Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein einfache und schnelles experimentelles Verfahren für die Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die basierend auf der Messung der Luciferase-Aktivität.

Zusammenfassung

Protein-Protein-Interaktionen sind grundlegende Mechanismen zur Weiterleitung von Signaltransduktion in den zellulären Prozessen; Daher, Identifizierung von neuartigen Proteinprotein Interaktion Paare und Überwachung Proteindynamik Interaktion sind von besonderem Interesse für das aufdecken, wie Pflanzen auf Umweltfaktoren und/oder Entwicklungsstörungen Signale reagieren. Eine Fülle von Ansätzen wurde entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, in Vitro oder in Vivozu untersuchen. Unter ihnen ist die kürzlich ins Leben gerufene Luciferase Komplementierung imaging (LCI) Assay die einfachste und schnellste Methode für den Nachweis der in Vivo Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Test ist Protein A oder B-Protein mit der amino-Terminal oder Carboxylgruppen-Terminal Hälfte des Luciferase, verschmolzen. Wenn Protein A mit B-Protein interagiert, werden die beiden Hälften der Luciferase wiederhergestellt werden, um eine funktionelle und aktive Luciferase Enzym bilden. Luciferase-Aktivität kann mit einem Luminometer oder CCD-Kamera aufgezeichnet werden. Im Vergleich mit anderen Ansätzen, zeigt die LCI-Assay Protein-Protein-Interaktionen sowohl qualitativ als auch quantitativ. Agrobakterium Infiltration in Nicotiana Benthamiana Blättern ist ein weit verbreitetes System für transiente Proteinexpression. Mit der Kombination von LCI und transiente Expression zeigen dieser Ansätze, dass die körperliche Interaktion zwischen COP1 und SPA1 allmählich nach Jasmonat-Behandlung reduziert wurde.

Einleitung

Um Wachstum mit seiner Umwelt zu koordinieren, haben Pflanzen entwickelt, elegante Signalwege spüren, transduzieren und Signalisierung Signale reagieren. Wie die Läufer in einem Staffellauf sind Proteine notwendig Spieler in der Pflanze Signaltransduktion. Es ist weithin anerkannt, dass Protein-Protein Wechselwirkung (PPI) eine wichtige Rolle für die zelluläre Kommunikation spielt. Protein-Phosphorylierung, Acetylierung und Abbau sind alle abhängig von physikalische Interaktion zwischen einem Zielprotein und seine modifizierende Enzyme. Z. B. Jasmonate ZIM-Domain Protein (JAZ) Familie Proteine interagieren mit Transkriptionsfaktor MYC2 und unterdrücken die transkripti....

Protokoll

1. Vorbereitung der Pflanzen (8 Wochen)

1. Setzen Sie 50 Nicotiana Benthamiana Samen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL 5 % NaClO und 0,1 % Triton x-100 (V/V) Lösung und lassen für 5 min um die Samen zu sterilisieren.
2. Spülen Sie die Samen mit sterilem Wasser 5 Mal und auszusetzen Sie Samen in 200 µL steriles Wasser.
3. Sorgfältig Ort einzelne Samen auf der Oberfläche des MS-Agar Medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog Salze, 10 g Saccharose, pH 5.8 (KOH), 1 % Agar) mit feinen Spitzen und Geschäft mittleren Platten in 4 ° C für 3 Tage, um die Keimung zu synchronisieren.
   Hinweis: Um die Mikrobe Kontamination zu vermeiden, fü....

Ergebnisse

Drei wichtige Schritte können in diesem Luciferase Komplementierung Protokoll für ein Studium Proteinprotein Interaktionen in Vivo, einschließlich Pflanzenwachstum, Tabak Infiltration und die Luciferase Assay herausgegriffen. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist flüssige A. Tumefaciens in N. Benthamiana Blätter (Abbildung 1) infiltrieren.

Hier ist ein Beispiel fü.......

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ist einfach und reproduzierbar für das Studium in Vivo Protein-Protein-Interaktionen und besonders geeignet zur Erkennung von Proteindynamik Interaktion unter exogenen Behandlung. Der wichtigste Schritt in diesem Assay ist N. Benthamiana Infiltration. Um Infiltration Erfolg zu gewährleisten, müssen die Pflanzen sehr gesund sein. Ein weiterer kritischer Faktor ist, wenn Luciferase Aktivität nach eindringen zu überprüfen. Es gibt keine richtige Antwort auf diese Frage. Fors.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Transformationslösung
10 mM Morpholineethansulfonsäure	VETEC	V900336
27,8 mM Glukose	VETEC	V900392
10 mM MgCl2× 6H2O	VETEC	V900020
150 μ M Acetosyringon	ALDRICH	D134406
pH 5,7
Luciferin Arbeitspuffer
5 mM Luciferin Kaliumsalz	GOLD BIOTECHNOLOGIE	LUCK-100
0,025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O bis 10 ml