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Die Einnahme von Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel für die Bestimmung der Fluid-Aufnahme Fähigkeiten bei Insekten

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DOI:

10.3791/56619

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20. Dezember 2017

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1Department of Biological Sciences, Kent State University at Stark, 2Department of Mathematical Sciences, Clemson University, 3Liquid Crystal Institute, Kent State University, 4Brookhaven National Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Flüssigkeit-Fütterung Insekten haben die Fähigkeit, kleinste Mengen von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen zu erwerben. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode um die Fähigkeit der Insekten zu Verschlucken von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen mit Fütterung Lösungen mit Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel direkt zu bestimmen.

Zusammenfassung

Flüssigkeit-Fütterung Insekten nehmen eine Vielzahl von Flüssigkeiten, die in der Umwelt als Pools, Filme, oder beschränkt sich auf kleine Poren. Studien von flüssigen Erwerb erfordern Beurteilung Mouthpart Struktur und Funktion Beziehungen; flüssige Aufnahme Mechanismen sind jedoch historisch aus der Beobachtung der strukturellen Architektur, manchmal ohne Begleitung mit experimentellen Beweis abgeleitet. Hier berichten wir über eine neuartige Methode zur Beurteilung der Fähigkeiten der Flüssigkeit-Aufnahme mit Schmetterlingen (Lepidoptera) und fliegen (Diptera) mit kleinen Mengen von Flüssigkeiten. Insekten werden mit 20 % Saccharose-Lösung gemischt mit Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel aus Filterpapiere bestimmten Porengrößen gefüttert. Die Ernte (interne Struktur zum Speichern von Flüssigkeiten verwendet) ist das Insekt entnommen und auf einem confocal Mikroskop gelegt. Ein Magnet ist winkte, von der Ernte, das Vorhandensein von Nanopartikeln, zu bestimmen, die angeben, ob die Insekten Flüssigkeiten aufnehmen können. Diese Methode wird verwendet, um einen weit verbreiteten Fütterung Mechanismus (Kapillarwirkung und flüssigen Brückenbildung) aufzudecken, der möglicherweise unter Lepidoptera und Diptera geteilt wird, bei der Fütterung von porösen Oberflächen. Darüber hinaus können mit dieser Methode für Studien der Fütterung Mechanismen unter einer Vielzahl von Flüssigkeit-Fütterung Insekten, darunter diejenigen wichtig in einer Krankheitsübertragung und Biomimetik und möglicherweise andere Studien, die Nano-Mikro-Größe oder Leitungen beinhalten wo Flüssigkeitstransport erfordert Überprüfung.

Einleitung

Viele Insektengruppen haben Mundwerkzeuge (Proboscises) geeignet für die Fütterung auf Flüssigkeiten, wie Nektar, faulenden Früchten, sap, fließt (z.B. Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), Xylem (Hemiptera4), Tränen (Lepidoptera ( 5), und Blut (Phthiraptera6, besitzen7, Diptera7, Hemiptera8, Lepidoptera9). Die Fähigkeit der Insekten ernähren sich von Flüssigkeiten ist Krankheit Getriebe4,11, Biodiversification2,12, Studien und Ökosystem Gesundheit (z. B. Bestäubung10) konvergente Entwicklung13. Trotz der Vielzahl von Nahrungsquellen ist ein Thema unter einigen Insekten Fluid-Fütterung die Möglichkeit, kleine Mengen von Flüssigkeiten, zu erwerben, die auf Mikro-Nano-Größe oder Tropfen, Flüssigkeitsfilme oder porösen Oberflächen beschränkt werden könnte.

Angesichts der umfangreichen Vielfalt der Flüssigkeit-Fütterung Insekten (mehr als 20 % aller Tierarten14,15) und ihre Fähigkeit, auf einer Vielzahl von Nahrungsquellen ernähren, verstehen ihre Fütterung Verhaltensweisen und Mechanismen der Flüssigkeit-Aufnahme ist in vielen Bereichen wichtig. Insekt Mouthpart Funktionalität, hat zum Beispiel eine Rolle bei der Entwicklung von Biomimetic-Technologie, z.B., mikrofluidischen Geräte, die Aufgaben wie der Erwerb von geringen Mengen an Flüssigkeiten mit Methoden, die ähnlich wie die Beschäftigten können durch Insekten16. Ein grundlegendes Problem in den Studien der flüssige Aufnahme Mechanismen, jedoch ist bestimmen nicht nur, wie Insekten auf Flüssigkeiten ernähren, aber experimentelle Beweise, dass den Mechanismus unterstützt zu erwerben. Allein mit Verhalten (z. B. mit dem Rüssel12,17sondieren) als Indikator für die Fütterung unzureichend, ist weil es nicht die erfolgreiche Aufnahme von Flüssigkeiten bestätigen, noch es ein Mittel bietet, um die Route zu bestimmen, Flüssigkeiten zu reisen als Durchgang durch das Insekt. Darüber hinaus stellt die Durchführung von Experimenten mit kleinen Mengen an Flüssigkeiten besser natürliche Fütterung Szenarien, wo Flüssigkeiten eine begrenzende Ressource2,12sind.

X-ray Phase Kontrast Bildgebung mit der Monarchfalter (Danaus Plexippus L.) verwendet wurde, um zu beurteilen, wie Schmetterlinge auf kleine Mengen von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen12ernähren. Monarchfalter verwenden Kapillarwirkung über Leerzeichen zwischen kutikulären Projektionen (dorsale Legulae) entlang der Rüssel, um Flüssigkeiten beschränkt sich auf kleine Poren in den Lebensmittel-Kanal zu bringen. Die eingehenden Flüssigkeiten bilden einen Film auf der Nahrung Kanalwand, das wächst und bricht in eine flüssige Brücke durch Plateau Instabilität12,18, das dann durch Einwirkung der saugende Pumpe in den Kopf, der Schmetterling Darm transportiert wird. Obwohl Röntgenbildgebung Phase Kontrast ein optimales Werkzeug zur Visualisierung von Strömung innerhalb der Insekten12,19,20,21, die Technik ist nicht leicht zugänglich und ein bequemer Methode für schnelle Einschätzung eines Insekts Fähigkeit zur Aufnahme von Flüssigkeiten benötigt wird und schlucken sie.

Um festzustellen, ob die Fütterung Mechanismus für D. Plexippus anderer Lepidoptera und auch fliegen (Diptera) (beide Gruppen ernähren sich von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen), gilt Lehnert Et Al. 13 angewendet eine Technik für die Beurteilung eines Insekts Fähigkeit, ernähren sich von kleinen Mengen an Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen, die hier ausführlich berichtet wird. Obwohl das Protokoll hier skizzierten für Studien, mit denen benetzt und porösen Oberflächen ist, kann die Methodik für andere Studien, wie die Adressierung Pool-Fütterung Mechanismen geändert werden. Darüber hinaus erweitern die Anwendungen in anderen Bereichen, einschließlich der Mikrofluidik und Muskelmodelle Technologie.

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Protokoll

(1) Insektenarten, Zubereitung von Lösungen und Fütterung Station Setup

Hinweis: Kohl Schmetterlinge (Pieris Rapae L., Pieridae) sind wie die Arten der Vertreter Lepidoptera ausgewählt, weil sie in früheren Studien der Flüssigkeit-Aufnahme Fähigkeiten und Mouthpart Morphologie22,23verwendet wurden. Stubenfliegen (Musca Domestica L., Muscidae) und blaue Flasche fliegt (Hexamerinaufnahme Vomitoria L., Calliphoridae) werden verwendet, da sie oft beobachtet werden, Fütterung auf porösen Oberflächen13.

  1. Bestellung p. Rapae als Larven von einem Insekt Zulieferer und hinten auf künstliche (siehe Tabelle der MaterialienErnährung) bis sie verpuppen sich und erweisen sich als Erwachsene in einer Klimakammer setzen auf 23 ° C und einer 18 L: 6 Photoperiode. Bestellung M. Domestica und C. Vomitoria als Puppen und sie an den gleichen Umweltbedingungen als p. Rapaehinten. Füttern Sie Erwachsenen Schmetterlinge und fliegen nicht, nachdem sie aus den Puppen vor den Fütterungsversuchen hervorgehen.
  2. Bereiten Sie einen 20 % Saccharoselösung (Kontrolle) und eine 20 % Saccharose Nanopartikel Lösung für flüssige Aufnahme zu testen. Bereiten Sie die Nanopartikel-Lösung durch Zugabe von fluoreszierenden magnetische Nanopartikel (Eisenoxid mit einem Polyacryl Säure-Beschichtung, ca. 20 nm Durchmesser)24 zu einer 20 % Saccharose-Lösung (1 mg/mL dH2O Nanopartikel mit 20 % Saccharose Lösung 1:1). Bereiten Sie eine 1 X Lösung von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10-fach verdünnt auf 1 X dH2O, pH 7,4), die für Sezierungen verwendet wird.
  3. Einrichten einer Futterstelle, die aus einer manuellen Manipulator mit einer Klemme und einer separaten Fütterung Bühne (eine flache Plattform) besteht (Abbildung 1). Legen Sie eine konkave Folie auf der Fütterung Bühne und haben Sie Nylon net Filter mit Größe Porendurchmesser von 11, 20, 30, 41 oder 60 µm und Membran-Filter mit Poren Größe Durchmesser von 1, 5, 8 oder 10 µm in der Nähe für die Fütterungsversuche.

2. Protokoll Fütterung

  1. Des Insekts Körper, Beine und Flügel in einem gefalteten Seidenpapier einwickeln. Positionieren Sie das Insekt, so dass nur der Kopf und Mundwerkzeuge ausgesetzt sind. Legen Sie die Flügel der Insekten zwischen zwei Objektträger, die durch die Klammer auf der Manipulator zusammengehalten werden, so dass das Insekt über die Fütterung Bühne (Abbildung 1) ausgesetzt ist.
  2. Verabreichen Sie ein 30 µL Tröpfchen von der 20 % Saccharose-Lösung oder die 20 % Saccharoselösung Nanopartikel mit einer Mikropipette an die Mitte der konkaven Folie. Legen Sie ein einzelnes Filterpapier von einer bestimmten Porengröße auf der konkaven Folie, so dass die Mitte des Filterpapiers mit den Tropfen der Nanopartikel-Lösung ausgerichtet ist. Der Kontakt zwischen den Tropfen und das Filterpapier führt die Lösung entlang dem Filterpapier, füllen die Poren (Abbildung 1).
    Hinweis: Das Filterpapier wird auf das Droplet, anstatt die andere Weise herum, platziert, um das mögliche Vorhandensein von Nanopartikeln auf dem Filterpapier zu minimieren, wo die Insekten ernähren.
  3. Positionieren Sie das Insekt mit dem Manipulator, so dass nur die distale Bereiche der die Mundwerkzeuge der benetzte Filterpapier auf der Fütterung Bühne (Abbildung 1) erreichen können. Verwenden Sie eine Insekt Pin zum verlängern die Mundwerkzeuge auf dem Filterpapier und ermöglichen das Insekt zu Futtermittel für 45 s.
  4. Zur Minimierung der Chance von Insekten ernähren sich von flüssigen Filme, die auf der Oberfläche des Filterpapiers vorhanden sein können, positionieren Sie die Mundwerkzeuge so, dass sie in Kontakt mit einem Teil des Filterpapiers sind, die berührt die flache Seite der Folie (zB. nicht direkt über die konkave Seite der Folie). Wenn das Insekt ein Interesse in der Fütterung nicht zum Ausdruck bringt, können die Mundwerkzeuge auf dem Filterpapier mit dem Insekt-Pin für die Dauer der Fütterung stattfinden.

(3) Sezierungen

  1. Legen Sie die PBS-Lösung in einem 50 mm-Uhrglas, so dass es genug Lösung gibt um das Insekt Körper bedecken. Legen Sie das Uhrglas unter ein Stereoskop und Position Insekt sezieren Ausrüstung (Frühling "Micro" sezieren, Schere, Insect Pins, feine Spitze, seziert Zange) neben das Stereoskop.
  2. Entfernen Sie nach der Fütterung das Insekt aus dem Tissue-Papier und mit Flügeln geschlossen zu halten. Entfernen Sie Kopf, Beine und Flügel der Insekten mit der Feder Mikro sezierenden Schere zu und das Insekt in die PBS-Lösung in das Uhrglas (Abbildung 2).
  3. Wenn nötig, zu betäuben Insekten vor Dissektionen. Verwenden Sie Zange, um das Insekt durch das Häutchen in der Nähe der distalen Region des Bauches zu halten. Verwenden Sie mit der dominanten Hand den Frühling Micro Präparierscheren, schneiden die Nagelhaut in eine anteriore Richtung entlang der lateralen Seite des Bauches, beginnend am hinteren Ende, bis der Brustkorb erreicht ist. Achten Sie besonders darauf, dass nur die Nagelhaut geschnitten ist und, dass der Verdauungskanal in das Insekt nicht (Abbildung 2 beschädigt).
  4. Machen Sie weitere Kürzungen der Nagelhaut mit der sezierenden Schere öffnet den Bauch um den Verdauungskanal innen (Abbildung 2) sichtbar zu machen. Entfernen Sie der Abdominal-Kutikula, dicken Körper und andere Strukturen mit Hilfe von Insekten Pins und außerhalb das Uhrglas für anschließende Entsorgung, so dass nur die Thorax und Verdauungskanal in das Uhrglas zu verlagern.
    Hinweis: Die Zerlegung wird die Ernte zeigen, die was einen Sac-artige Struktur (Verlängerung der Verdauungskanal) in der Nähe der Stelle des Thorax und Abdomen ist.
  5. Wenn die Ernte nicht ausgesetzt ist, stellen Sie zusätzliche Einschnitte in den Brustkorb mit der Schere bis die Ernte offenbart. Sobald die Ernte sichtbar ist, schneiden Sie die restlichen Teile des Insekts verlassen nur den Verdauungskanal mit der Ernte in das Uhrglas (Abbildung 2).
    Hinweis: Die Lepidoptera Ernte ist fast transparent und Cellophan-wie in der Natur, die möglicherweise schwer zu erkennen, wenn sie nicht mit Flüssigkeiten gefüllt und erweitert oder wenn es während der Präparation geschnitten wird.
  6. Verwenden Sie feine Spitze, seziert Zange um die Ernte auf einem Deckgläschen (24 x 24 mm) zu platzieren, für nachfolgende Bildgebung (Abbildung 2).

4. Bestimmung des aufgenommenen Nanopartikel

  1. Position der Ernte auf dem Deckglas mit der feinen Spitze sezierenden Zange mit darauf, dass kein bersten die Ernte. Verwenden Sie die CY3 Kanal (oder Phasenkontrast) auf einem inversen konfokalen Mikroskop für die Bildgebung mit 20 X Vergrößerung. Bild der Erntegutes sofort nach Dissektion damit sie nicht austrocknen.
  2. Halten Sie einen magnetischen Stir bar (41,3 mm Länge und 8 mm Durchmesser) in die Hand, die keine Kontrolle über die Betriebsphase des Mikroskops ist.
Welle magnetische Stir Bar hin und her in der Nähe der Ernte (ca. 10 mm Abstand von der Ernte), so dass jedes hin und her Bewegung etwa eine Sekunde (Abbildung 2 dauert).
  • Während die magnetischen Stir Bar geschwenkt ist, überprüfen Sie die Ernte für die Nanopartikel. Die Betriebsphase bewegen sich langsam hin und her beim Blick durch das Okular des Mikroskops für Nanopartikel Bewegung innerhalb der fast transparente Ernte. Wenn die Nanopartikel in der Pflanze vorhanden sind, zeigt positive füttern, sie reagieren werden und Welle im Einklang mit der magnetischen bar (Abbildung 2) rühren.

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    Ergebnisse

    Die Studie der Muster in Flüssigkeit-Aufnahme Fähigkeiten unter Flüssigkeit-Fütterung Insekten erfordert Entschlossenheit der Fütterung auftreten. Das Protokoll hier skizzierten wird verwendet, um die begrenzende Pore Größe Hypothese unter Lepidoptera und Diptera13. Die begrenzende Pore Größe Hypothese besagt, dass Flüssigkeit-Fütterung Insekten aus Flüssigkeit gefüllten Poren nicht ernähren können, wenn der Porendurchmesser Größe kleiner als der Durchmesser der Fü...

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    Diskussion

    Insekt Mouthpart Funktionalität ist historisch aus Studien von Brutto Morphologie abgeleitet (z. B.., Lepidoptera Rüssel Funktionalität im Zusammenhang mit einem trinken Stroh25,-26); jedoch haben neuere Studien, die experimentelle Beweise enthalten einen Paradigmenwechsel im Verständnis von der Komplexität der Insekten Mundwerkzeuge und Struktur-Funktions-Beziehungen-2,-12,-

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    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Danksagungen

    Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation (NSF) Nein zu gewähren. IOS 1354956. Wir danken Dr. Andrew D. Warren (McGuire Mitte für Lepidoptera und Biodiversität, Florida Museum of Natural History, University of Florida) für die Erlaubnis zur Verwendung der Schmetterling Bilder.

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    20%ige SaccharoselösungDomino ZuckerZucker, der zur Herstellung der Saccharoselösung benötigt wird, mit dH2
    O Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichP549310-fache Konzentration verdünnt auf 1X in dH2O für Insektendissektionen
    Konkave Objektträgerin mit einfacher VertiefungAmScopeBS-C6Objektträger ist für die Einrichtung
    FilterpapierEMDMillipore NY6004700 (60 & Mikro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    werden FilterpapierEMD MilliporeNY4104700 (41 & micro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    werden FilterpapierEMD MilliporeNY3004700 (30 & Mikro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    werden FilterpapierEMD MilliporeNY2004700 (20 & Mikro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    werden FilterpapierEMD MilliporeNY1104700 (11 & micro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    werden FilterpapierEMD MilliporeTCTP04700 (10 & Mikro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    FilterpapierEMD MilliporeTETP04700 (8 & Mikro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    FilterpapierEMD MilliporeTMTP04700 (5 & Mikro; m)Nylon-Netzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    werden FilterpapierEMD MilliporeRTTP04700 (1 & micro; m)Nylonnetzfilter und Isoporenfilter, die zur Herstellung einer porösen Oberfläche für die Insektenfütterung benötigt
    Iris-MikrodisparierschereCarolina Biological Supply Company623555Scheren für das Sezieren
    InsektenstifteBioquip Products1208B1Stifte, die bei Präparier- und Fütterungsversuchen verwendet werden
    Präparierzange mit extrafeiner SpitzeCarolina Biological Supply Company624684Präpariergeräte
    Leica M205 C StereoskopLeica MicrosystemsM205 CStereoskop zum Sezieren
    Inverses konfokales MikroskopOlympusIX81Fluoreszenzmikroskop zum Nachweis magnetischer Nanopartikel
    Fisherbrand PTFE Einweg-Rührstab FisherscientificS68067Magnet zum Nachweis von Nanopartikeln
    Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34155Taschentücher zur Sicherung von Insekten während der Fütterung
    Stubenfliege (Musca domestica) PuppenMantisplace.comInsekten für Experimente
    Insekten für ExperimentePuppen
    Larven des Kohlschmetterlings (Pieris rapae)Carolina Biological Supply Company144102Insekten für Experimente
    Finnpipette F1 ThermoFisher Scientific4641080NMikropipette zum Dispensieren von Flüssigkeiten
    Finntip 250 PipettenspitzenThermoFisher Scientific9400250Mikropipettenspitzen
    Mikroskop Glasabdeckfolien (=Deckgläser) (24 x 24 mm)AmScopeCS-S24-100Deckgläser zur Betrachtung des Insektenstamms am konfokalen Mikroskop
    der Fütterungsstufe erforderlich werden werden werden Puppen Mantisplace.com Insekten für Experimente

    Referenzen

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