Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die direkte und indirekte Kommunikation zwischen primären Brustkrebszellen und Monozyten in einem dreidimensionalen Co-Kultursystem zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der entzündlichen Mikroumgebung des Brustkrebsbereichs zu beantworten, z. B. wie Immunzellen abgebaut und aktiviert werden, wie diese Zellen dazu beitragen, die entzündliche Mikroumgebung des Tumors aufrechtzuerhalten und wie diese Mikroumgebung die Invasion von Tumorzellen erleichtert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine erschwingliche Alternative zur Untersuchung der Intratumorkommunikation darstellt und das Potenzial von in vitro 3-D-Zellsystemen für die Abfrage spezifischer Merkmale der Tumorbiologie veranschaulicht.

Insbesondere solche, die mit Tumoraggression zusammenhängen. Kultivieren Sie zunächst zweimal 10 bis sechs U937- und THP1-Monozyten in 10 Millilitern RPMI1640 Medium, ergänzt mit 10 Prozent FBS und einem Prozent Antibiotikum, Antimykotikum. Kultivieren Sie auch frische PMs in ergänztem DMEMF12 Medium.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit fünf Prozent Kohlendioxid. Platte viermal 10 bis zum fünften Monozyten in einen Milliliter pro Vertiefung des entsprechenden Mediums. Legen Sie in jede Vertiefung einen Einsatz und geben Sie 900 Mikroliter der viermal 10 zur fünften BrC-Zellsuspension in das entsprechende Medium.

Inkubieren Sie die Kulturen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit fünf Prozent Kohlendioxid und bergen Sie die Überstände. Entnahme der Zellen durch Trypsinisierung, wenn eine anschließende Analyse durchgeführt wird. Fügen Sie Kontrollen einzelner Zellkulturen mit den jeweiligen Medien hinzu.

Um BrC-Zellen und Monozyten vor der Zellkultur mit kommerziell erhältlichem Cumerin und Rhodamin zu markieren, bereiten Sie eine Monoschicht von zwei mal 10 bis zur sechsten BrC-Zellen von Interesse vor und ersetzen Sie das Standardmedium durch ausreichende, vorgewärmte Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit fünf Prozent Kohlendioxid für 30 Minuten. Aspirieren Sie dann die Farbstofflösung und verwenden Sie ausreichend XPBS, um die Zellen vorsichtig zu spülen.

Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie das Standardmedium hinzu. Um die Zellen zu trypsinisieren, geben Sie zwei Milliliter 05 Prozent Trypsin und 0,48 millimolare EDTA in den Kolben und inkubieren Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie 200 Mikroliter FBS hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen, und sieben Milliliter des entsprechenden Mediums ohne Zusätze.

Suspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren, übertragen Sie dann 10 Mikroliter der Zellen in eine Nuebauer-Kammer und zählen Sie sie. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 430-facher g-Temperatur und Raumtemperatur, verwerfen Sie dann den Überstand und verwenden Sie drei Milliliter vorgewärmte Fluoreszenzfarbstoff-Arbeitslösung, um die Zellen wieder zu suspendieren. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit fünf Prozent Kohlendioxid für 30 Minuten.

Nachdem Sie die Zellen erneut pelletiert haben, entsorgen Sie die Farbstoffarbeitslösung und verwenden Sie fünf bis sieben Milliliter eines XPBS, um die Zellen vorsichtig wieder zu suspendieren. Nachdem Sie die Zellen erneut pelletiert und das PBS verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen wieder in fünf bis sieben Millilitern Standardmedium. Zählen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension.

Richten Sie eine Co-Kultur ein, indem Sie genügend ECME auf den Boden des Wells verteilen, um in jedem Well eines Schiebesystems mit vier Kammern eine gleichmäßige Schicht zu bilden. Platte 20 Mikroliter einer Einzelzellsuspension, die fünf mal 10 bis fünfte markierte BrC-Zellen pro Vertiefung enthält. Nach 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius wird eine Suspension von 2,5 mal 10 zu den fünften markierten Monozyten in 80 Mikrolitern Testmedium gegeben, die mit 60 Prozent ECME ergänzt sind.

Lassen Sie die ECME 15 bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erstarren. Geben Sie nun einen Milliliter einer Eins-zu-Eins-Mischung aus den BrC-Zellen und dem Monozyten-Kulturmedium hinzu. Inkubieren Sie die Co-Kulturen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit fünf Prozent Kohlendioxid für 24 Stunden, 48 Stunden oder fünf Tage, um Veränderungen zu verschiedenen Zeitpunkten zu verfolgen.

Um die EZM-Proteine abzubauen und die Zellen aus den Kulturen zu gewinnen, aspirieren und verwerfen Sie das Medium und geben Sie dann 0,5 Milliliter eines XPBS mit 0,1 Prozent Trypsin und 0,25 Prozent EDTA in die Kultur. Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fügen Sie 0,5 Milliliter eines XPBS mit 10 Prozent FBS hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Nach dem Pelletieren der Zellen wird der Überstand verworfen und die Zellen in fünf Millilitern eines XPBS mit 10 Prozent FBS wieder suspendiert. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Prüfen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Gerät einem Fax

Stellen Sie sicher, dass die Endpopulationen zu mindestens 95 Prozent rein sind. In jeder Vertiefung eines Objektträgersystems mit acht Vertiefungskammern wird eine 40-Mikroliter-Base ECME verteilt und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erstarren gelassen. Keimen Sie 800 MCF10 A-Zellen pro Well in 400 Mikroliter ergänztem DMEM F12-Kulturmedium gemäß dem Textprotokoll.

Fügen Sie dann 400 Mikroliter konditioniertes Medium hinzu oder ergänzen Sie DMEM F12-Kulturmedium mit 20 Nanogramm pro Milliliter humanem rekombinantem IL1 beta. Setzen Sie den Objektträger in eine Petrischale aus Glas ein, in der sich eine 35-Milliliter-Petrischale befindet, die mit zwei Millilitern PBS gefüllt ist. Die MCF 10A-Zellen sollten in jeder Vertiefung sehr langsam ausgesät werden, um eine Beschädigung der ECME-Basis zu vermeiden und zu verhindern, dass sich die Zellen absetzen und ein Monoly bilden.

Mit einem optischen Mikroskop wird die Bildung von Drüsenacini alle 24 Stunden für 14 Tage aufgezeichnet. Nach 14-tägiger Kultivierung werden 100 Mikroliter 100 nanomolare Proben in ein XPBS gegeben und die Proben 25 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren inkubiert. Spülen Sie die Proben mit einem XPBS bei Raumtemperatur, dreimal für jeweils fünf Minuten unter ständigem Rühren.

Verwenden Sie zum Einbetten der Präparate ein Eindeckmedium, das speziell für die Fluoreszenzfärbung geeignet ist. Versiegeln Sie dann die montierten Proben mit transparenter Politur und bewahren Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius lichtgeschützt auf. Vadim Perez, ein Forscher des National Laboratory of Advanced Microscoping, wird das Verfahren im konfokalen Mikroskop demonstrieren.

Analysieren Sie die Acini mit einem konfokalen Mikroskop, indem Sie Bilder von transversalen Stapeln in verschiedenen Tiefen der Acini aufnehmen. Visualisieren Sie verschiedene zelluläre Proteine in den Acini mit den richtigen Färbeprotokollen. Zum Beispiel wurde hier Caheren gefärbt, um die Zell-zu-Zell-Adhäsion, die Zellpolarität und die orale Bildung zu beurteilen.

Die Morphologie von primären BrC-Zellen, die in 3D-Kulturen bei niedriger und hoher Dichte wachsen, wurde über fünf Tage untersucht. Während der ersten 48 Stunden haften die Zellen mit einer länglichen Spindelform an der ECME und bilden nach fünf Tagen gestrickte Strukturen. Nach fünf Tagen in 3D-Co-Kulturen bildeten sowohl MCF7- als auch MDA-MB-231-kommerzielle BrC-Zellen unorganisierte Aggregate.

Aggressive MDA-MB-231-Zellen eignen sich jedoch für Aggregate mit länglichen Formen, während nicht-aggressive MCF7-Zellen für Aggregate mit abgerundeten Formen verwendet werden, die dichter verdichtet sind als MDA-MB-231-Zellen. Die Überstände aus primären 3D-BrC-Kulturen mit indirekter Interaktion und ihre fünftägigen Co-Kulturen mit primären Monozyten wurden geerntet. Signifikant erhöhte Spiegel von IL1 beta und IL8 wurden in den primären BrC-Zell-Monozyten-Cokulturen beobachtet.

Beides sind wichtige und entzündliche Zytokine, die bisher mit malignem Fortschreiten in Verbindung gebracht wurden. MCF10A-Zellen wurden mit zwei verschiedenen Überständen aus zwei primären BrC-Zelllinien kultiviert, um die Lumenbildung als Maß für die Resistenz gegen Anoykis zu beobachten. Im Gegensatz zu MCF10A-Zellen, die unter Standardbedingungen gezüchtet wurden, zeigen die bikonfokalen Schnitte der Sphäroide am Tag 14, dass MCF10A-Zellen der Anoykis entgingen, gemessen durch Zählen der Anzahl der zentralen Zellen in den Acini.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die medizinische Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Testen Sie die Signalwege bei beiden Krebsmigrationen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Tumormikroumgebungen, um die Kommunikation von Brustkrebszellen mit Massenzellen, Fibroblasten, Neutrofilen oder sogar verschiedenen Klonen von Tumorzellen in 3D-Co-Kultursystemen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein 3D-Kultursystem zur Modellierung der Tumormikroumgebung einrichten können.