Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Um Wachstum mit seiner Umwelt zu koordinieren, haben Pflanzen entwickelt, elegante Signalwege spüren, transduzieren und Signalisierung Signale reagieren. Wie die Läufer in einem Staffellauf sind Proteine notwendig Spieler in der Pflanze Signaltransduktion. Es ist weithin anerkannt, dass Protein-Protein Wechselwirkung (PPI) eine wichtige Rolle für die zelluläre Kommunikation spielt. Protein-Phosphorylierung, Acetylierung und Abbau sind alle abhängig von physikalische Interaktion zwischen einem Zielprotein und seine modifizierende Enzyme. Z. B. Jasmonate ZIM-Domain Protein (JAZ) Familie Proteine interagieren mit Transkriptionsfaktor MYC2 und unterdrücken die transkriptionelle Aktivität^1,2. Angesichts der Bedeutung der PPI erforschte große Protein Interactomes in Pflanzen wurden vor kurzem^3,4,5. Diese Interaktom Ergebnisse weiter zeigen die komplexen regulatorischen Netzwerk, das diverse Zellfunktionen koordiniert.

Es gibt einige etablierte Ansätze für die Überwachung der PPI. Hefe-zwei-Hybrid (Y2H)-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Erkennung von PPI. Y2H ist einfach durchzuführen und eignet sich für einen schnellen Test, Protein-Interaktionen zu untersuchen. Y2H ist auch am meisten benutzt für das screening von unbekannten Interaktionspartner für das spezifische Protein von Interesse. Jedoch weil Y2H vollständig in der Hefe erfolgt, kann nicht es spiegeln die reale Szenario im Werk Zellen und bringt hohe falsch positiv Rate. Eine weitere ähnliche Strategie ist die Pulldown-Assay. In der Regel zwei Proteine sind zum Ausdruck gebracht und von Escherichia coli Zellen gereinigt und dann gemischt und immobilisiert zum Nachweis von Protein-Interaktionen. Obwohl diese Methode nicht zeitaufwändig ist, kann nicht es in Vivo Interaktion Ergebnisse entweder erhalten. Zwecken in Vivo Interaktion ist co-Immunopräzipitation (co-IP) die beliebtesten Assay, die qualitativ hochwertige Antikörper gegen Immunoprecipitate das Protein des Interesses erfordert und nicht ausgeschlossen, der indirekten PPI. Darüber hinaus variieren die Ergebnisse aufgrund der komplizierten experimentellen Verfahren in co-IP in der Regel mit individuellen Erfahrungen.

Reporter basierte Rekonstitution Assays fördern stark die Erkennung von in Vivo PPI. Diese Methoden umfassen Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)⁶, bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC)⁷und die Glühwürmchen Luciferase Komplementierung imaging (LCI) Assay⁸. Diese drei Ansätze besser als co-IP entsprechend direkt in Vivo PPI, Bund und BiFC benötigen spezielle Mikroskope, Fluoreszenz-Signale zu erkennen und nicht einfach die Intensität der Interaktion quantifizieren. Im Gegensatz dazu nutzt LCI Firefly Luciferase, die nach der Reaktion mit seiner Substrat Luciferin Leuchten wird. Noch wichtiger ist, kann PPI Intensität vom Wert der Luciferase-Aktivität bestimmt werden. LCI gibt also nicht nur ob zwei Proteine interagieren oder nicht, sondern bietet auch Informationen über die Interaktion Dynamik bei der Behandlung. Zwar gibt es einige bewährten Methoden für die Überwachung der Interaktion Dynamik (basierend auf Oberflächen Plasmon Resonanz oder Thermo-Stabilität Verschiebungen)^9,10, erfordern diese Ansätze empfindliche Instrumente oder spezifische Kennzeichnung. Im Gegensatz dazu ist LCI einfacher zu erkennen.

Das Prinzip für LCI ist, dass die amino-terminalen und Carboxylgruppen-Terminal Hälften der Luciferase (benannt N-Luc oder C-Luc) wurden fusioniert mit Protein A und B und diese zwei Schmelzverfahren Proteine wurden gleichzeitig in Pflanzenzellen ausgedrückt. Protein A mit B-Protein interagiert, werden die beiden Hälften der Luciferase wiederhergestellt werden, um eine aktive Luciferase Enzym sein. Luciferase-Aktivität kann mit einem Luminometer oder CCD-Kamera erkannt werden. Es ist nicht notwendig, stabile Transformanten für LCI zu erhalten; transiente Expression ist genug, um eine qualitativ hochwertige Interaktion Ergebnis zu erhalten.

RING-Typ E3 Ubiquitin Ligase konstitutive Photomorphogenic 1 (COP1) mit einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren interagiert und fördert deren Abbau durch die 26S Proteasom¹¹. Einige von diesen COP1 ausgerichtete Transkriptionsfaktoren sind positive Regulatoren für Photomorphogenesis. In der Dunkelheit interagiert COP1 mit Suppressor Phytochrom a-105 1 (SPA1), die COP1 E3 Aktivität⁸verbessert. Nach Wahrnehmung des Lichts werden Photorezeptoren COP1 SPA1 Interaktion um COP1 Aktivität hemmen und dann stabilisieren COP1 Substrate^12,13,14aufzuheben. Dieses Beispiel veranschaulicht die biologische Bedeutung der PPI zu studieren und die Bestimmung der PPI Dynamik.

1. Vorbereitung der Pflanzen (8 Wochen)

1. Setzen Sie 50 Nicotiana Benthamiana Samen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL 5 % NaClO und 0,1 % Triton x-100 (V/V) Lösung und lassen für 5 min um die Samen zu sterilisieren.
2. Spülen Sie die Samen mit sterilem Wasser 5 Mal und auszusetzen Sie Samen in 200 µL steriles Wasser.
3. Sorgfältig Ort einzelne Samen auf der Oberfläche des MS-Agar Medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog Salze, 10 g Saccharose, pH 5.8 (KOH), 1 % Agar) mit feinen Spitzen und Geschäft mittleren Platten in 4 ° C für 3 Tage, um die Keimung zu synchronisieren.
   Hinweis: Um die Mikrobe Kontamination zu vermeiden, führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Werkbank. Es ist nicht notwendig, das Rohr während der Sterilisation zu schütteln.
4. Mittlere Platten unter normalen Wachstumsbedingungen (22 ° C, 80-90 µmolm^-2s^-1 weiße Lichtintensität) für 10 Tage, und übertragen Sie dann die gekeimten Sämlinge in Boden.
   Hinweis: Legen Sie ein Sämling Wurzeln in Erde und nicht beschädigen Sie die Wurzeln. Decken Sie das Fach mit einer transparenten Kunststoff-Abdeckung über Nacht weiterhin Feuchtigkeit.
5. Wachsen Sie Pflanzen in ein kontrolliertes Wachstum Zimmer auf einer 16 h/8 h hell/dunkel-Zyklus und 70 % Luftfeuchtigkeit. 7 Wochen alten N. Benthamiana Pflanzen sind bereit für die Agrobacteriumtumefaciens Infiltration (Abb. 1A).
   Hinweis: Wasser Pflanzen und Schädlinge zu kontrollieren, wie notwendig, um die Pflanzen gesund zu halten.

(2) transiente Expression in N. Benthamiana Blättern (7-10 Tage)

1. Liefern 150 ng der Plasmide (pEGAD-HA-LUC Kontrolle Plasmid, leerer Vektor und konstruierte Plasmid für LCI assay, in diesem Fall verwendeten wir pCAMBIA1300-Nluc und pCAMBIA1300-Cluc für Plasmid Bau) in A. Tumefaciens zuständigen Zelle Stamm GV3101 mit einem Standard-Elektroporation-Methode.
2. Kultur A. Tumefaciens Luria-Bertani (LB) Agar Medium (1 L: 10 g NaCl, Hefeextrakt 5 g, 10 g Tryptone, 1,5 % Agar) mit 50 µg/mL von Kanamycin und 50 µg/mL von Rifampicin bei 28 ° C für 4 Tage.
   Hinweis: Die Auswahl der Antibiotika richtet sich nach den Vektor und die A. Tumefaciens Belastung verwendet.
3. Impfen eine einzelne A. Tumefaciens Kolonie von jeder Platte in 3 mL LB-Medium flüssig, enthält 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL von Rifampicin und schütteln bei 220 u/min bei 28 ° C für 24 h, Zellkultur zu verbreiten.
4. Übertragen Sie 75 µL Bakterienkultur in 15 mL frisches LB flüssigen Medium mit 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL von Rifampicin, verdünnen es mit einem Faktor von 200. Kultur die Bakterien bei 220 u/min bei 30 ° C für ca. 8 h bis OD₆₀₀ zwischen 0,5 bis 1,0 ist.
5. Übertragen der A. Tumefaciens Flüssigkultur in 15 mL Zentrifuge Röhren und Zentrifugieren bei 4.000 x g und 4 ° C für 15 min. überstand verwerfen und unterbrechen das Pellet in 15 mL Transformationslösung Pellet zu waschen.
6. Drehen Sie das Rohr bei 4.000 x g und 4 ° C für 15 min und verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie waschen noch einmal.
7. Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 mL Transformationslösung und halten Sie für 2 h bei Raumtemperatur. Passen Sie die Dichte von A. Tumefaciens Pellet Zellen mit Transformationslösung, bis die Endkonzentration von OD₆₀₀ 0,5 oder Mischung zwei Proben in gleicher Lautstärke für Tests gekoppelten Proteininteraktionen ist.
8. Infiltrieren Sie suspendierte Zellen in der 4^th 7^th -Blätter mit einer 1 mL nadellosen Spritze (Abbildung 1B-C). Nach Infiltration Pflanzen sofort mit einer schwarzen Kunststoffabdeckung abdecken und das Tablett in der Dunkelheit für 12 h. Danach wachsen Sie Pflanzen wie üblich für 2 bis 4 Tage vor Erkennung LUC Aktivitäten.
   Hinweis: Wählen Sie gesunde Blätter von ähnlicher Größe. Das Eindringen von vier verschiedene Zonen in einem Blatt ist in Ordnung.

3. Erkennung von Luciferase Aktivität (ein Tag)

Hinweis: Es gibt zwei Möglichkeiten um Luciferase-Aktivität zu überwachen. Eine basiert auf Bildgebung, und das andere ist, quantitativ Luciferase-Aktivität zu messen.

1. Bildgebendes Verfahren
   1. Nehmen Sie eine infiltrierte Blatt und bringen Sie die gesamte Broschüre auf MS-Agar Medium.
   2. Sprühen Sie Luciferin arbeiten Puffer auf der Blattoberfläche adaxial mit einer 50-mL-Sprühflasche. Halten Sie die Materialien in der Dunkelheit für 5 min um die Chlorophyllfluoreszenz-Auto zu stillen.
   3. Verwenden Sie ein wenig Licht gekühlten CCD imaging-Geräte (bis-30 ° C gekühlt) Aufnahmen (Abbildung 2). Die Licht-eingereicht Expositionszeit beträgt 50 ms und Lumineszenz Erkennung dauert 1 min.
      Hinweis: Stellen Sie die Parameter entsprechend der Maschine benutzt. Niedrigere Temperaturen erhöhen das Signal-Rausch-Verhältnis um die Bildqualität zu verbessern.
2. Alternativ messen Sie Lumineszenz direkt mit einem kommerziellen Luminometer.
   1. Sorgfältig Blatt Fragmente (ca. 0,25 cm²) aus dem Filterbereich der N. Benthamiana Blätter schneiden Sie aus und Tauchen Sie die Blatt-Scheibe in 100 µL deionisiertes Wasser in einer weißen 96-Well-Platte (Abbildung 3).
   2. 10 µL Luciferin Arbeit Puffer und lassen für 5 Minuten. Führen Sie dann bestimmte Behandlungen um die Protein-Interaktion-Dynamik zu studieren.
      Hinweis: Erkennen der Lumineszenz mit einem Luminometer zu verschiedenen Zeitpunkten der Luciferase-Aktivität-Dynamik zu erhalten, die die Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen unter bestimmten Behandlung darstellen. Diese Methode hat Vorteile für eine große Anzahl von Protein-Paare gleichzeitig testen. Für diejenigen ohne eine kommerzielle Luminometer untersuchen die Luciferase Protein Häufigkeiten von western-Blot, daher beziehen sich auf die LUC Aktivität quantitativ. Wenn Licht nicht unbedingt erforderlich ist, nur halten Sie die Platte in die Luminometer und Messen Sie Lumineszenz zu verschiedenen Zeitpunkten zu. Andernfalls verschieben Sie die Platte in eine Kammer Wachstum während der Erkennung Lücke. Um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, verwenden Sie mindestens drei biologische repliziert. Obwohl LUC Aktivitäten aus verschiedenen Infiltration Zonen variieren, entsprechen ihre wechselnden Muster nach der Normalisierung.

Drei wichtige Schritte können in diesem Luciferase Komplementierung Protokoll für ein Studium Proteinprotein Interaktionen in Vivo, einschließlich Pflanzenwachstum, Tabak Infiltration und die Luciferase Assay herausgegriffen. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist flüssige A. Tumefaciens in N. Benthamiana Blätter (Abbildung 1) infiltrieren.

Hier ist ein Beispiel für die Nützlichkeit dieser Technik bestätigt Jasmonat COP1 SPA1 Interaktionen reduziert. Die amino-terminalen und Carboxylgruppen-Terminal Hälften der Luciferase waren verschmolzen mit COP1 (COP1-NLuc) oder SPA1 (CLuc-SPA1), beziehungsweise. COP1-SPA1 Interaktionen führen die Komplementierung des funktionalen Luciferase. Die Luciferase-Aktivität wurde durch CCD-Kamera (Abbildung 2) abgebildet und die enzymatische Aktivität detektiert werden, mit einem Luminometer (Abbildung 3). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass Luciferase selbst richtet sich nach der Behandlung, das Full-length Luciferase (LUC) gen war auch vorübergehend in N. Benthamiana Blätter als Kontrolle dienen zum Ausdruck gebracht. Die Luciferase-Aktivität vor Jasmonat Behandlung (0) wurde als 1 eingestellt, und dann wurde jedes Luciferase Aktivität Wert unter Jasmonat-Behandlung mit der Zeit 0 zu der relativen Luciferase-Aktivität (Abbildung 4) normalisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass COP1 SPA1 Interaktionen (von Luciferase Aktivität reflektiert) allmählich in Dunkelheit abgelehnt, und, dass JA die Behandlung weiter reduziert deren Wechselwirkungen.

Abbildung 1 . Prozess für N. Benthamiana Infiltration. 
(A) Abaxial und adaxial Blick auf Pflanzen vor Infiltration. (B) repräsentatives Bild der Infiltration Protokoll zeigen. (C) Abaxial und adaxial Blick auf Pflanzen nach eindringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Bildgebung Luciferase Aktivität unter CCD-Kamera. 
(A) repräsentatives Bild von einem N. Benthamiana Blatt unter einem normalen Lichtfeld. (B) Detecting Lumineszenz Signale unter CCD-Kamera Luciferase Aktivitäten zeigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Repräsentatives Bild zu zeigen, wie man Lumineszenz von messen schneiden Blatt Festplatten. 
Eingedrungene Blatt Festplatten wurden schneiden und in eine 96-Well weiße Platte zur Messung der Lumineszenz Signale. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 . Vertreter ergibt sich aus einer vorübergehenden Luciferase Komplementierung Assay. 
(A) die Behandlungsdauer (Zeit) und den ursprünglichen Ergebnissen der Lumineszenz-Wert (LUC Aktivität) aufgeführt wurden. Es gibt drei unabhängige Wiederholungen für jede Probe. Für die Vorbereitung dieses Diagramms, wurde LUC Aktivität zu Zeitpunkten unterschiedliche Behandlung mit der Zeit 0 als relative LUC Aktivität normalisiert.
(B) Quantifizierung der relativen LUC Aktivitäten zeigen COP1 SPA1 Interaktionen in der Dunkelheit nach und nach zurückgegangen, die kann durch weitere JA-Behandlung reduziert werden. Der Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung (sd). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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