Methodenartikel

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

DOI:

10.3791/56630

⸱

3. Februar 2018

 ,  , 
1Physiology and Pharmacology Department, Des Moines University, 2School of Liberal Arts and Sciences, Mercy College of Health Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Transport von Ionen durch Zellmembranen sorgt für die Feinsteuerung der Ionengehalt innerhalb und außerhalb der Zelle, die Zelle Überleben unverzichtbar ist. Diese Transportmechanismen werden durch die Aktivitäten von spezialisierten Transporter-Proteinen vermittelt. Insbesondere pH Dynamik sind fein gesteuert Plasmamembran Proton (H+) Extrusionsanlagen, wie Na+/h+ Wärmetauscher (NHE) Proteinfamilie. Trotz umfangreicher Bemühungen, die Mechanismen NHE Verordnung studieren reicht unser gegenwärtige Verständnis der biophysikalischen und molekularen Eigenschaften der NHE Familie wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Methoden, um effektiv NHE Aktivität messen . In diesem Manuskript verwendet wir H+-selektive Elektroden während der gesamten Zelle patch klemmenden Aufnahme um NHE-induzierte H+ Flussmittel zu messen. Wir haben vorgeschlagen, dass dieser Ansatz in der Regel einige Einschränkungen der Methoden zur Messung der NHE Aktivität, z. B. radioaktiven Aufnahme und fluoreszierende Membran Permeants. Messung der NHE Aktivität mit der beschriebenen Methode ermöglicht hohe Empfindlichkeit und Auflösung und eine effizientere Kontrolle der intrazellulären Konzentrationen H+ . H+-selektive Elektroden sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein H+-selektiven Elektrode bis zu bewegen und entfernt von der Zellmembran in einer sich wiederholenden, oszillierende Mode zeichnet eine Spannungsdifferenz, die H+ Flux abhängig ist. Während H+-selektive Elektroden werden verwendet, um H+ Flux bewegen aus der Zelle, die Patch-Clamp-Methode in der ganz-Zell Konfiguration dient zur Steuerung der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu erkennen. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide. Die Transporter-Aktivität der NHE Isoform 3 (NHE3) wurde durch Phosphoinositides gemessen mit diesem technischen Ansatz, um die molekulare Grundlagen der NHE3-Verordnung zu studieren.

Einleitung

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Transport von Ionen und gelösten Stoffen über die Plasmamembran ist essentiell für das Überleben der Zellen und damit der Organismen1. Selektive Transport von Ionen und gelösten Stoffen wird durch eine Reihe von spezialisierten Kanal und Transporter-Proteinen erreicht. Mutationen in diesen Proteinen führen oft zu einer Vielzahl von klinischen Bedingungen, Kanal und Transporter Proteine potenzielle Ziele für pharmakologische Behandlung1rendern. Leider ist das Verständnis der Mechanismen, die zugrunde liegenden Kanal und Transporter Funktion und Regulation durch die Ansätze zur Verfügung, um ihre Aktivität2,3,4studieren oft begrenzt.

Insbesondere Transporter können werden grob unterteilt in zwei große Gruppen, je nachdem, ob sie die Zelle transmembranen Potenzial beim Transport von gelösten Stoffen verändern: die Veränderung elektrogenes Ion-Transporter [z. B. Natrium-Phosphat Co-Transporter 2a (NaPi2a), Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) usw..] oder die nicht verändernde elektroneutraler Ionen-Transporter [z. B. Natrium-Proton Wärmetauscher (NHE), Natrium-Chlorid-Co-Transporter, NaPi2c, etc..]. Die Aktivitäten der beiden Klassen von Transportern wurden untersucht ausgiebig mit Aufnahme von radioaktiven Isotopen und Membran-permeationsfähigen fluoreszierenden Farbstoffen2. Beide Ansätze schätzen die Tätigkeit der Transporter durch die Messung der Masse Konzentrationsänderungen von speziellen zytoplasmatischen Ionen, und beide Methoden haben Einschränkungen, z. B. mäßige Empfindlichkeit und Zeitauflösung und unzureichende Kontrolle über die intrazelluläre Milieu. In der Tat, die Aktivität von vielen Transportern ist abhängig von der zytoplasmatischen Konzentration der Ionen (z. B. NHE3, NCX) durchgeführten, und Veränderungen in diesen Ionen-Konzentrationen werden voraussichtlich eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Transporter Aktivität2 , 3 , 5. präzise Messung dieser regulative Mechanismen beschränkt sich mit klassischen Methoden.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Patch-Clamp-Methoden verwendet, um den Transporter Aktivität2,6zu studieren. Insbesondere erlaubt die selbst verweisende ionenselektive Elektroden (ISEs)7,8 in Kombination mit dem Patch Spannsystem vor kurzem die Messung von elektroneutraler Transporter Aktivität3,4 , 5. ISEs sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein ISE bewegt sich auf und Weg von der Zellmembran in eine sich wiederholende, zeichnet oszillierende Mode eine Spannungsdifferenz (µV). Spannungsdifferenzen können in Ionen-Fluss Werte mit einer Kalibrierungsmethode, die erste Gesetz des Fick'schen Diffusion2,9gilt umgewandelt werden. Während ISEs verwendet werden zu erkennen, der Fluß der Ionen, die Bewegung von Zellen, Patch-Clamp-Methode in beide ganz-Zelle oder Inside-out-Konfigurationen wird verwendet, um die Membran Potenzial und intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu kontrollieren. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung der riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide und Proteine3,5.

Zusammenfassend lässt sich sagen die Vielseitigkeit der Patch-Clamp-Methode im Vergleich zu, dass andere Methoden zu studieren Transporter Aktivität hat Patch Klemmung geeignet, die allgemeinen Einschränkungen dieser anderen Methoden zu überwinden. Die Kombination von verweisen auf sich selbst ISEs und Patch-Clamp-Technik bietet die einzigartige Möglichkeit, die Aktivität von elektroneutraler Transporter in einem streng kontrollierten experimentellen Umfeld messen und Roman biophysikalische und molekularen entdecken Eigenschaften der Zellmembran transportieren3,4,5. Dieser Ansatz hat erfolgreich eingesetzt, um die Aktivität der NHE zu studieren. Die Säugetier-NHE Proteinfamilie katalysiert die elektroneutraler net Austausch von extrazellulären Natrium (Na+) für intrazelluläre Protonen (H+)10,11 unter Verwendung einer nach innen Na+ Steigung. Bei Säugetieren umfasst die NHE Proteinfamilie 11 verwandte Proteine (NHE1-9 und NHA1-2) und eine Sperma-spezifische NHE10,12,13.

NHEs (SLC9a Familie) sind ubiquitär in den meisten lebenden Organismen aus einfachen Prokaryoten zu höheren Eukaryoten gefunden und engagieren sich in einer Vielzahl von lebenswichtige Zelle Funktionen10,11, einschließlich die Zelle Salzgehalt Verteidigung im controlling Prokaryoten, Aufrechterhaltung des Säure-Basen-Homöostase und Zelle Volumen und reguliert die Aufnahme von Salz und Wasser in verschiedenen spezialisierten Epithelien10,12,14,15. Die biologische Schlüsselrollen NHEs und die Bedeutung ihrer Funktionen wurden durch mehrere Studien festgelegt; jedoch haben einige Studien die biophysikalischen und molekulare Eigenschaften von Säugetieren NHEs Wegen methodischer Einschränkungen4untersucht. Vor kurzem hat die Anwendung von verweisen auf sich selbst ISEs während der gesamten Zelle Patch Klemmung neuartigen molekulare Mechanismen der NHE Isoformen von Änderungen in den intrazellulären Konzentrationen von Ionen, Proteine und Phospholipide3reguliert ergeben, 4.

Insbesondere das Protokoll zur Verfügung gestellt in diesem Manuskript beschreibt die Methoden und Ansätze zur Erforschung der Aktivität und Regulierung der NHE Isoform 3 (NHE3), einer der Hauptakteure bei der Aufnahme von Na+, Cl–, HCO3– und Flüssigkeit in der Bürste Grenze Membran Nieren- und Darm Epithelien14,16. Neue Einblicke in die Unterschiede in der Empfindlichkeit der NHE3 Aktivität, intrazelluläre Phosphoinositides (Phosphatidylinositide 4,5-Bisphosphate [PI (4,5) P2] und Phosphatidylinositide 3,4,5-Triphosphat [PI(3,4,5]P3]) wird berichtet. Zelle-Transport-Proteine, wie Kanäle und Transporter, Phosphoinositides17geregelt sind, und NHE3 bindet direkt PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5)18. Basierend auf der aktuellen Literatur, könnte entweder Phosphoinositide relevant für die physiologische und pathophysiologische Regulierung des NHE35,18,19. Unsere Befunde stützen separate Rollen für PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5) bei der Regulierung der NHE3 Aktivität. Diese Unterscheidung war aufgrund der Anwendung der ISE-Techniken in Kombination mit ganzen Zelle Patch Clamp Aufnahme möglich. Diese Technik ermöglicht auch Kontrolle der Phosphoinositide zellulären Inhalte über die intrazelluläre Perfusion der verschiedenen Phosphoinositides während der Messung der NHE3 Tätigkeit.

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Protokoll

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Hinweis: Zwei Verstärker sind erforderlich für die Aufnahme der Tätigkeit der elektroneutraler Transporter durch eine selbst verweisende ISE in Verbindung mit Patch spannen, einen Patch Clamp Verstärker weiterhin die Zelle in eine ganz-Zell Konfiguration und eine hohe außerdem Verstärker ( Elektrometer) aufzeichnen die Transporter-Aktivität über die ISE (siehe Tabelle der Materialien). Der Patch-Clamp-Verstärker ist direkt mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Das Elektrometer mit der Differenzverstärker verwendet, um zu filtern und verstärken das Signal verbunden ist. Der Differenzverstärker ist mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Capmeter, Patch Clamp-Software, die Zelle Kapazität überwacht wurde in früheren Studien20 verwendet (siehe Tabelle der Materialien). Kammer und Perfusion Aufzeichnungslösungen werden bei 37 ° c beibehalten.

1. Vorbereitung von Pipetten für ISEs

  1. Ziehen Sie die Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm (siehe Tabelle der Materialien) mit der Pipette Abzieher2 .
  2. Polieren Sie die Pipette mit der Microforge. Der Durchmesser des die Pipettenspitze sollte 2-3 µm.
  3. Legen Sie die Pipetten in einem Glas-Halter für Pipetten mit der Pipettenspitze nach oben (siehe Tabelle der Materialien).
    Achtung: Führen Sie Schritte 1,4-1,6 in einem gut belüfteten chemische Abzug.
  4. Mischen Sie die Silikonisierung Mischung, die aus 1 Tropfen (~ 150 µL) besteht der BIZ (Dimethylamino) Dimethyl Silane und 10 Tropfen der Carbon Titantetrachlorid (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Gießen Sie die Silikonisierung Mischung in das Glas und schließen Sie den Deckel fest.
  6. Inkubieren Sie das Glas mit der Silikonisierung Mischung für 24-48 h in einem chemischen Abzug bei Raumtemperatur, bis die Mischung vollständig verdunstet ist.
  7. Die Pipette mit dem entsprechenden ionenselektive Harz Hinterfüllung erstellen Sie eine Spalte von ca. 2-4 mm.
    Hinweis: Wasserstoff Ionophore ich cocktail B Geschäftstermine Aufnahme NHE Aktivität werden kann (siehe Tabelle der Materialien).
  8. Tippen Sie auf die Spitze der Pipette, die ionenselektive Harz bis zur Spitze zu verteilen, und legen Sie die Pipette senkrecht in den Glas-Halter mit der Pipettenspitze nach unten.
  9. Checkunder der sezierenden Mikroskop, dass der Harz-Cocktail am Ende der Spitze erreicht hat. Bei Bedarf positive Druck, das Harz bis zum Ende zu drücken.
  10. Abgleich der Hälfte-Pipette mit der entsprechenden Lösung (~ 100 μL). Hier verwenden 100 mM KCl und 10 mM HEPES bei pH 7,0, wenn Ionophore ich cocktail B.
  11. Verbinden Sie die ISE mit dem Elektrometer und setzen Sie die Spitze der ISE in der Bad-Lösung für die Aufzeichnung verwendet. Das Elektrometer auf Null.
  12. Testen Sie die H+-selektive ISE Reaktion verändern den pH-Wert der Lösung Bad. Die durchschnittliche H+-selektive ISE Antwort ist ~ 58 mV pro Einheit von pH.
  13. In regelmäßigen Abständen bewerten Sie die ISE-Reaktion auf Kalibrierung.

2. Vorbereitung des Patch Clamp Pipetten für die Aufnahme

Hinweis: Die Methode von Donald Hilgemann in seinem Artikel auf Einkanal-Aufnahme21 beschrieben wird empfohlen.

  1. Ziehen Sie die Pipetten für riesige Patch aus Borosilikatglas Kapillaren (2.0 MmOD / 1,5 mm ID) auf die Pipette Abzieher2,22,23.
  2. Verwendung einer Microforge montiert auf der Bühne von einem inversen Mikroskop zu einem breiten Pipette Tipp (10-22 μm)23. Eine Perle zu schmelzen (~ 0,5 mL) von Weichglas auf den dicken Platin Draht von der Microforge.
    Hinweis: Eine relativ dicke Platindraht ist erforderlich (~0.5 mm), riesiger Patch Pipetten zu fabrizieren.
  3. Positionieren Sie die Patch-Pipette in der Nähe der weichen Glasperle und gelten Sie volle Hitze, bis die Spitze beginnt zu schwinden. Der Platindraht bewegt sich etwas in Richtung der Centerduring Heizung.
  4. Schalten Sie die Hitze, und schieben Sie die Pipettenspitze in die weiche Glasperle. Die kühle Draht wird zurückziehen und brechen die Pipettenspitze.
  5. Erneut die Hitze zu glätten die Pipettenspitze und erstellen eine Pipettenspitze mit dem gewünschten Durchmesser. Der Durchmesser der Spitze ist abhängig von der Größe der Zelle werden gepatcht (8 – 10 μm in dieser Studie).

3. Vorbereitung der Zellen

  1. Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + und Mg2 +, Trypsin-EDTA-Lösung und Wachstumsmedium, bei 37 ° c erwärmen
  2. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS. Verwenden Sie 1 mL des Puffers für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur.
  3. 0,5 mL Trypsin zu den Zellen für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur zugeben.
    Hinweis: Wenn Zellen beginnen sich zu Round-Up, schütteln Sie die Platte, um die Zellen de befestigen.
  4. Hält die Trypsin-Handlung durch Zugabe von 5 mL (Betrag für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur) komplette Wachstumsmedium mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt.
    Hinweis: Ist die Reaktionszeit in Trypsin-Zelltyp abhängig.
  5. Legen Sie die Zellen auf einem Boston-Shaker mit rockigen um Bildung von Klumpen zu vermeiden.
  6. Verwenden Sie Zellen für bis zu 2 h nach Trypsinization.
    Hinweis: Die Zeit variieren je nach Zelllinie.

4. Erstellung eines Intra-Pipette Perfusion Systems

  1. Schneiden Sie eine geeignete Größe des Quarz-Schlauch (150 µm OD / 75 µm ID), die Intra-Pipette Perfusion Linie vorzubereiten.
  2. Ein 200 µL Pipettenspitze stecken Sie einseitig von den Quarz-Schlauch. Kleben Sie die Quarz-Schlauch auf die Spitze und schneiden Sie das Ende der Spitze mit einer scharfen Rasierklinge.
  3. Schließen Sie die Perfusion Leitung (Quarz-Schlauch an der Spitze geklebt), ein kleines Stück Silikon-Schläuche, die als Reservoir für die Intra-Pipette Perfusion Lösung dienen würde.
  4. Schließen Sie den Silikon-Schläuche an eine Spritze um Überdruck zu erstellen.
  5. Legen Sie das freie Ende des Quarz-Schlauch durch das Polyethylen-Rohr von der Pipette Inhaber der Durchblutung port (siehe Tabelle der Materialien).
  6. Die Perfusion-Linie mit der Pipette Lösung zu bewerten.

5. Vorbereitung der Lösungen

  1. Bereiten Sie eine stark gepufferten Pipette-Lösung zur Erfassung von NHE (115 mM Kalium Aspartat-(KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM Rohre MOPS 12,5 mM und 12,5 mM MES, pH 6.0 mit Asparaginsäure eingestellt).
    Hinweis: Bereiten Sie das Lager Pipette Lösung und Filter. Mg-ATP vor der Aufnahme hinzufügen.
  2. Bereiten Sie eine frisches Bad Lösung jedes Mal (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2und 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).

6. Aufnahme von Transporter-Aktivität

  1. Halten Sie die Aufnahme Kammer und alle Lösungen bei 37 ° C, da Transporter Aktivität temperaturabhängig ist.
  2. Legen Sie die Zellen in der Aufnahme-Kammer. Warten Sie, bis sie auf den Boden der Kammer fallen aber lass sie nicht anhängen an die Kammer.
  3. Wählen Sie eine entsprechende Zelle. Messen Sie den Durchmesser der Zelle mit der okulären Mikrometer. Wählen Sie Zellen mit ähnlichen Durchmessern.
    Hinweis: In der Regel wird eine große Zelle mehr zellularen Oberfläche und möglicherweise mehr Transporter über die Plasmamembran, also auch mit mehr Transporter Aktivität zum Ausdruck gebracht haben. Dies ist jedoch nicht unbedingt richtig, als Transporter Aktivität hängt von der spezifischen Transporter und Zelltyp unter Studie.
  4. Montieren Sie die ionenselektive Mikroelektrode Pipette an der Mikromanipulator, Hinterfüllung die Patch-Klemmung Pipette mit der intrazellulären Lösung stellen sicher, dass die Lösung die Spitze der Pipette2erreicht.
    Hinweis: Es möglicherweise mehrere sanfte Taps, Luftblasen in der Spitze der Pipette zu beseitigen.
  5. Montieren Sie die Patch-Klemmung Pipette auf den Kopf Bühne der Elektrophysiologie eingerichtet,2,22,23.
    Hinweis: Es ist wichtig, dass die Kopf Bühne über einen 45-Grad-Winkel auf der horizontalen Achse, da dadurch eine Eintrittswinkel für die Pipette, die für die Bildung einer hochresistenten Dichtung geeignet ist.
  6. Eine kleine positive Druck (~ 5 cm H2O) um die Patch-Pipette zu verringern die Möglichkeit der Sperrung der Spitze, und legen Sie sie in die Bad-Lösung.
  7. Nicht mehr die Patch-Clamp-Pipette zu bewegen, sobald die Spitze in der Nähe der Zelle ist.
  8. Entlasten den positiven-Luftdruck während Pipette die Zelle berührt und leichten negativen Druck (~ 5 cm H2O) erhalten eine > 1000 MΩ (ein Giga-Ohm) Siegel auf der Zellmembran mit dem Patch pipette23.
  9. Legen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der gleichen Brennebene als die ISE, und bewegen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der Nähe der ISE (~ 5-10 µm)2,5 aber vermieden werden, dass die Zelle an der ISE (Abbildung 1A).
  10. Versichern, dass die potenziellen Holding 0 ist mV.
  11. Bruch der Dichtung mit Serie von kurzen Lenzsauger, die ganz-Zell Konfiguration zu erhalten.
  12. Verschieben Sie die ISE (oder Patch-Clamp-Pipette) langsam links-rechts oder oben-unten, um die Aktivität des Transporters (Abbildung 1 b) aufzuzeichnen.
  13. Aufzeichnen von mindestens 5-8-Gipfel (Abbildung 1, von A nach B).
  14. Gelten Sie Rechtecksignal Störungen während der Aufnahme, die Qualität der Dichtung und die Zellmembran Kapazität (Abbildung 1) zu überwachen.
  15. Schätzen Sie das Flussmittel H+ (figure-protocol-1) aus der Differenz im freien H+ Konzentration der Zelloberfläche und Bulk-Lösung (ΔH+)
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    Hinweis: figure-protocol-4 und figure-protocol-5 h+ und Puffer Diffusionskoeffizienten bzw. BT ist die Konzentration der gesamten Puffer, KD ist die Dissoziationskonstante des Puffers, R ist die Zelle Radius, und figure-protocol-6 bestimmt die Steady-State Änderung in der Konzentration der gebundenen H+ für eine kleine Änderung im freien H+. H+ zeigt eine freie Protonen in Lösung. Um mit früheren Studien, H+ Fluten in elektrophysiologische Flussmittel Einheiten durch die Berechnung der aktuellen Entsprechungen von den Fluten konvertiert (figure-protocol-7/faraday) in pA-3,-5].
  16. Den Proton-Flux an der Zelloberfläche, die von der Zellengröße berechnet werden können oder die Membran-Kapazität zu normalisieren.

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Ergebnisse

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Ein selbst verweisende ISE während der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme wurde angewandt, um die Regelung der NHE3 Tätigkeit zu studieren von Phosphoinositides. PS120 Fibroblasten-wie Zellen24, die die Expression von endogenen Plasmamembran NHEs fehlt, wurden verwendet. NHE3-Wildtyp (NHE3-wt) oder NHE3-Mutanten, die nicht binden Phosphoinositides [Tyrosin 501, 503 Arginin und Lysin 505 wurden ersetzt mit Alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] wurden in PS120 Fibro...

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Diskussion

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Trotz der wichtigen Funktionen von Transportern sind die Methoden zur Verfügung, um ihre Tätigkeit zu studieren ineffektiv und unzureichend. Eine Einschränkung besteht darin, dass die verfügbaren Methoden Ionenbewegung vermittelt durch Transporter Aktivität ohne Rücksicht auf Schwankungen der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung während das Experiment4messen. Die vorgestellte Methode sorgt für präzise Steuerung der extrazellulären und intrazellulären Ionen-Kompositionen und bietet ein leistungsst...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten danke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) für seine Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung der Videos. Die PS120 Fibroblasten-ähnliche Zellen stabil mit dem Ausdruck NHE3-wt oder NHE3-YRK wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Patch Clamp AmplifierMolecular Devices
Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)Warner Instruments64-1650
Differential Amplifier (DP-301)Warner Instruments64-0044
Patch Clamp Software Basierend auf MatLabMatLab mit Erfassungs-ToolboxDie Capmeter-Software wird empfohlen
ThermoClamp-1 Temperiersystem  AutoMate Scientific03-11-LLInline-Heizung
Einkanal-Temperaturregler (TC-324C)Warner Instruments64-2400
Einläufige Standard-BorosilikatglasröhreWorld Precision Instruments1B120F-3   Wird für ionenselektive Elektroden verwendet
Mikropipetten-VorratsdoseWorld Precision InstrumentsE212
Bis(dimethylamino)dimethylsilanSigma-Aldrich14755-100ML
TetrachlorkohlenstoffSigma-Aldrich319961-500ML
Wasserstoffionophor I - Cocktail BSigma-Aldrich95293
Dünnwandige Borosilikatschläuche  Sutter InstrumentB200-156-15Wird für Patch-Clamp-Pipetten 
Weiches Glas (Corning 8161 Patch Glass)Warner Instruments64-0815
Siliziumdioxid-Kapillarschläuche (150 μm Außendurchmesser/75 μm Innendurchmesser)Molex (Polymicro Technologies)106815-0018Wird für Intrapipetten-Perfusionssysteme
verwendet KaliumchloridSigma-AldrichP9333
KaliumaspartatSigma-AldrichA6558
EGTASigma-AldrichE3889
MagnesiumchloridSigma-AldrichM4880
Mg-ATPSigma-AldrichA9187
HEPESSigma-AldrichH3375
ROHRESigma-AldrichP6757
MOPSSigma-AldrichM1254
MESSigma-AldrichM3671
CalciumchloridSigma-AldrichC5670
TrisSigma-AldrichT1503
SalzsäureSigma-AldrichH1758
ApyraseSigma-AldrichA6535
Phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphat diC8Echelon BiowissenschaftenP-4508
Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat diC8Echelon BiosciencesP-3908

Referenzen

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Protonenselektive MikroelektrodeWhole Cell Patch ClampNatrium Wasserstoff AustauscherNHE3 Aktivit tsmessungGiant Patch Technikintrazellul res PerfusionssystemIonenflussdetektionPhosphoinositid RegulationH Flussmessung

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