Methodenartikel

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

DOI:

10.3791/56630

⸱

3. Februar 2018

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1Physiology and Pharmacology Department, Des Moines University, 2School of Liberal Arts and Sciences, Mercy College of Health Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Zusammenfassung

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Der Transport von Ionen durch Zellmembranen sorgt für die Feinsteuerung der Ionengehalt innerhalb und außerhalb der Zelle, die Zelle Überleben unverzichtbar ist. Diese Transportmechanismen werden durch die Aktivitäten von spezialisierten Transporter-Proteinen vermittelt. Insbesondere pH Dynamik sind fein gesteuert Plasmamembran Proton (H+) Extrusionsanlagen, wie Na+/h+ Wärmetauscher (NHE) Proteinfamilie. Trotz umfangreicher Bemühungen, die Mechanismen NHE Verordnung studieren reicht unser gegenwärtige Verständnis der biophysikalischen und molekularen Eigenschaften der NHE Familie wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Methoden, um effektiv NHE Aktivität messen . In diesem Manuskript verwendet wir H+-selektive Elektroden während der gesamten Zelle patch klemmenden Aufnahme um NHE-induzierte H+ Flussmittel zu messen. Wir haben vorgeschlagen, dass dieser Ansatz in der Regel einige Einschränkungen der Methoden zur Messung der NHE Aktivität, z. B. radioaktiven Aufnahme und fluoreszierende Membran Permeants. Messung der NHE Aktivität mit der beschriebenen Methode ermöglicht hohe Empfindlichkeit und Auflösung und eine effizientere Kontrolle der intrazellulären Konzentrationen H+ . H+-selektive Elektroden sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein H+-selektiven Elektrode bis zu bewegen und entfernt von der Zellmembran in einer sich wiederholenden, oszillierende Mode zeichnet eine Spannungsdifferenz, die H+ Flux abhängig ist. Während H+-selektive Elektroden werden verwendet, um H+ Flux bewegen aus der Zelle, die Patch-Clamp-Methode in der ganz-Zell Konfiguration dient zur Steuerung der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu erkennen. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide. Die Transporter-Aktivität der NHE Isoform 3 (NHE3) wurde durch Phosphoinositides gemessen mit diesem technischen Ansatz, um die molekulare Grundlagen der NHE3-Verordnung zu studieren.

Einleitung

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Transport von Ionen und gelösten Stoffen über die Plasmamembran ist essentiell für das Überleben der Zellen und damit der Organismen1. Selektive Transport von Ionen und gelösten Stoffen wird durch eine Reihe von spezialisierten Kanal und Transporter-Proteinen erreicht. Mutationen in diesen Proteinen führen oft zu einer Vielzahl von klinischen Bedingungen, Kanal und Transporter Proteine potenzielle Ziele für pharmakologische Behandlung1rendern. Leider ist das Verständnis der Mechanismen, die zugrunde liegenden Kanal und Transporter Funktion und Regulation durch die Ansätze zur Verfügung, um ihre Aktivität

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Protokoll

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Hinweis: Zwei Verstärker sind erforderlich für die Aufnahme der Tätigkeit der elektroneutraler Transporter durch eine selbst verweisende ISE in Verbindung mit Patch spannen, einen Patch Clamp Verstärker weiterhin die Zelle in eine ganz-Zell Konfiguration und eine hohe außerdem Verstärker ( Elektrometer) aufzeichnen die Transporter-Aktivität über die ISE (siehe Tabelle der Materialien). Der Patch-Clamp-Verstärker ist direkt mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Das Elektrometer mit der Differenzverstärker verwendet, um zu filtern und verstärken das Signal verbunden ist. Der Differenzverstärker ist mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Capmeter, Patch Cl....

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Ergebnisse

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Ein selbst verweisende ISE während der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme wurde angewandt, um die Regelung der NHE3 Tätigkeit zu studieren von Phosphoinositides. PS120 Fibroblasten-wie Zellen24, die die Expression von endogenen Plasmamembran NHEs fehlt, wurden verwendet. NHE3-Wildtyp (NHE3-wt) oder NHE3-Mutanten, die nicht binden Phosphoinositides [Tyrosin 501, 503 Arginin und Lysin 505 wurden ersetzt mit Alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] wurden in PS120 Fibro.......

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Diskussion

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Trotz der wichtigen Funktionen von Transportern sind die Methoden zur Verfügung, um ihre Tätigkeit zu studieren ineffektiv und unzureichend. Eine Einschränkung besteht darin, dass die verfügbaren Methoden Ionenbewegung vermittelt durch Transporter Aktivität ohne Rücksicht auf Schwankungen der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung während das Experiment4messen. Die vorgestellte Methode sorgt für präzise Steuerung der extrazellulären und intrazellulären Ionen-Kompositionen und bietet ein leistungsst.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Danksagungen

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Die Autoren möchten danke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) für seine Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung der Videos. Die PS120 Fibroblasten-ähnliche Zellen stabil mit dem Ausdruck NHE3-wt oder NHE3-YRK wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Patch Clamp AmplifierMolecular Devices
Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)Warner Instruments64-1650
Differential Amplifier (DP-301)Warner Instruments64-0044
Patch Clamp Software Basierend auf MatLabMatLab mit Erfassungs-ToolboxDie Capmeter-Software wird empfohlen
ThermoClamp-1 Temperiersystem  AutoMate Scientific03-11-LLInline-Heizung
Einkanal-Temperaturregler (TC-324C)Warner Instruments64-2400
Einläufige Standard-BorosilikatglasröhreWorld Precision Instruments1B120F-3   Wird für ionenselektive Elektroden verwendet
Mikropipetten-VorratsdoseWorld Precision InstrumentsE212
Bis(dimethylamino)dimethylsilanSigma-Aldrich14755-100ML
TetrachlorkohlenstoffSigma-Aldrich319961-500ML
Wasserstoffionophor I - Cocktail BSigma-Aldrich95293
Dünnwandige Borosilikatschläuche  Sutter InstrumentB200-156-15Wird für Patch-Clamp-Pipetten 
Weiches Glas (Corning 8161 Patch Glass)Warner Instruments64-0815
Siliziumdioxid-Kapillarschläuche (150 μm Außendurchmesser/75 μm Innendurchmesser)Molex (Polymicro Technologies)106815-0018Wird für Intrapipetten-Perfusionssysteme
verwendet KaliumchloridSigma-AldrichP9333
KaliumaspartatSigma-AldrichA6558
EGTASigma-AldrichE3889
MagnesiumchloridSigma-AldrichM4880
Mg-ATPSigma-AldrichA9187
HEPESSigma-AldrichH3375
ROHRESigma-AldrichP6757
MOPSSigma-AldrichM1254
MESSigma-AldrichM3671
CalciumchloridSigma-AldrichC5670
TrisSigma-AldrichT1503
SalzsäureSigma-AldrichH1758
ApyraseSigma-AldrichA6535
Phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphat diC8Echelon BiowissenschaftenP-4508
Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat diC8Echelon BiosciencesP-3908

Referenzen

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  1. Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
  2. Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac memb....

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Schlagwörter

Protonenselektive MikroelektrodeWhole Cell Patch ClampNatrium Wasserstoff AustauscherNHE3 Aktivit tsmessungGiant Patch Technikintrazellul res PerfusionssystemIonenflussdetektionPhosphoinositid RegulationH Flussmessung

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