von EGF und 2 % ECME; für MCF-7 und MDA-MB-231, fügen Sie nur 2 % ECME.
  5. Inkubieren Sie Kulturen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung. Nährmedien alle 48 h zu ersetzen.
  6. Datensatz morphologische Änderungen der Zellen alle 24 h für 15 Tage mit einem optischen Mikroskop. Um die Morphologie des primären BrC zu analysieren sind Zellen, MCF-10A und MDA-MB-231 gute Referenz Zelllinien für Beispiele der bestellten acinar Bildung und ungeordneten aggressiven Krebs-ähnliche Strukturen, beziehungsweise.
  7. Erhalten Sie Bilder von Zellen im Hellfeld Mikroskopieren bei 100 X und 200 X Vergrößerung zu, und vergleichen Sie Zellmorphologie mit Referenz MCF-10A und MDA-MB-231-Zell-Linien (Abbildung 1).

2. erhalten primäre Krebszellen von Tumorgewebe

Hinweis: Um zu erhalten verwenden epithelialen Tumorzellen Gewebe aus resezierten Primärtumoren von BrC Patienten mit keine vorherigen neoadjuvante Therapie; vermeiden Sie nekrotischen Bereiche und arbeiten mit einem Minimum von 0,5 cm3 des Tumorgewebes.

  1. Waschen Sie Tumorgewebe mit sterilen 1 X PBS und disaggregieren Sie es mechanisch mit einem Skalpell in 1 – 2 mm Fragmente.
  2. Das Gewebe in einer sterilen 20 mL Glasflasche mit Kappe für 2 h bei Raumtemperatur (RT) mit 2 mL der Lösung folgen zu verdauen: Mischen Sie 1 mg/mL Kollagenase Typ I und 100 U/mL Hyaluronidase in DMEM/F12 mittlere mit 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin , unter ständigem Rühren.
  3. Filtern Sie die entstandene Suspension durch sterilisierte Stücke aus Tüll, große Stücke von unverdauten Gewebe zu beseitigen. Anschließend filtern Sie die Zellsuspension durch eine sterilisierte 100 µm-Poren-Membran.
  4. Pellet-Zellen bei 430 X g für 5 min bei RT und zweimal mit sterilen 1 X PBS waschen. Kultur-Primärzellen in DMEM/F12 Medium mit 5 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 100 ng/mL Cholera Toxin, 0,5 µg/mL Hydrocortison, 10 µg/mL Insulin und 20 ng/mL des EGF ergänzt. Ersetzen Sie das Medium alle 48 h. pflegen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 Kulturen % CO2 -Umgebung.
  5. Sicherstellen Sie, dass die isolierten Zellen epithelialen Zellen mit einem standard Protokoll von Immunocytochemistry14. Testen Sie drei epitheliale Marker: ein Gremium von Cytokeratin (PanCK), Mucin-1 (Muc-1) und Epithelzelle Adhäsionsmolekül (EpCAM).

(3) PM Zellen aus peripherem Blut zu isolieren.

  1. Auszug ca. 40 mL des peripheren Blutes aus einer gesunden Freiwilligen, verdünnen das Blut in einem Verhältnis von 1:3 mit sterilen Endotoxin-frei 1 X PBS und ein gradient Dichtetrennung unterziehen.
  2. Legen Sie in einem konischen Rohr 2 mL Polysucrose und Natrium Diatrizoate Medium mit einer Dichte von 1,077 g/mL. Überlagern Sie vorsichtig und langsam 8 mL verdünnte Blut. Zentrifuge für 30 min, 765 X g bei RT. Verwendung der langsamsten Geschwindigkeit der Beschleunigung-Verzögerung der Zentrifuge.
    Hinweis: Nach der Zentrifugation vier Schichten gebildet werden von unten nach oben: die roten Blutkörperchen Pellet, mittlere Dichte Verlaufsebene, die mononukleären Zellen-Schicht (es erscheint als einen feinen weißen Ring) und der Plasmaschicht.
  3. Sorgfältig die mononukleären Zellschicht aus den Gradienten mit einem sterilen Pasteurpipette abrufen und waschen Sie sie dreimal mit 1 X PBS, jeweils gefolgt von langsamer Zentrifugation (430, 275 und 191 X g) für 10 min bei RT
  4. Verwenden Sie negative Auslese Protokolle zur Aktivierung der Zellen zu vermeiden. Ein Beispiel für ein solches Protokoll ist Folgendes:
    1. Waschen Sie die mononukleären Zellen einmal mit einer gepufferten Waschlösung (0,5 % Rinderserumalbumin, 2 mM EDTA in 1 X PBS). Zählen der Zellen in einer Neubauer-Kammer und eine Dichte von 1 x 107 Zellen/30 µL einer gepufferten Lösung anzupassen.
    2. Fügen Sie für jeden 1 x 107 Zellen 10 µL einer FcR Sperrung Reagenz und 10 µL eines Monocyte-Biotin-Antikörper-Cocktails, die Anti-Human-CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 und Glycophorin A (im kommerziellen Kits enthalten) enthält.
    3. Mischen Sie die Zellen und 15 min bei 4 ° c inkubieren Fügen Sie eine zusätzliche 30 µL gepuffert Waschlösung plus 20 µL Anti-Biotin Microbeads (im Kit enthalten); Zellen zu mischen und 20 min bei 4 ° c inkubieren
    4. Waschen der Zellen einmal mit einer gepufferten Lösung Zentrifugieren bei 430 X g für 5 min bei RT und in 1,5 mL Aufschwemmen gepufferte Lösung für magnetische Trennung.
    5. Laden der Zellsuspension auf eine vorab gespült magnetische Trennsäule und 7 mL gepufferten Lösung. Sammeln der Monocyte angereicherte Fraktion in einem 15 mL konische Röhrchen, die Zellen zu zählen und wenn nicht sofort kultiviert, Einfrieren Monozyten bei einer Dichte von 2 x 106 Zellen/1 mL DMEM/F12 Medium ergänzt mit 50 % FBS und 10 % DMSO bei −80 ° C.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung Monozyten nach mehr als 2 Monaten einzufrieren, da ihre Lebensfähigkeit gefährdet werden kann.
  5. Pflegen Kulturen von PMs in DMEM/F12 Medium ergänzt mit 6 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin, bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
  6. Führen Sie jede Reihe von Experimenten mit PMs von mindestens zwei verschiedenen Spendern unabhängig, wie pooling Monozyten von verschiedenen Spendern Monocyte Aktivierung führen können.

4. Aufbau 3D Co Kulturen

  1. 3D Ko-Kulturen mit der indirekten Interaktion
    Hinweis:     führen Sie diese Tests in 24 wohlen flach-Boden Kultur Platten mit Polycarbonat Zelle Kultur Einsätze mit Membranen von 0,4 µm Porengröße. In diesem Test können Überstände und Zellen am Ende des Experiments abgerufen werden.
    1. 2 x 106 U937 und THP-1 Monozyten in 10 mL RPMI 1640 Medium ergänzt um 10 % zu kultivieren FBS, 1 % Antibiotikum/antimykotische, und kultivieren Sie frische PMs in ergänzt DMEM/F12-Medium (wie bereits zuvor in Schritt 3.5), bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Umgebung.
    2. Platte 4 x 105 Monozyten in 1 mL/auch des entsprechenden Mediums (ergänzt mit 2 ECME und 2 % FBS Monozyten U937 und THP-1, oder 2 % ECME und 6 % FBS für PMs).
    3. Legen Sie einen Einsatz in jede Vertiefung und 0,9 mL 4 x 105 BrC Zellsuspension in das entsprechende Medium (ergänzt mit 2 ECME und 2 % FBS für kommerzielle Zelllinien oder 5 % Pferd Serum für primäre BrC-Zellen). Ersetzen Sie Hälfte der gesamten Medien alle 48 h.
    4. Inkubation bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung für 5 Tage und die Überstände zu erholen. Rufen Sie Zellen durch Trypsinization ab, wenn nachfolgende Analyse durchgeführt wird.
    5. Enthalten Sie Steuerelemente von einzelnen Zellkulturen mit den jeweiligen Medien.
  2. 3D Ko-Kulturen mit direkter Interaktion
    1. Beschriften Sie BrC Zellen und Monozyten mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen vor Zellkultur ermöglicht unabhängige Sortierung von jeder Zelle Abstammung nach Kultur für die Analyse von mRNA und Protein-Expression. Verwenden Sie handelsübliche Derivate von Cumarin und Rhodamin, die frei durch die Zellmembran lebender Zellen bestehen. Ein allgemeines Protokoll für die Kennzeichnung lautet wie folgt:
      1. Bereiten Sie eine Monolage BrC Zellen von Interesse (2 × 106 Zellen in einem 25 cm2 Kultur Kolben) und ersetzen Sie die standard-Medium mit ausreichend vorgewärmt Arbeitslösung der Fluoreszenzfarbstoff (1:2 000 der Fluoreszenzfarbstoff in standard-Basis-medium ohne jede Ergänzung). Inkubieren Sie 30 min bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung. Die Farbstofflösung Aspirieren und spülen Sie Sie mit der ausreichenden sanft 1 X PBS. Aspirieren der PBS und fügen Sie die standard-Medium.
      2. Trypsinize die Zelle Monolage mit 2 mL einer Lösung von 0,05 % Trypsin und 0,48 mM EDTA für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Fügen Sie 200 µL der FBS, Trypsinization zu stoppen und 7 mL des entsprechenden Mediums ohne Zusätze. Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL Zellen in einer Neubauer-Kammer zu zählen. Fahren Sie mit der Kokultur Protokoll nach Zellzählung.
      3. Pellet-Zellen bei 430 X g für 5 min bei RT (führen Sie die erste da Monozyten in Suspension wachsen). Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie sanft Zellen mit 3 mL einer vorgewärmten Arbeitslösung der Fluoreszenzfarbstoff (1:2 000 der Fluoreszenzfarbstoff in einem standard Basis Medium ohne Zusätze). Inkubation für 30 min bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
      4. Pellet-die Zellen wieder verwerfen die Farbstofflösung arbeiten und sanft mit 5-7 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Pellet-einmal mehr, die PBS zu verwerfen und Aufschwemmen Zellen in ca. 5-7 mL standard-Medium. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL Zellsuspension auf Zellen in einer Neubauer-Kammer zählen. Fahren Sie mit der Kokultur Protokoll nach Zellzählung.
    2. Legen Sie die Kokultur wie folgt:: genug ECME an der Unterseite des Brunnens zu einer gleichmäßigen Schicht in jede Vertiefung eine Folie 4-Well Kammersystem zu verbreiten. Platte 20 µL einer einzelnen Zelle Suspension mit 5 × 105 BrC Zellen pro Bohrloch beschriftet.
    3. Nach 15-20 min Inkubation bei 37 ° C, hinzufügen eine Suspension von 2,5 x 105 beschriftet Monozyten in 80 µL Assays Medium (ergänzt mit 60 % ECME).
    4. Lassen Sie ECME, 15-20 Minuten bei 37 ° c erstarren
    5. Fügen Sie 1 mL einer 1:1 Mischung der BrC Zellen und Monocyte Nährmedien.
    6. Inkubieren Sie Ko-Kulturen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung für 24 h, 48 h oder 5 Tage zum Nachverfolgen von Änderungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
    7. Verschlechtern Sie ECM Proteine um die Zellen von den Kulturen zu erholen. Aspirieren Sie und entsorgen Sie das Medium geben Sie 0,5 mL 1 X PBS mit Trypsin 0,1 % und 0,25 % EDTA hinzu und 3 h bei 37 ° c inkubieren Nach der Inkubation hinzufügen 0,5 mL 1 X PBS mit 10 % FBS zu neutralisieren die Trypsin, Aufschwemmen der Zellen durch Pipettieren kräftig um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.
    8. Pellet-Zellen bei 765 X g für 5 min bei RT, den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL 1 X PBS mit 10 % FBS. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
    9. Vorbehaltlich der Zellsuspension Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) mit dem entsprechenden Instrument. Sicherstellen Sie, dass die endgültige Bevölkerung mindestens 95 % rein).
    10. Nach dem sortieren, waschen Sie die Zellen mit sterilen 1 X PBS, Pellet (430 X g für 5 min bei RT), und in sterilen 1 X PBS Aufschwemmen. Zellen können nach bestimmten Protokollen für RNA Isolierung oder Protein-Analyse verarbeitet werden.
    11. Wiederholen Sie jeder Test dreimal, einschließlich 3D Kulturen von jeder einzelnen Zelle Abstammung als Kontrollen.
  3. Direkte Interaktion der 3D Ko-Kulturen zu beurteilen, Kollagen-Abbau
    1. 3D Co Zellkulturen zu etablieren, wie unter Punkt 4.2, mit den zusätzlichen Schritt des Hinzufügens von 32,5 µg/mL Typ IV Kollagen beschriftet mit Fluorescein erfolgt auf der ECME beschrieben. Die Endkonzentration von Kollagen IV in der ECME beträgt 0,5 %. Wachsen Sie die Kulturen in einem 35-mm-Deckgläschen in einem Petrischalen gelegt.
    2. Verteilen Sie eine Schicht von 40 µL ECME in den Boden der Petrischale. Lassen Sie ECME, bei 37 ° c erstarren
    3. 2.5 x 105 BrC Zellen in 10 µL des Mediums und Zellen zu beruhigen.
    4. Fügen Sie eine Suspension von 1,25 x 105 U937 Monozyten in 40 µL Assays Medium (ergänzt mit 60 % der DQ-Kollagen IV mit der Bezeichnung ECME).
    5. Lassen Sie ECME, 15-20 Minuten bei 37 ° c erstarren
    6. 2 mL einer 1:1 Mischung aus BrC Zellen und Monocyte Nährmedien hinzugeben.
    7. Inkubieren Sie die Ko-Kulturen für 5 Tage bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung. Nährmedien alle 48 h zu ersetzen.
    8. Analysieren Sie die Fluoreszenzemission in einem konfokalen scanning Mikroskop und Messen Sie die integrierte optische Dichte (IOD) pro 50 µm2 Kultur. Vergleichen Sie IODs gegenüber einzelnen Kulturen und die Kultur zum Zeitpunkt Null (Abbildung 2).

5. Analyse der Überstände von 3D Kulturen gemeinsam mit indirekten Interaktion

  1. Nach 5 Tagen Kokultur Wiederherstellen der Überstände aus der oberen und die unteren Fächer der 3D Ko-Kulturen und von den einzelnen 3D Culture-Steuerelementen. Mischen Sie nun jede Überstand durch pipettieren. Aliquoten und Store der Überstand bei −20 ° C bis zur Verwendung (bis zu einem Monat).
    Hinweis: Halten Sie Überstände bei −80 ° C, wenn Lagerung länger als einen Monat sein wird.
  2. Analysieren Sie die Überstände mit multiplexing Assay Plattformen, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) oder Wulst-basierten Immunoassays nach dem Hersteller empfohlenen Verfahren.
    Hinweis: Überstände können auch von Western-Blot analysiert oder konzentriert durch spezifische Pore Filter Größe bereichert Proteinfraktionen ausführen Zymography Analyse16,17zu erhalten. Alternativ können Sie die Überstände als konditionierte Medien für andere Experimente, wie unten beschrieben. Konditionierte Medien erhält in der Regel aus einer 5-Tage-Kultur (Abbildung 3).

6. Charakterisierung der Effekte Überstände aus primären BrC Zellen auf Azini Entstehung und Struktur der Azini

  1. In jede Vertiefung einer Folie 8-Well-Kammer System verbreiten eine 40 µL-Basis von ECME und lassen Sie es für 30 min bei 37 ° c zu festigen
  2. Samen 800 MCF-10A Zellen/gut in 400 µL ergänzt DMEM/F12 Kulturmedium, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  3. 400 µL konditionierten Medien oder ergänzten DMEM/F12 Kulturmedium mit 20 ng/mL des menschlichen rekombinantes IL-1β hinzufügen.
  4. Ort der Kammer-Folie in eine Glas-Petrischale mit einer 35 mm-Petrischale gefüllt mit 2 mL PBS, eine feuchte Umgebung zu schaffen.
  5. Medien/überstand alle 48 h zu ersetzen.
  6. Erfassen Sie glanduläre Azini Bildung alle 24 h für 14 Tage mit einem optischen Mikroskop.
  7. Nach 14 Tagen der Kultur, Fleck Azini mit 100 µL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in einer Konzentration von 100 nM in 1 X PBS, Zellkerne zu beobachten. 25 min bei RT in ständigem Rühren inkubieren. Spülen Sie dreimal mit 1 X PBS für 5 min, jedes Mal in ständigem Rühren an RT. Mount mit einem Eindeckmittel spezifische Vorbereitung fluoreszierende Färbung. Mit transparenten Lack zu versiegeln und pflegen lichtgeschützt bei 4 ° C.
  8. Analysieren Sie die Azini mit einem konfokalen Mikroskop Aufnahmen von transversalen Stacks in unterschiedlichen Tiefen der Azini (Abb. 4A, B, C).
  9. Visualisieren Sie verschiedene zelluläre Proteine in den Azini mit richtigen Färbung Protokolle. Zum Beispiel war E-Cadherin gefärbt, zur Beurteilung von Zelle zu Zelle Adhäsion, Zellpolarität und/oder Lumen Bildung18 (Abbildung 4D).

(7) Migration Assays

Hinweis: Migration-Assays von U937 durchführen, THP-1 und frischen PMs in 24 wohlen flach-Boden-Kultur-Platten aus Polycarbonat mit Zell-Kultur-Einsätze mit Membranen von 8 µm Porengröße. Es wurde bereits gezeigt, dass die Chemokine GM-CSF, MCP-1 und RANTES abgesondert in hohen Konzentrationen in den einzelnen 3D Kulturen die aggressive BrC-Zell-Linien gefunden wurden. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Zytokine kritisch zur Gewinnung von Monozyten auf der Website des Primärtumors waren; Dies war im Migration-Assays mit der Zytokine als Chemoattractants getestet.

  1. Kultur U937, THP-1 oder frische PMs wie in Schritt 4.1.1 beschrieben.
  2. Spülen Sie einmal jeder Einsatz mit 200 µL RPMI 1640 ohne Sera Membran Hydrat.
  3. Füllen Sie es mit 50 µL der kalten ECME, legen Sie die Einsätze in einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte und ermöglichen Sie die ECME polymerisieren für 1 h bei 37 ° C.
  4. Fügen Sie 180 µL RPMI ohne FBS im oberen Fach der Platte. Fügen Sie in die untere Kammer ohne sprudelnden 800 µL RPMI ergänzt mit entweder 100 ng/mL von GM-CSF, MCP-1 oder RANTES als Lockstoffgradient. Verwenden Sie Medium ohne die Zytokine als Negativkontrolle. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C, einen Chemokin-Gradienten zu etablieren.
  5. Statt 1,5 x 105 jeder Art von Monocyte in ein steriles Röhrchen, waschen zweimal legen mit 1 mL 1 x PBS und Zentrifuge bei 430 X g für 5 min bei RT Aufschwemmen Monozyten in 20 µL von RPMI ohne FBS, Sie sie in den Einschüben , und sehr sorgfältig homogenisieren die Zellsuspension (der letzte Band der oberen Kammer ist 200 µL).
  6. Ermöglichen die Zellwanderung Fortschritt für 24 h bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
    Hinweis: Wie Monozyten nicht-Anhänger sind, werden wandernden Zellen in der Regel in den Medien von der unteren Fach.
  7. Entfernen Sie die Einsätze, die Medien abrufen und zählen von Zellen auf 2, 4, 6 und 24 h mit einer Neubauer-Kammer oder einem Durchflusszytometer; Alternativ, besonders wenn keine Zellen in den Medien gefunden werden, Abrufen von Bildern des unteren Teils der Einsätze mit einer Digitalkamera. Die mittlere Zellzahl von 3 Zufallsfelder (bei 100 X Vergrößerung) dient der Analyse (Abbildung 5).

(8) Invasion Assays

Hinweis: Führen Sie Invasion Assays der BrC Zellen in Kultur 24 wohlen flach-Boden Platten mit Polycarbonat Zelle Kultur Einsätze mit Membranen von 8 µm Porengröße. In unserer ursprünglichen Studien war IL-8 eines der Zytokine in die Überstände der BrC Zelle/Monocyte 3D Co Kulturen bereichert. Wurde getestet, ob dieses Zytokin bei der Invasion des BrC-Zell-Linien beteiligt war.

  1. BrC Zellen in 75 cm2 Fläschchen zu erweitern. MCF-7, T47D, HS578T und MDA-MB-231 als beschrieben in Schritt 1.2 (aber ohne ECME) und primäre BrC Zellen wie unter Punkt 2.4 beschrieben.
  2. Waschen, sobald jede Zellkultur Polycarbonat 8 µm-Pore Membran einfügen mit 200 µL Medium ohne Sera (das verwendete Medium ist abhängig von der Zelllinie getestet), die Membran zu hydratisieren.
  3. Füllen Sie den Einsatz mit 50 µL der kalten ECME (1:4 Verdünnung ECME:cold Medium ohne FBS), legen Sie die Einsätze in einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte und ermöglichen Sie die ECME polymerisieren für 1 h bei 37 ° C.
  4. Sobald die ECME polymerisiert ist, fügen Sie 180 µL der jeweiligen Zelle Medien ohne FBS. Hinzufügen von 800 µL Medien ohne FBS durch die Schlitze des Einsatzes. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C, eine IL-8 Steigung zu etablieren.
    Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen in den Medien. Verwendeten Medien ohne FBS ist ergänzt mit 100 ng/mL IL-8 als Lockstoffgradient oder reine Medien ohne FBS als Negativkontrollen
  5. Erhalten Sie insgesamt 6 x 105 Zellen jeder Zelle Zeile wie folgt:
    1. Verwerfen Sie Überstände zu, einmal mit 10 mL 1 X PBS spülen Sie ab und fügen Sie 2 mL 0,05 % Trypsin/0,48 mM EDTA für 2 min bei 37 ° C, die Zellen zu lösen. Hinzugeben Sie 4 mL ergänzt Medium, um die Trypsin-Reaktion zu stoppen und erneut kräftig durch pipettieren.
  6. Nehmen Sie 10 µL Zellsuspension auf die Zellen in einer Neubauer-Kammer zählen aliquoten. Nehmen Sie ein Volumen von Zellsuspension mit 6 x 105 Zellen. 430 X g für 5 min bei RT Zentrifugieren, überstand verwerfen und spülen Sie Zellen in 1 mL 1 X PBS. Wiederholen Sie noch einmal die Spülung.
  7. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in den jeweiligen Medien ohne FBS 20 µL und Platz in die Einsätze mit 180 µL des jeweiligen Mediums ohne FBS. Homogenisieren Sie sorgfältig die Zellsuspension durch pipettieren.
  8. Ermöglichen der Zellinvasion zum Fortschritt für 48 h bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
  9. Verwerfen Sie nach 48 h entnehmen Sie den Einsatz überstand und spülen Sie den Einsatz einmal sehr sorgfältig mit 200 µL 1 X PBS. Entfernen Sie mit einem Applikator Baumwolle Spitze das überschüssige von PBS.
    Hinweis: Invasiven Zellen sind in der Regel auf die andere Seite des Einsatzes zu angebracht, wie in diesem Fall, wo Zellen sind Anhänger.
  10. Beheben Sie die Zellen zu, indem man das Einfügen in einen Brunnen einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte mit 1 mL/spülen Sie gut 4 % Paraformaldehyd für 15 min bei RT Afterwards, die Einsätze einmal mit 1 X PBS.
  11. Färben der Zellen durch die Platzierung des Einsatzes in einem Brunnen, einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte mit 1 mL/gut von 1 X PBS mit 0,2 % Kristallviolett für 45 min bei RT. sorgfältig mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator entfernen alle ECME vom oberen Rand der Membran , die enthält Zellen, die nicht migriert haben, und spülen Sie gründlich mit destilliertem Wasser zu beseitigen fixiert invasive Zellen.
  12. Zählen Sie die eindringenden Zellen durch die Beobachtung der unteren Seite des Einsatzes unter den inversen Mikroskop. Die mittlere Zellzahl von 3 Zufallsfelder (bei 100 X Vergrößerung) dient. In Fällen, wo die Zellen eingedrungen als Cluster und sind schwierig zu einzeln zählen, Abrufen von Bildern aus 3 Zufallsfelder (bei 100 X Vergrößerung) mit einer digitalen Kamera. Analysieren Sie die Bilder mit Software für die Bildanalyse und verwenden Sie das IOD um zu quantifizieren Zellinvasion (Abbildung 6).

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Ergebnisse

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Morphologische Analyse des BrC Zellen in 3D Kulturen:

Die Morphologie des primären BrC Zellen wachsen in 3D Kulturen bei niedrigen und hohen dichten wurde über 5 Tage untersucht. Während der ersten 48 Std. Zellen halten die ECME und eine geringe Dichte zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt kann deutlich gewürdigt werden, dass Zellen eine längliche Spindel-ähnliche Form, einige mit zwei oder mehr langen zytoplasmatisc...

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Diskussion

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Epithelzellen wachsen in eine 3D räumliche Konformation und deren Wechselwirkung mit den ECM-Proteinen ist von zentraler Bedeutung für die Gewebe-Homöostase. Viele Krebs-Studien basieren auf Zellen in Monolayer (2D) angebaut und obwohl sie für ein Verständnis von vielen Aspekten der Tumorbildung und Progression entscheidend gewesen sind, kann Monolagen nicht rekapitulieren die Merkmale, denen Zellen, für die ECM auferlegt Instanz: Begrenzung der Verbreitung, Haftung-abhängige Zelle überleben, apikalen basolateralen Polar...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch CONACyT FONSEC SSA, IMSS/ISSSTE Projekt Nr. 233061, Ezequiel M. Fuentes-Pananá und Fondo de Apoyo a la Investigación, Krankenhaus Infantil de México Federico Gómez (Projektnummer HIM-2014-053) unterstützt. Espinoza-Sánchez NA ist Doktorand aus Programa de Doctorado de Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und erhielt der 231663 Stipendium CONACYT. E-S-NA, auch der finanzielle Unterstützung durch das mexikanische Institut der sozialen Sicherheit (IMSS) anerkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
U937American Type Culture Collection ATCC CRL-1593.2Monozytäre Zelllinie/histiozytäres Lymphom
THP-1Amerikanische Schriftkultur-Sammlung ATCC TIB-202Monozytäre Zelllinie/akute monozytäre Leukämie 
MCF-10AAmerikanische Schriftkultur-Sammlung ATCC CRL-10317Nicht transformierte Brustzelllinie
MCF-7Amerikanische Kultursammlung ATCC HTB-22Brustkrebs-Zelllinie
T47DKultursammlung amerikanischer Typ ATCC HTB-133Brustkrebs-Zelllinie
HS578TAmerikanische Kultursammlung ATCC HTB-126Brustkrebs-Zelllinie
MDA-MB-231Amerikanische Typkultur-Kollektion ATCC HTB-26Brustkrebs-Zelllinie
RPMI 1640 mittelGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM Hoher Glukose GIBCO BRL Life Technologies11964-0924,5 g/L Glukose
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
Antibiotikum/AntimykotikumGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/ml Penicillin, 100 & Mikro; g/mL Streptomycin und 0,25 µ g/mL Fungizone
Fötales RinderserumGIBCO BRL Life Technologies16000-044
PferdeserumGIBCO BRL Life Technologies16050114
0,05 % Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (phosphatgepufferte KochsalzlösungGIBCO BRL Life Technologies20012-027
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)PeproTechAF-100-15 (1,00 mg)
InsulinSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
HydrocortisonSIGMA-ALDRICHH088-5G
Choleratoxin Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkom, extrazellulärer Matrixextrakt, Lagerung bei -20 ° G; C bis zur Verwendung bei 4°; C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
KristallviolettHycel Mé xico541
ParaformaldehydSIGMA-ALDRICHP6148
Transwell permeable Stützen (Einsätze)Corning Inc34226,5 mm Durchmesser, 8 & Mikro; M Porengröße/24-Well-Platten 
Transwell permeable Stützen (Einsätze)Thermofisher Scientific1406206,5 mm Durchmesser, 0,4 & Mikro; M Porengröße/24-Well-Platten 
Monozyten-Isolationskit II für MenschenMiltenyi Biotec130-091-153
LS SäulenMiltenyi Biotec130-042-401
Humanes Zytokin/Chemokin Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix mit xPonent Software (laserbasierte fluoreszierende analytische Testinstrumente)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek Kammerobjektträger mit Abdeckung (8 well)Nalge Nunc International177402
Glasboden Mikrowelle 35mm Petri  SchalenMatTek Corp.P35G-1.5-14-C
)

Referenzen

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