Summary
这里描述的是原位卵巢移植协议, 改变卵巢对受体小鼠生理的影响。这种手术方法是用来暴露雌性小鼠对各种类型的卵巢影响, 可能包括 heterochronic 移植和卵巢移植已经经历了各种前体治疗。
Abstract
卵巢移植在犹他州立大学于1963年首次进行。在最近的工作中, heterochronic 移植哺乳动物卵巢被用来调查年轻女性卵巢的健康保护作用。目前的手术方法采用原位移植法, 将同种异体卵巢移植回卵巢囊中的原位置。这与更常用的卵巢/卵巢组织皮下或肾囊下的异位移植不同。所有三个地点都为移植组织提供高效的血管重建。然而, 原位移植为卵巢提供了最自然的信号环境, 是唯一的程序, 提供的机会, 动物繁殖自然后手术。在去卵巢手术过程中, 必须注意去除所有内源性卵巢组织。如果任何内源组织保持或如果只有一个卵巢被删除, 移植的组织将保持休眠状态, 直到现有的组织变得衰老。虽然移植卵巢的血管重建很快发生, 移植接受者可能需要相当长的时间适应新的下丘脑/垂体/性腺/肾上腺 (HPG/a) 轴信号机制与移植组织.这通常需要大约100天的鼠标。因此, 移植实验的设计应适应这一适应期。卵巢移植的典型结果将包括接受者健康状况的变化, 反映移植卵巢的年龄, 而不是接受者的按年代年龄。
Introduction
生殖对健康和寿命的影响常常被误认为仅限于生育能力的时期。虽然与繁殖的生命周期的相关阶段的生活方式和表型很容易区分从前和 postreproductive 阶段, 生殖状态影响健康在整个生命周期的所有阶段。生殖能力的时期通常被称为生殖生命的跨度, 区别于时间的生命跨度。这一术语在现实中是对两个生命跨度的指定进行人工分离, 两者是紧密联系在一起的, 影响一个人的事件, 往往也会影响到另一个。
过去十年的证据表明, 个人的生殖状况与发展慢性健康状况的风险增加有关1。一项研究记录了一组男性的短寿命和生殖衰竭之间的关联2。这个协会在女性中更引人注目。绝经前妇女的心血管疾病是罕见的3, 但卵巢衰竭增加心血管疾病急剧在更年期4和年轻妇女过早卵巢衰竭5。胰岛素抵抗6和绝经后骨质疏松症7和接近2/3 的美国老年痴呆症患者为女性8。卵巢信号的定义明确的变化标志着从绝经前, 抗病的状态, 到绝经后, 疾病负担状态的转变。这种稳定的过渡, 提供了一个机会, 以确定机制, 加速疾病风险的老龄化。
最近, 保存的卵巢组织移植已被用于恢复妇女的生育能力, 这可能危及生殖细胞, 如化疗。卵巢组织移植还可用于在非卵巢基不孕的动物中产生可行的后代, 包括转基因小鼠9。卵巢移植是一种有效的方法, 以分离的影响, 生殖功能或生殖衰老的时间老化本身。
卵巢激素在女性健康的许多方面都得到了良好的支持, 这就导致了在更年期引起的疾病风险增加的主要原因, 即积极循环生殖细胞产生的激素损失。虽然卵巢激素在女性健康中的价值是不容置疑的, 但在绝经后妇女中取代这些荷尔蒙对恢复年轻卵巢的年轻妇女的健康福利是不可靠的。这些健康好处得到可靠地恢复通过 heterochronic 移植年轻卵巢到 postreproductive 雌性小鼠10,11,12,13,14。
捐献者和受赠小鼠的生殖状态应在移植或卵巢切除术之前和之后确定。假定 postreproductive 小鼠在12月的手术前显示性腺输入的迹象, 这些实验不包括在内。性腺输入是由阴道细胞学决定的。阴道细胞学资料收集至少连续10天前手术, 以确保 postreproductive 状态的受体小鼠和积极循环卵巢的捐助小鼠。一个发情周期的定义是从当天有核上皮细胞第一次出现的时期 (即, 发情前期) 的前一天出现有核上皮细胞在阴道涂片, 只要有一个时期的白细胞介于两者之间的存在 (即、diestrus)。发情是由存在的大, 鳞状上皮细胞, 有或没有细胞核。在手术前和/或术后10天内不显示周期性活动的小鼠, 确定没有性腺输入。在手术前和/或术后10天内显示至少一个完整的发情周期的小鼠, 确定有性腺输入的期间。雌性小鼠应安置在雄性小鼠的面前, 或暴露于从雄性笼子里弄脏的床上用品上, 以确保持续暴露于循环诱发的刺激。
这些移植程序是最有效的完成与两个外科医生同时工作的捐助者和接受的老鼠。然而, 程序很容易完成的一个外科医生, 与捐赠卵巢最经常恢复之前开始的卵巢切除手术的收件人鼠标。该协议描述了单个外科医生的程序。暴露的生殖道和关闭的网站通常是没有显微镜, 而删除和更换卵巢是在显微镜下完成。与学习任何外科手术一样, 切口部位可能更大, 手术可能需要更长的时间, 而首先学习的过程, 并通常会减少与经验。
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Protocol
这里描述的所有方法都是根据国家研究委员会的指导方针在实验室动物的护理和使用指南中制定的, 并已得到犹他州立大学动物保育和使用委员会的批准。
注: 卵巢移植程序可能涉及小鼠 (CBA/J 菌株) 从21天的年龄到18月的年龄。CBA/J 菌株的小鼠在45和60天的年龄和繁殖衰老之间成为繁殖能力在10和12月之间。
1. 完整卵巢移植治疗老龄小鼠
注意: 第一个协议描述了在将卵巢从幼鼠 (60 天) 转移到同一自交系的 postreproductive 雌性 (12 月) 的过程中使用的程序。同一程序用于卵巢移植两个雌性小鼠之间。
- 通过腹腔 (ip, 27 ga 针) 注射来称量和麻醉捐赠动物, 例如使用氯胺酮、甲苯噻嗪和乙酰丙嗪鸡尾酒 (65 毫克/千克氯胺酮, 13 毫克/千克甲苯噻嗪2.0 毫克/千克, 乙酰丙嗪; 鸡尾酒剂量-6.5 毫升/千克)。将动物送回加热的家庭笼子, 直到麻醉生效。
- 一旦麻醉, 把动物从笼子里取出, 放在加热的纸巾上。使用剪刀 (#40 刀片首选), 删除的头发几毫米侧向中线两侧, 开始刚刚下方的肋骨和移动远端, 准备一个修剪 ' 补丁 ' 约2-3 厘米正方形的任何一侧的容易老鼠离开一条头发大约1-2 厘米覆盖中线。
- 用70% 乙醇轻轻擦拭修剪过的区域, 用棉尖拭子将 betadine 溶液涂抹在修剪过的部位。
- 应用抗生素凝胶进行眼部保护, 并管理 meloxicam (2.0 毫克/千克) 皮下 (南卡罗来纳州, 27 ga 针) 在动物颈部的侧面, 用于术后疼痛缓解。
- 将动物置于易受加热的无菌手术领域, 用70% 乙醇浸泡的2厘米 x 2 厘米棉纱布擦拭修剪过的区域。
- 做一个 1.0-1.5 厘米 paralumbar 切口和坦率地解剖皮肤从底层筋膜。再通过筋膜切开切口。坦率地解剖在这个筋膜之下尽可能表面上尽可能, 直到到达腹腔
- 在切口上放置一个小的手术悬垂 (从2厘米 x 2 厘米的纱布切开), 用无菌生理盐水湿润褶皱。
- 使用小钳, 定位周围的卵巢在腹腔的脂肪组织, 并轻轻地提取脂肪垫和卵巢, 并把它放在湿纱布悬垂。卵巢脂肪垫将出现更多的 ' 白色 ' 比周围的脂肪组织。
- 放置一个1.5 英寸斗牛犬钳在脂肪垫 (注意不要阻碍卵巢囊), 以保持在该过程中的地方。
- 将解剖显微镜移到原处, 明确辨认卵巢囊。用两个制表钳抓住囊, 切开卵巢脐对面的卵巢囊, 露出卵巢。如果囊中的预期进入区是高度血管化的, 用注射器将一滴肾上腺素 (1:100,000) 放在囊壁表面, 以减少撕裂时的出血。
- 轻轻地从卵巢囊中取出卵巢, 用制表钳夹在卵巢脐上, 以防止出血。
- 将供体卵巢放在观察玻璃填充 4° C 无菌生理盐水, 松散覆盖和预留, 直到准备移植。理想情况下, 将手表玻璃置于额外的解剖显微镜下, 以便外科医生在移植时能很容易地掌握卵巢。
- 此时, 无论是弄死还是搁置捐赠鼠标 (必须不断监测), 以接收移植的卵巢, 组织, 细胞或占位玻璃珠在以后的时间点。
- 用干净的手术场地和仪器, ovariectomize 的受体动物。年长的老鼠往往有增加的脂肪组织数量, 可能需要增加麻醉剂量 (高达 20%)。
- 切除后的卵巢从接受者, 放置一个小块止血泡沫垫内的空囊, 以控制出血和援助凝血和放置一小块盐水浸泡纱布在暴露的地方。
- 一只手找到一个捐献者卵巢 (或组织, 细胞, 占位玻璃珠) 与钟表匠钳, 进入显微镜视野。另一钳在相反的手, 取出纱布, 同时从囊中取出止血泡沫垫, 同时放置新的卵巢囊内。
- 如果新的卵巢不适合在接受者囊内, 切开捐赠子房在一半 (或1/3 或 1/4) 和安置入囊在片断。如果囊不完全覆盖整个卵巢, 放置一个缝合通过囊, 通过卵巢和背部通过囊, 以举行卵巢在地方 (参见讨论部分)。
注: 玻璃的地方持有人珠可能难以处理钟表匠的镊子。 - 当在囊中放置一个玻璃珠, 拿起大钳的珠子和下降的脂肪垫旁边的卵巢囊。把珠子滚入囊中。
- 拿起一个 Castroviejo 针持有人已经加载了锥形针和9-0 或10-0 单丝缝合, 找出撕裂边缘的囊和关闭囊使用一个或两个霍尔斯特德缝合。
注: 缝合可以与钟表匠或其他小钳一起执行。 - 用无菌生理盐水轻轻冲洗部位, 取出脂肪垫钳, 并将卵巢/脂肪垫送回腹部。
- 取下悬垂, 用6-0 铬肠或 vicryl 关闭腹壁。这一步可以使用或没有显微镜。
- 将显微镜移到一旁 (如果不在上一步移动), 并关闭皮肤与9毫米伤口剪辑。
- 将动物放在一个加热的恢复笼中, 从光线中遮蔽, 直到麻醉恢复后才能持续监测动物。额外的 meloxicam 可在手术后24小时使用, 如果表明。手术后九天左右取出伤口夹。
注: 未采用免疫抑制技术, 移植后或死亡时未发现移植物抗宿主病的证据。
2. 将生殖细胞耗尽的卵巢移植到完整的小鼠体内。
注意: 这个协议包括将卵巢从一个年轻的, 生殖细胞耗尽的老鼠转移到一个 postreproductive 的雌性。在本议定书中, 卵巢接受者和卵巢切除术和移植程序是一样的, 除了移植的卵巢已被化学耗尽的原始和主要卵泡/生殖细胞。其余的二级和窦卵泡将进行招募/闭锁离开卵巢缺乏生殖细胞。4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) 的生殖细胞损耗很好地描述为16。VCD 是一种毒素。由于 vcd 处理的卵巢被移植到一个未被治疗的小鼠, 这一程序得益于一个 vcd 处理的卵巢在鼠标不暴露的毒性影响 vcd。本议定书描述了幼鼠、卵巢捐献者的胚胎细胞耗尽的过程。
- 稀释 VCD (64 毫克/毫升) 在芝麻油注射和存储在 4° C, 直到使用。
- 每天注射一次卵巢捐献者的 VCD (160 毫克/千克), 15 天开始在28天的年龄。在相同的时间安排下, 用芝麻油注射控制小鼠。
- 在50天的年龄, 检查 VCD 治疗和油只处理小鼠停止生殖周期性10天以上。在60天的年龄, VCD 治疗小鼠应该不显示性腺输入的细胞学证据。
- 恢复卵巢从60天老鼠和移植如上。
- 通过检测缺乏生殖循环和提高循环 androstenedione 的水平, 确定成功移植生殖细胞衰竭卵巢的方法。雄激素: 与 VCD17的生殖细胞耗尽后雌激素比值显著增加。
- 术后10-14 天开始阴道细胞学检查, 收集数据至少连续10天, 以确保准确测定周期性。
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Representative Results
在21天的卵巢切除将避免在青春期开始时对生殖系统进行重大的调控, 并消除雌性性腺除了对性腺激素的直接影响之外还可能产生的其他影响。CBA/J 小鼠的生殖衰退通常以8-10 月的不规则周期开始。在11月的年龄, 大多数雌性在这条线的老鼠已经达到了一个繁殖失败的点15与完全失去反应性卵母细胞12月的年龄。这些年龄不同的小鼠品种。双侧卵巢切除/卵巢移植通常在几天内导致移植卵巢的活化。在移植前不移除接受者的内源性卵巢 (半卵巢切除术) 将导致移植的卵巢保持休眠状态, 直到其余内源性卵巢被移除。外科手术通常是在一个开放的领域 (exteriorizing) 和解剖显微镜下进行 (卵巢切除和移植手术)。
延长寿命
CBA/J 雌性小鼠平均寿命为644天18。接受手术的小鼠 (假的卵巢切除和立即替换) 或移植) 被选择至少活到手术时间。根据实验, 这是在11和18月的年龄之间。在最初的实验中19, 手术是在11月的年龄和假鼠平均寿命728天 (手术后393天) 和完整的小鼠, 接受新的卵巢居住811天 (476 天过去手术, GC-TX-1,图 1)。在最近的一次实验中, 手术是在17月的年龄进行的, 接受新卵巢的老鼠活了798天 (过去的手术, GC-TX-2 的281天)。接受生殖细胞衰竭卵巢的老鼠将此延长到平均寿命880天 (手术后363天)。
延长健康范围
接受新的生殖细胞卵巢的老鼠明显减少了心血管疾病10和骨科疾病11 , 显示了几个健康跨度参数的显著改善。Postreproductive 小鼠在12月的年龄接受新的卵巢, 并在16月的年龄进行测定, 显示骨骼肌减少 12, 改善免疫和肾功能 13, 改善认知行为和感官功能 14.
细菌细胞耗竭的验证
治疗28天老女子 CBA/J 小鼠15天的 VCD 导致原始和主要 (生殖细胞) 卵泡耗尽。CBA/J 小鼠只分析了37天后, vcd 治疗已经显示停止生殖周期性 (持续性阴道角化), 减少卵巢重量 (1.7 毫克的油只与0.9 毫克的 vcd 治疗) 和耗尽原始和主要卵巢卵泡, 与对照组比较 (图 2)。
图 1:年轻卵巢对 postreproductive 患者生命周期的影响.幼卵巢移植到11月大的小鼠寿命延长 11% (GC-Tx-1 n = 14, 接受60天龄, 生殖细胞-含有新的卵巢在11月的年龄)。年轻卵巢移植在17月的年龄没有产生变化的寿命延长 (GC-Tx-2 n = 5, 收到60天, 生殖细胞-含有新的卵巢在17月的年龄)。在移植前从幼卵巢中耗尽生殖细胞加倍延长寿命到 21% (GD-Tx n = 5, 接受60天老, 生殖细胞耗尽新的卵巢在17月的年龄)。死亡年龄:请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: CBA/J 小鼠的小卵泡的 VCD 损耗.H & 电子染色部分 (25X) 显示 (A) 丰富的小卵泡在油处理 (n = 6) 小鼠, (B) 减少 VCD 处理 (n = 4) 小鼠和 (C) 小卵泡的数量, 以及原始和初级的显著差异卵泡数。箭头表示原始和主要卵泡。误差线表示 SE.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在21天至18个月的小鼠中进行了卵巢切除和完整和生殖细胞衰竭卵巢的移植。在进行卵巢切除手术的时候, 最好在适当的情况下, 在切开该囊组织时要注意。在年龄在六月以上的小鼠中, 大部分的囊膜与脂肪垫覆盖, 这限制了可用于进入的区域。在这些情况下, 通常有利于撕裂囊打开接近脂肪垫边界。这种方法经常留下一个更容易接近的 "口袋" 的法氏囊组织 "塔克" 新的卵巢内囊。这种方法也可以减少缝合, 以关闭法氏囊组织。旋转在囊侧的开口也可以帮助保持新的卵巢在缝合过程中的位置。
有时, 由于过量的脂肪垫覆盖, 不寻常的方向, 或恢复难以检索的卵巢组织片段, 囊中组织需要广泛开放。在这些情况下, 新的卵巢可能无法有效地 ' 塞入 ' 囊中。如果卵巢是设置在开放囊的顶部和超过一半的卵巢被其余的法氏囊组织覆盖, 一个钱包字符串缝合被放置在囊撕裂边缘和周围的卵巢。当钱包慢慢收紧, 卵巢被向下推入剩余的囊中, 囊被关闭足够远, 以保持卵巢到位, 但可能不完全关闭。如果卵巢是设置在开放囊的顶部, 而不到一半的卵巢被其余的法氏囊组织覆盖, 缝合被放置在一个侧面的囊撕裂边缘, 通过卵巢, 通过在对面的囊和打结在顶部卵巢。这种方法可能需要多缝合, 不会导致完全覆盖卵巢由法氏囊组织。然而, 这种方法将保持卵巢到位, 并允许有效的血管重建和最终恢复卵巢活动。
在进行卵巢切除手术时, 在需要保持卵巢囊完整的地方, 也必须注意确保所有内源性卵巢组织被除去。这可能是困难的与一个大内生卵巢。为了尽可能保存尽可能多的囊内组织, 大的卵巢可以被切除成碎片。然而, 当使用这种方法, 必须格外警惕, 以确保所有内源性卵巢组织被删除。这可能是困难后, 部分卵巢被删除, 囊中充满了血液。一个小块的止血泡沫垫可以放到开放囊中, 以取代血液和协助凝血囊内。30-60 秒后, 止血泡沫垫被删除, 并检查囊 (囊也可以轻轻冲洗与生理盐水), 以存在任何剩余的卵巢碎片。
卵巢移植需要将移植的卵巢与其既定的血液供应分离, 并在新的家庭中不立即进行卵巢重建。因此, 移植卵巢经历了一些坏死, 主要涉及成熟和/或吸收卵泡。然而, 绝大多数移植的卵巢在移植后不久就显示出循环活动, 一些移植受体将继续循环到死亡。因此, 移植性坏死引起的卵泡脱落并没有强烈影响移植卵巢的建立与新宿主的融合。
哺乳动物衰老的一个普遍观点是雌激素是唯一重要的生殖对健康的影响。在接受新卵巢的老鼠的健康方面, 观察到的戏剧性变化很容易被认为是循环雌激素水平的简单恢复。然而, 在最近的一项研究中, 由三个实验室20独立复制, 17 α雌二醇在从10月龄喂养时对女性生命周期没有影响。这当然不像更知名的17β雌二醇那样的荷尔蒙, 但许多与健康相关的雌激素效应被归因于 17-α雌二醇信号21。雌激素疗法对绝经后妇女的许多与年龄有关的病理都有积极和消极的影响, 而且对绝经后妇女的影响明显不像年轻妇女那样。虽然生殖细胞刺激的雌激素生产对生殖至关重要, 在更年期, 生殖细胞耗尽的卵巢仍然具有促进健康的特性, 因为 postreproductive 卵巢的移除进一步增加死亡率, 包括与年龄有关的疾病22。去卵巢小鼠的寿命比假手术小鼠略短 (715 天对728天, 分别为19)。如果影响长寿的机制在进化上是守恒的, 来自模型有机体的证据就会反驳哺乳动物的健康跨度扩展的雌激素唯一解释。
卵巢和无活性生殖细胞的移植已经恢复了健康的好处, 仅仅是荷尔蒙治疗难以达到的水平。老年小鼠主动卵巢功能的重建对健康的许多方面都有负面影响, 这对女性的衰老有积极的影响。然而, 最近的试验研究表明, 这些影响可能在一定程度上与卵巢生殖细胞激素无关。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这份出版物中的研究报告得到了来自国立老龄研究所、老龄啮齿动物群体 (南 Nadon) 和犹他州立大学、兽医学院、动物、乳品学系的14月龄女子 CBA 小鼠的慷慨捐赠。和兽医科学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Any dissecting scope with an adjustable working distance. | ||
| Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field. | Stryker/Gaymar | TP700 | Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields. |
| Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract | Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific | ||
| Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure. | Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific | ||
| Suture material for abdominal wall | eSutures | G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED | |
| Suture material for ovarian bursa | eSutures | 2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER | 10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field. |
| Absorbable gelatin sponge | PFIZER. | Gelfoam- PFIZER 09-0315-08. | cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions. |
| Staples for skin closure | Becton Dickinson | MikRon Autoclip 9mm (BD 427631) | |
| Eye ointment. | MWI Veterinary Supply Co. | Puralube sterile opthalmic ointment | |
| Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine | MWI Veterinary Supply Co. | BD 305536 | 27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml |
| Syringes for saline. | MWI Veterinary Supply Co. | BD 309657. | 3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle |
| Clippers/blade | Andis | Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade. | Any clippers with a fine blade. |
| Ethanol | University chemical supply | dilute to 70% for use. | |
| Betadine solution | MWI Veterinary Supply Co. | 003233 | |
| 2x2 gauze pads | MWI Veterinary Supply Co. | 003073 | autoclaved with surgery packs |
| Borosilicate glass beads | Sigma-Aldrich Co. | Z273619 | Autoclave in sintilation vials |
| 4-vinylcyclohexene diepoxide | Sigma-Aldrich Co. | 94956 | |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich Co. | S3547 |
References
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