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Methodenartikel

Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1

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DOI:

10.3791/56651

⸱

13. Februar 2018

 ,  , 
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research, Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory, Kaohsiung Medical University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein experimentelles Modell der reinen kleine Faser Neuropathie mit Resiniferatoxin (RTX). Eine einmalige Dosis von RTX (50 µg/kg) ist optimal für die Entwicklung eines Modells der kleine Faser-Neuropathie, die Patientencharakteristika imitiert und könnte dazu beitragen, die nozizeptiven molekularen Bedeutung zugrunde liegenden neuropathischen Schmerzen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Patienten mit Diabetes Mellitus (DM) oder diejenigen erleben die neurotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika entstehen Empfindung Störungen durch Degeneration und Verletzung von kleinem Durchmesser sensorischen Neuronen, als kleine Faser Neuropathie bezeichnet. Derzeitigen Tiermodelle der kleine Faser Neuropathie beeinflussen sowohl große und kleine-Durchmesser sensorischen Fasern und schaffen damit eine Neuropathologie zu komplex, um die Auswirkungen der verletzten kleinem Durchmesser sensorischen Fasern richtig einschätzen zu können. Daher ist es notwendig, ein experimentelles Modell der reinen kleine Faser Neuropathie, diese Fragen hinreichend zu prüfen zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Modell der kleine Faser Neuropathie speziell auf kleinem Durchmesser Sinnesnerven mit Resiniferatoxin (RTX), ein ultrapotent-Agonist der Transienten Rezeptor potential Vanilloid Typ 1 (TRPV1), durch eine einzelne Dosis von intraperitoneale Injektion als RTX Neuropathie bezeichnet. Dieser zeigte pathologischen Erscheinungen und Verhaltens-Anomalien, die die klinischen Merkmale der Patienten mit Neuropathie kleine Faser, einschließlich Intraepidermal Nervenfaser (IENF) Degeneration, insbesondere Verletzungen im nachahmen RTX-Neuropathie kleinem Durchmesser Neuronen und Induktion von thermischen Hypoalgesia und mechanische Allodynie. Dieses Protokoll getestet drei Dosen von RTX (200, 50 und 10 µg/kg, beziehungsweise) und kam zu dem Schluss, dass eine kritische Dosis von RTX (50 µg/kg) ist für die Entwicklung der typischen kleinen Faser Neuropathie Manifestationen erforderlich und ein veränderter Immunostaining Verfahren zur IENF Degeneration und neuronale Soma Verletzungen zu untersuchen. Das geänderte Verfahren ist schnell, systematische und wirtschaftliche. Verhaltens Bewertung des neuropathischen Schmerzes ist entscheidend für die Funktion von kleinem Durchmesser sensorischen Nerven zu zeigen. Die Bewertung der mechanischen Schwellen in experimentellen Nagetiere ist eine besondere Herausforderung, und dieses Protokoll beschreibt eine maßgeschneiderte Metallgewebe, die für diese Art der Bewertung bei Nagetieren geeignet ist. Zusammenfassend lässt sich sagen dass RTX Neuropathie ein neues und gut etablierten experimentellen Modell zur Bewertung der molekularen Bedeutung und Intervention zugrunde liegenden neuropathischen Schmerzen für die Entwicklung von Therapeutika.

Einleitung

Kleine Faser Neuropathie bei neuropathischen Schmerzen, die durch Degeneration der IENFs hervorgeht, ist häufig in verschiedenen Arten von Bedingungen, wie z. B. DM und als Folge die neurotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika1,2, 3,4,5. IENFs sind die peripheren Terminals von kleinem Durchmesser Neuronen befindet sich in den dorsalen Wurzel Ganglien (DRG) und parallel in Fällen von IENF Degeneration6betroffen sind. Beispielsweise wurde die veränderte vorgelagerten genetische Transkription des neuronalen Somata durch die Hochregulierung des Aktivierens Transkription Faktor 3 (ATF3)6,7nachgewiesen. Darüber hinaus eignet sich die Bewertung der IENFs Innervation mit Hautbiopsie zur Diagnose von small Fiber Neuropathie5,8,9. Traditionell sind die Profile der IENFs auf die Hautbiopsie immunhistochemischen Nachweis der Protein-Genprodukt 9.5 (PGP 9.5)1,10,11angewiesen. Zusammengenommen, die pathologische Profile der DRG und IENFs reflektieren die Funktionszustand zugrunde liegende kleine Faser Neuropathie und möglicherweise ein Indikator für die funktionelle Folgen dieser Art von Neuropathie auf kleinem Durchmesser Neuronen.

Bisher haben mehrere experimentelle Modelle die Angelegenheit der IENF Degeneration in Fällen der Chemotherapie-induzierte Neuropathie12,13 und Nerv Schädigung durch Kompression oder Durchtrennung14,15 , 16. Diese experimentelle Modelle betroffen auch großem Durchmesser Nerven; Daher war es nicht möglich, den Beitrag der betroffenen Großrohre Nerven in den beobachteten kleine Faser Neuropathie; auszuschließen zum Beispiel hängt die Prüfung der Thermosensation Störung durch schädliche Rückzug funktionellen motorischen Nervenfasern17,18,19. So sind eine reine kleine Faser Neuropathie Modell zu etablieren und systematisch untersucht den pathologischen Status der neuronalen Somata und ihre peripheren kutanen Nervenfasern in kleinem Durchmesser Neuronen notwendig und unerlässlich.

RTX ist ein Analogon der Capsaicin und ein potenter Agonist, Transienten Rezeptor potential Vanilloid-Rezeptor 1 (TRPV1), der nozizeptiven Verarbeitung20,21,22vermittelt. Vor kurzem, periphere RTX Behandlung erleichtert neurogene Schmerzen23,24,25 , und eine intraganglionic Injektion von RTX induzierte irreversiblen Verlust der DRG-Neuronen-22. Die Wirkung der peripheren RTX-Verwaltung ist dosisabhängig20,26,27, die die vorübergehende Desensibilisierung oder Degeneration der IENFs geführt. Faszinierenderweise führte systematische Hochdosis-RTX Behandlung zu neuropathischen Schmerzen28, ein Symptom für kleine Faser Neuropathie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung Modus und Dosis von RTX deutliche pathologische Effekte und neuronalen Antworten produzieren; nämlich, periphere Verwaltung Schmerz Übertragung durch lokale Effekte29 verhindert und beeinflusst die neuronalen Somata, die neuropathischen Verhalten6entwickelt. Gemeinsam zeigen diese Erkenntnisse, dass RTX Multipotenz wirkt und die Frage aufgeworfen, ob gibt es eine bestimmte Dosis von RTX, die systematisch die peripheren Nerven, wie die peripheren IENFs und zentralen neuronalen Somata beeinträchtigen könnten. Wenn dies der Fall ist, möglicherweise RTX eine potenzielle Agent gezielt Einfluss auf kleinem Durchmesser Neuronen und kleine Faser Neuropathie in der Klinik zu imitieren. DM in der Klinik ist beispielsweise ein kompliziertes Thema, einschließlich Stoffwechselstörung und Neuropathologie der peripheren Nerven, die die wichtigsten Merkmale der kleine Faser Neuropathie sind. Die Mechanismen der kleine Faser DM-assoziierte Neuropathie konnte nicht den Beitrag der Stoffwechselstörung ausschließen, die nicht der Hauptwirkstoff, die periphere Nerven betreffen kann. Kleine Faser DM-assoziierter Neuropathie erfordert daher eine reine Tiermodell, das die Auswirkungen der systematischen Stoffwechselstörung ausgeschlossen werden konnte. Dieses Protokoll beschreibt die Arbeiten Dosis von RTX, eine typische kleine Faser Neuropathie Modell, einschließlich IENF Degeneration und kleinem Durchmesser Neuron Verletzungen, wie modifizierte Immunostaining Analyse zeigt zu entwickeln.

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Protokoll

Die beschriebenen Verfahren sind im Einklang mit ethischen Richtlinien für Labor Tiere30, und das Protokoll genehmigt wurde, durch die Tier Ausschuss von Kaohsiung medizinische Universität, Kaohsiung, Taiwan.

1. Aufbau der RTX Neuropathie

Vorsicht: RTX ist neurotoxisch und gefährlich. Kontakt fungiert es als reizend auf die Augen, die Schleimhäute und die oberen Atemwege. Nicht einatmen und während RTX Vorbereitung Labor Brillen und Mäntel tragen. Spülen Sie mit viel Wasser bei Hautkontakt oder nach der Handhabung.

  1. Ein 200 µL Mischung aus gleicher Lautstärke von Tween 80 und absoluten Ethanol (100 µL für jedes Lösungsmittel) 1 mg RTX Pulver hinzufügen.
  2. Aliquoten RTX-Lösung (12 µL/Vial) und bei-20 ° C, für bis zu 3 Monate lagern. Dies stellt die RTX-Lager; nach Ablauf die restliche RTX-Lösung zu verwerfen.
  3. Verdünnen Sie die RTX-Aktie mit normalen Kochsalzlösung zu einem Endvolumen von 600 µL. Die Endkonzentration der RTX-Lösung sollte 0,01 %, entspricht 1 µg RTX in 10 µL Fahrzeuglösung.
  4. 8 Wochen alten erwachsenen männlichen ICR Mäuse (35-40 g) als Versuchstiere verwenden und verwalten eine Einzeldosis von RTX-Lösung (Dosis: 200, 50 und 10 µg/kg, beziehungsweise) intraperitoneal (i.p.) mit einer Mikroinjektion Spritze für die Mäuse. Mäusen wurde durch Inhalator mit 5 % Isofluran für Tiefe Anästhesie betäubt. Wenn Mäuse Rücknahme Aktion der Extremitäten während RTX Injektion zeigten, nehmen Mäuse länger Einatmen der Anästhesie.
    Beispiel: Wenn die Maus 40 g wiegt, dann wird es 20 µL der RTX-Lösung, repräsentieren die Dosis von 50 µg/kg erhalten.
  5. Geben Sie eine Gruppe von Mäusen ein gleiches Volumen des Fahrzeugs (10 % Tween 80 und 10 % absolute Ethanol in Kochsalzlösung), als Kontrolle.
  6. Nach der Injektion RTX zurück die Mäuse zu einem Kunststoffkäfig auf einer 12 h Licht/12-h dunkel-Zyklus und liefern Nahrung und Wasser Ad Libitum.

2. Bewertung der neuropathischen Verhalten

Hinweis: Halten Sie die Tiere in einer komfortablen Umgebung (Schritt 1.6) erlauben Erholung nach der Injektion. Am 7. Tag Post RTX Injektion (D7) führt jedes Tier die Heizplatte und von Frey Haar Filament Tests am selben Tag zur Zeit Bias reduzieren und die Effizienz der behavioral Tests zu fördern. Bringen Sie die Tiere um ein ruhiges Zimmer, das auf eine stabile Luftfeuchtigkeit (40 %) und Temperatur (27 ° C) gehalten wird für die Optimierung von tierischen Akklimatisation und Verringerung der Umweltauswirkungen während der Verhaltens-Prüfung. Stören Sie die Tiere nicht während Testzeiten; die behavioral Tests sind wöchentlich geplant.

  1. Messung der thermischen Latenzen mit der heißen Platte test
    1. Legen Sie das Tier sanft auf eine heiße Metallplatte (27 cm × 29 cm) mit einem transparenten Plexiglas Käfig (Länge × Breite × Höhe: 22 cm × 22 cm × 25 cm; Abbildung 1A). Stellen Sie die Temperatur der heißen Metallplatte auf 52 ° C.
    2. Starten Sie die Dauer der thermischen Latenz des Tieres auf der Heizplatte mit den Schritt-on, eingebaute Timer der Heizplatte zu messen, sobald das Tier Hinterpfoten der heißen Platte berühren, und beobachten Sie die Reaktionen des Tieres Hinterpfoten. Wenn das Tier schütteln zeigt, der Hinterpfoten lecken, oder springen, während auf der Heizplatte entfernen Sie und erfassen Sie die Dauer, die das Tier auf der heißen Platte blieb. Diese Zeitdauer definiert die thermische Latenz des einzelnen Tieres. Erfassen die thermische Wartezeit auf die nächste 0,1 s.
    3. Führen Sie für jede Testsitzung drei Studien mit 30-min-Takt für die Normalisierung der Reaktion nach dem letzten Test der Heizplatte. Wenn das Tier keine Reaktion auf die Heizplatte zeigt, beenden die Sitzung nach 25 s, potentiellen Gewebeschäden zu vermeiden.
  2. Messung von mechanischen Schwelle mit der von Frey Haar Glühfaden testen
    1. Setzen Sie das Tier auf maßgeschneiderte Metallgitter (Maschenweite: 5 mm × 5 mm) mit einem semi-transparenten Zylinder Plexiglas Käfig (Durchmesser: 13 cm; Höhe: 12 cm) (Abbildung 1 b) für die Akklimatisation für mindestens 2 h.
    2. Gelten Sie die unterschiedlichen Kalibern der von Frey Haar Filamente für plantar und Umgebung: die Hindpaw mit der wechselvollen Methode31. Beginnen Sie Erstantrag aus dem mittleren Kraft eines Satzes von Frey Haar Filamente für die Dauer von Filament Anwendung von 5-8 s.
    3. Verwenden Sie ein 2 min Intervall zwischen Filament Anwendungen, tierische Normalisierung zu optimieren. Ändern Sie die angewandte Filament Kraft anhand des Tieres letzte Antwort.
      Hinweis: Eine Reihe von Frey Haar Filamente besteht aus 0.064, 0,085 0.145, 0,32, 0,39, 1,1 und 1,7 g Krafteinleitung. Zum Beispiel wenn Hindpaw Rückzug mit einer Vorspannkraft von 0,32 g aufgetreten ist, dann gelten Sie 0,145 g. In Ermangelung einer Pfote Rückzug wird eine 0,39 g-Kraft angewendet. Dann vier weitere Fäden unterschiedlicher Kräfte gelten basierend auf den vorangegangenen Antworten und die mechanische Schwelle bemisst sich nach einem veröffentlichten Formel31.
    4. Für jeden Test-Session sind die bilateralen Hinterpfoten. Führen Sie drei Versuche für jedes Hindpaw. Den Durchschnitt dieser sechs mechanischen Schwellen als mittlere mechanische Schwelle (mg) eines jeden Tieres ausdrücken.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Maßgeschneiderte Käfig aus Plexiglas und Metall mesh für die Bewertung des neuropathischen Schmerzes im Mausmodell der Resiniferatoxin (RTX)-induzierte kleine Faser Neuropathie. (A, B) Diese Diagramme zeigen die Ausstattung zur Messung (A) die thermische Latenzen durch eine heiße Metallplatte (27 cm × 29 cm) mit einem transparenten Plexiglas Käfig (Länge × Breite × Höhe: 22 cm × 22 cm × 25 cm) und (B) die mechanische Schwelle durch eine individuelle Meta bewerten l-Gitter (Maschenweite: 5 mm × 5 mm) mit einem semi-transparenten Zylinder Plexiglas Käfig (Durchmesser: 13 cm; Höhe: 12 cm) in den Mäusen mit kleine Faser RTX-induzierte Neuropathie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(3) Biopsie Aufbereitung und Auswertung von IENFs Innervation der Haut

  1. Nach Verhalten testen die Tiere mit 5 % Isofluran zu betäuben und die Tiere durch intrakardiale Perfusion mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) (pH 7,4), gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (4P) in 0,1 M PB zu opfern.
  2. Schneiden Sie die erste Wegelagerer die beiden Hinterpfoten nach Perfusion und Post-fixieren sie in 4P für ein weiteres 6 h Übertragung der Straßenräuber Gewebe auf 0,1 M PB bei 4 ° C für die langfristige Lagerung.
  3. Cryoprotect Wegelagerer mit 30 % Saccharose in PB über Nacht und in einer vertikalen plantar Oberfläche Art und Weise in 30 µm dicke Scheiben schneiden. Beschriften Sie die Straßenräuber Abschnitte nacheinander und anschließend zu speichern in Frostschutzmitteln bei-20 ° C.
    Hinweis: Die Frostschutzmittel Zusammensetzung lautet wie folgt: destilliertes Wasser, Ethylen Glyzerin, Glycerin und 2 X PB in einem 3:3:3:1 Verhältnis.
  4. Um ausreichende Probenahme sicherzustellen, wählen Sie jeden dritten Abschnitt die Straßenräuber.
    1. Setzen Sie die gewählten Straßenräuber Abschnitte auf beschichteten Objektträgern und trocknen sie.
    2. Eine Kunststoff-Abdeckung auf die Folie und den Prozess mit standard Immunostaining Verfahren zu decken.
      1. Die Straßenräuber Abschnitte mit 1 % H2O2 in Methanol für 30 min zu stillen und blockieren mit 0,5 % fettfreie Trockenmilch und 0,1 % Triton x-100 in 0,5 M Tris-Puffer (Tris) für 1 h.
      2. Inkubieren Sie Straßenräuber Abschnitte mit Antiseren gegen Pan axonalen Marker, PGP 9.5 (aufgewachsen in Kaninchen, 1:1, 000), über Nacht bei 4 ° c
      3. Brüten Sie Straßenräuber Abschnitte mit einem biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG sekundäre Antikörper bei Raumtemperatur (RT) für 1 h, und dann mit dem Avidin-Biotin-Komplex bei RT 45 min inkubieren.
      4. Visualisieren Sie das Reaktionsprodukt mit 0,05 % 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) Lösung für 45 s. Dann waschen Sie Straßenräuber Abschnitte mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie für die Montage.
        Hinweis: Die primären und sekundären Antiseren werden mit 0,5 % fettfreie Trockenmilch in 0,5 M Tris verdünnt.

(4) DRG Abschnitt Vorbereitung und Auswertung von verletzten kleinem Durchmesser Neuronen

  1. Sezieren die 4th und 5th lumbale DRG und Post-Update für eine weitere 2 h.
  2. Cryoprotect DRG-Gewebe mit 30 % Saccharose in PB über Nacht und nacheinander der 8 µm Dicke schneiden, legen Sie auf Objektträger und Label. DRG-Abschnitte in einem-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren.
  3. Immunostain DRG Abschnitte im 80 µm-Takt um ausreichend Probenahme sicherzustellen.
    1. Führen Sie DRG Immunostaining Verfahren als diejenigen der Straßenräuber Abschnitte, mit Ausnahme der Doppel-Kennzeichnung immunofluorescent Verfahren. Alternativ sind ATF3 (aufgewachsen in Kaninchen, 1: 100), eine Verletzung Marker und Peripherin (aufgewachsen in Maus; 1:800), einem kleinem Durchmesser neuronalen Marker in der primären Antiseren.
    2. Inkubieren Sie DRG-Abschnitte mit der Mischung von primären Antiseren über Nacht bei 4 ° c
  4. Inkubieren DRG Abschnitte mit entweder Texas rot oder Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugiert sekundäre Antiseren (1: 200), entspricht die entsprechende primäre Antiseren bei RT für 1 h und dann zur Quantifizierung montieren.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine neue Maus-Modell der RTX Neuropathie, betrifft insbesondere kleinem Durchmesser Neuronen, einschließlich IENF Degeneration, sensorische Störungen (Abbildung 2) zugeordnet. Nach dem hier beschriebenen Protokoll ausgestellten Tiere thermische Hypoalgesia und mechanische Allodynie D7 Post RTX Injektion. Dieses kleine Faser Neuropathie Modell, drei Dosen von RTX herstellen: 200, 50 und 10 µg/kg i.p Weg verabreicht wurden. Die RTX-...

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Diskussion

Wirksame Therapie der Neuropathie kleine Faser in der Klinik ist erforderlich für die funktionelle Erholung und Lebensqualität der Patienten zu fördern. Derzeit gibt es Mangel an eine therapeutische Anleitung targeting sensorischen Störung kleine Faser Neuropathie aufgrund mangelnder umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen zugrunde liegenden neuronalen Verletzung kleinem Durchmesser zugeordnet. Frühere Modelle der Neuropathie betroffen in der Regel sowohl große und kleine-Durchmesser Sinnesnerven; zum Beispie...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) und Ziel für die Top Universitäten Grant (TP105PR15), Kaohsiung Medical University, Taiwan.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemisches Reagenz
ResiniferatoxinSigmaR8756
Tween 80SigmaP1754
3,3'-DiaminobenzidinSigmaD8001
Avidin-Biotin-KomplexVectorPK-6100
NameCompanyKatalognummerComments
Primary Antisera
PeripherinChemiconMAB-1527
ATF3Santa CruzSC-188
PGP9.5UltraCloneRA95101
< strong>Name<>UnternehmenKatalognummerKommentare
Sekundäre Antiseren
Biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG-VektorBA-1000
Texas Rot konjugierte Ziege Anti-MausJackson ImmunoResearch115-075-146
Isothiocyanat (FITC)-konjugierter Esel Anti-KaninchenJackson ImmunoResearch711-095-152
NameUnternehmen<strong>KatalognummerKommentare
Ausrüstung
HeizplatteIITCModel 39
von Frey FilamentSomedic Sales AB10-600-0001
NameCompany<strong>KatalognummerKommentare
MaterialShandon
AbdeckplatteThermo wissenschaftliche72110017
SchiebegestellThermo wissenschaftliche73310017

Referenzen

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Resiniferatoxin NeuropathieTRPV1 Agonistintraepidermale Nervenfaserthermische Hypoalgesiemechanische AllodynieVon Frey FilamentHot Plate TestDRG GewebeanalyseImmunf rbeverfahren
Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1
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