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Methodenartikel

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

15.1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/56660

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19. November 2017

 , 
1Innovative Technology Laboratories, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, 2Laboratory for Systems Biology and Medicine, RCAST, The University of Tokyo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die sauren Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rollen in Tumorprogression. Um die Auswirkungen des sauren extrazellulären pH auf Krebs Zellen in vitro zu beurteilen haben wir einfache saure Kultur-Systeme etabliert.

Zusammenfassung

Bedingungen der Tumor Mikroumgebung, z. B. Hypoxie oder Nährstoff Hunger, spielen wichtige Rollen in der Tumorprogression und Bösartigkeit. Jedoch wurde die Rolle der sauren extrazellulären pH im Tumor Aggressivität und der zugrunde liegende Mechanismus nicht ausgiebig gegenüber Hypoxie oder Nährstoff verhungern Bedingungen untersucht. Darüber hinaus wurde eine klar definierte Kultur-Methode, um die sauren extrazelluläre Tumor Mikroumgebung imitieren nicht vollständig gemeldet.

Hier präsentieren wir eine einfache in-vitro- Kultur Methode, um beizubehalten, sauren extrazellulären pH mit Bikarbonat und erhöhte Laktat oder HCl-Konzentrationen in das Kulturmedium verringert. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h nach Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Drei unterschiedliche sauren Medien Bedingungen in dieser Studie im Vergleich hoch hochreguliert pH-responsive Gene wie MSMO1, INSIG1und IDI1 zu Hypoxie oder Nährstoff Hunger. Die Hochregulation dieser Gene kann als Marker des sauren pH-Wertes verwendet werden. Diese einfachen Techniken sind vorteilhaft für die zugrunde liegenden Mechanismen der malignen Tumor unter sauren Tumor Mikroumgebung aufzuklären. Unser extrazelluläre sauren pH-Wert-Kultur-System ermöglicht somit, Entdeckung der zellulären sauren pH-Wert Antworten nicht nur in den Krebszellen, sondern auch in Primärzellen, z. B. röhrenförmigen Nierenzellen, in Bezug auf die anderen sauren Störungen einschließlich, diabetische Ketoazidose, Laktatazidose, renale tubuläre Azidose und Respiratorische Azidose.

Einleitung

Der Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rolle in der Tumorprogression und Krebs Zelle Stoffwechsel1,2,3. Krebszellen sind oft an Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoff Entbehrungen und sauren extrazellulären pH (pHe) ausgesetzt. Jedoch die Rolle der PWT in Tumorprogression nicht geklärt so umfassend wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern. PHe im Tumorgewebe werden sauer, etwa pH 6,84,5zu erreichen. Die saure pH-Wert ergibt sich aus aeroben und anaeroben glykolytischen Ausscheidung von Protonen (H+) und Laktat durch wuchernden Krebs Zellen5,6.

Neuere Studien gezeigt, dass sauer pHe-induzierte Histon Deacetylation, Fettsäureoxidation und Exozytose von sauren Lysosomen zur Anpassung an die starken sauren Milieu7,8,9,10. Die Mechanismen, durch welche extrazelluläre Übersäuerung beeinträchtigt jedoch Krebs Verhalten und die Identität des Schlüssels, die Regulierungsbehörden in den sauren pH-Wert Tumor Mikroumgebung nicht vollständig ermittelt wurden. Darüber hinaus mehrere Berichte beschrieben verschiedene sauren pH-Wert-Medien mit unklaren Konzentrationen von Bikarbonat, Tris, Rohre und HEPES-Puffer oder Laktat und HCl, aber es gibt einige Berichte, die Stabilität der die angepasste mittlere noch umfassender zu demonstrieren Vergleich von mehrere verschiedene saure Nährmedien7,8,9,10

Um die wichtigsten Regulatoren und metabolischen Veränderungen in Krebszellen im Rahmen der extrazelluläre Übersäuerung zu erhellen, wir eine einfache in-vitro- Kultur-Modell zur Aufrechterhaltung eines sauren pHe und untersuchte die Rolle von pHe in Krebs Zellen11. Mit dieser Methode, wir erhalten eine saure Kulturmedium mit einem PWT von 6,8 bei 37 ° C weniger als 5 % CO2, mit reduzierten Bicarbonat Konzentrationen in das Kulturmedium. pH 7.4 diente als normal und Medium zu kontrollieren. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h während der Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Da erhöhte Glykolyse beschleunigt die Ausscheidung von Protonen sondern auch Laktat7,8,9, wir auch etabliert eine Kultur-Methode imitiert Laktat-induzierten Azidose durch Hinzufügen von Laktat, anstatt verringern die Bikarbonatkonzentration. HCl-induzierte sauren pHe im Medium ermöglicht darüber hinaus ausschließen, die zelluläre Reaktionen auf sauren pH-Wert Kulturmedium nicht durch eine verminderte Konzentration von Bikarbonat. Mit verschiedenen Medien mit einem pH-Wert von 6,4 bis 7,4 mit verschiedenen Bikarbonatkonzentration, können wir darüber hinaus das Ausmaß der PWT Auswirkungen auf zellulärer Antworten bewerten.

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Protokoll

1. Vorbereitung des sauren Kulturmedium

  1. Vorbereitung des Steuerelements (pH 7,4) und niedrigem pH-Wert (pH 6.8) Kulturmedium
    1. 4,75 g Pulver DMEM ohne L-Glutamin in 500 mL Wasser auflösen.
    2. 0,33 M Nahco33 Lösung in eine Druckdichte Flasche ansetzen.
      Achtung: Es ist wichtig, einen engen Druckflasche zu verwenden, da Nahco33 CO2 -Gas strahlt Wenn erhitzt und thermisch zersetzt.
    3. Autoklav das Medium und Lösung. Lassen Sie diese Puffer auf 25 ° c abkühlen
    4. Fügen Sie 200 mM L-Glutamin, 5 mL von Penicillin-Streptomycin, 5 mL und 50 mL der fötalen Rinderserum, 500 mL DMEM ohne Bikarbonat.
    5. Steuermedium (pH 7,4) fügen Sie hinzu 2,4 mL 0,33 M Nahco33 Lösung pro 100 mL DMEM ohne Bikarbonat. Hinzugeben Sie für mittlere und niedrige pH-Wert (pH 6,8) 0,6 mL 0,33 M Nahco33 Lösung pro 100 mL DMEM ohne Bikarbonat.
    6. Überprüfen Sie die mittlere pH nach 24 h Inkubation bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.
      Hinweis: Die Menge der Nahco33 Lösung muss je nach der mittlere pH-Wert eingestellt werden, die abhängig von der CO2 -Gehalt der Inkubator und Luftdruck unterscheiden können. Im Idealfall zum ersten Mal ist es besser, die mittlere pH mit verschiedenen Konzentrationen von Bikarbonat zu bestimmen, die entsprechende Menge an Nahco33 Lösung DMEM hinzu zu messen.
      1. Kulturmedium sofort nach dem Entfernen der Kulturschale aus dem CO2 Inkubator zu sammeln und den pH-Wert mit einem pH-Meter zu messen. Halten Sie die mittlere Temperatur bei 37 ° C mit einem Wasserbad, wenn nötig. Messen des mittlere pH-Werts dreimal unabhängig.
        Hinweis: Nahco33 Lösung sollte bei 4 ° C gelagert werden und jedes Medium sollten frisch zubereitet. Im Handel erhältliche Produkte, die in dieser Studie verwendet werden können sind in Tabelle Materialienaufgeführt.
  2. Vorbereitung Laktat-induzierte oder HCl-induzierte sauren Kulturmedium
    1. 100 mL des Steuermediums (vorbereitet in Schritt 1.1.5) fügen Sie 74 µL Laktat-Lösung oder 125 µL 1 M HCl hinzu.
    2. Überprüfen Sie die mittlere pH nach 24 h Inkubation bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.
      Hinweis: Die Menge an Laktat oder HCl-Lösung muss auch nach der mittlere pH-Wert eingestellt werden, die abhängig von der CO2 -Gehalt in den Inkubator und Luftdruck unterscheiden können. Im Idealfall ist es besser, die mittlere pH mit seriellen Laktat oder HCl-Konzentration zu bestimmen, den entsprechenden Betrag für die Anpassung an den gewünschten pH-Wert des Mediums zu messen.

(2) die Ernte und die Behandlung von Zellen

  1. Kultivierung von Zellen bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 mindestens 1 Woche vor der Durchführung Experimente zu starten.
    Hinweis: Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien sind in Tabelle Materialienaufgeführt.
  2. Durchgang-Zellen, wenn sie 70-90 % Konfluenz zu erreichen. Lassen Sie sich nicht die Zellen konfluierende werden. Verändern Sie das Medium alle 2-3 Tage beim täglichen Anbau.
  3. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 5 mL PBS. Aspirieren der PBS und fügen Sie trennen Enzym wie 1 mL Trypsin.
  4. Inkubation bei 37 ° C, bis die Zellen gerundet sind und anfangen zu lösen.
  5. Die freistehenden Zellen 5 mL Kulturmedium hinzu und deaktivieren Sie Enzym zu. Übertragen der Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3 min bei 300 X g. Aspirat überstand und wieder auszusetzen, die Zellen mit Nährmedium.
  6. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hemocytometer und Trypan blau.
  7. Samen 5.0 x 105 Zellen/nun von einer 10-cm-Schüssel in 10 mL Medium. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.
  8. Aspirieren Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen mit 5 mL PBS, und 10 mL sauren Kulturmedium in Abschnitt 1 vorbereitet. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.

3. RNA Isolierung

  1. Aspirieren Sie Kulturmedium und waschen Sie Zellen mit 5 mL PBS. Stören die Zellen durch Zugabe von RNA-Extraktion-Reagenz (siehe Tabellen der Materialien).
  2. Kratzen Sie die Schüssel kurz, dann entfernen Sie das RNA-Extraktion-Reagenz mit einer Pipette und hinterlegen Sie die RNA Extraktion Reagenz/Zelle lysate in einem 1,5 mL-Tube. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
  3. Fügen Sie 250 µL Chloroform und schütteln Sie das Rohr für ca. 15 S. lassen bei Raumtemperatur für 5 min und Zentrifuge auf ≥8, 000 X g für 5 min. kräftig.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Phase mit einer Pipette. Einige der wässrigen Phase hinter sich zu lassen. Legen Sie in einem anderen 1,5 mL-Tube.
  5. Die wässrige Phase 550 µL Isopropanol hinzufügen und vorsichtig mischen. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (≥20, 000 X g) für 20 min bei 4 ° C.
  6. Gießen Sie das Isopropanol und fügen Sie 1 mL 75 % Ethanol in DEPC Wasser behandelt. Mischen Sie vorsichtig. 8.000 x g für 5 min zentrifugieren.
  7. Pipette aus Ethanol und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen.
  8. Fügen Sie (je nach Ausbeute) ca. 15-25 µL DEPC Wasser zu den RNA-Pellet aufbereitet. Mischen Sie gründlich.
  9. Messen die Konzentration der isolierten RNA durch die Messung der OD bei 260 nm mit einem Spektralphotometer.

(4) cDNA Synthese

  1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einer PCR-Reaktion-Röhre: bis zu 5 µg Gesamt-RNS, 1 µL Oligo-dT (50 µM) oder zufällige Primer-Mischung (60 µM) 1 µL 10 mM dNTP und Nuklease-freies Wasser auf ein Gesamtvolumen von 14 µL.
  2. Mischen und kurz Zentrifugieren Sie die Komponenten mit einer kleinen Benchtop-Zentrifuge (~ 5 s). Denaturieren Sie die Probe RNA/Primer für 5 min bei 65 ° C. Drehen Sie kurz (~ 5 s) mit einem kleinen Benchtop Zentrifugieren und setzen die Probe sofort für mindestens 1 min auf Eis.
  3. Fügen Sie die folgenden Komponenten: 4 µL 5 x Reverse Transkription Puffer, 1 µL Reverse Transkriptase (200 U/µL) 1 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL).
    Hinweis: Beispiele von handelsüblichen Kits werden in Tabelle der Materialien angezeigt.
  4. Röhrchen, mischen, und dann kurz den Inhalt mit Hilfe einer kleinen Benchtop-Zentrifuge Zentrifugieren (~ 5 s). Inkubieren Sie die kombinierte Reaktionsmischung bei 50-55 ° C für 10 min.
  5. Inkubation bei 80 ° C für 10 min, um die Reaktion zu inaktivieren.

5. Messung der Säure eine geschlechtergerechte Genexpression mittels Real-Time PCR

  1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einer Reaktion 384-Well-Platte: 1 µL Vorlage cDNA, 0,75 µL 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM nach vorne Grundierung, 0,3 µL 50 µM reverse Primer, 1 µL Taq Polymerase, 2,5 µL 10 x Taq Polymerase-Puffer, 2,5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL Wasser.
    Hinweis: Beispiel für kommerziell erhältlichen Kits sind in Tabelle Materialiengezeigt. Der Primer ist in Tabelle 1aufgeführt. Eine Reaktion der 96-Well-Platte kann auch in diesem Schritt verwendet werden. Andere Sonden (z.B. Taqman Sonde) können auch verwendet werden.
  2. Richten Sie das Experiment und die folgenden PCR-Programm auf einem Real-Time PCR System: 50 ° C für 2 min, 1 Zyklus; 95 ° C für 10 min, 1 Zyklus; 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min, 40 Zyklen; 95 ° C für 15 s, 1 Zyklus; 60 ° C für 15 s, 1 Zyklus; 95 ° C für 15 s, 1 Zyklus.
  3. Legen Sie die Platte in der qPCR-Instrument. Starten Sie das Programm.
    Hinweis: Hochregulation der pH-Wert responsive Gene MSMO1, INSIG1und IDI1 können durch Protein-Spiegel gemessen werden.

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Ergebnisse

Um die geeignete Bicarbonat-Konzentration zu bestimmen, wir DMEM im Bereich von 0 - 8 mM Nahco33 (Endkonzentration in das Kulturmedium) vorbereitet und ist es gelungen, bei der Vorbereitung von Nährmedien mit pH-Wert von 6,4-7,4 (Abbildung 1). Wir vorbereitet DMEM mit 8 mM Nahco33 (pH 7,4) als Steuermedium und 2 mM Nahco33 (pH 6.8) als Medium mit sauren pH-Wert nach einem vorherigen Bericht besagt, dass der extrazelluläre pH p...

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Diskussion

Wir hier eine einfache sauren pH-Wert Kultursystem und seine Bewertung. Die Kombination der drei Methoden der mittleren Versauerung, d.h.reduzierte Bikarbonatkonzentration, Laktat-Zusatz und HCl hinaus ermöglichte, die pH-Wirkungs-Mechanismus gründlich zu untersuchen und die zelluläre Antwort auf andere Tumor vergleichen microenvironmental Erkrankungen wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern.

Der Schlüssel dieser Methode ist, die entsprechenden Konzentrationen von Bikarbonat, Laktat und...

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Offenlegungen

Der Autor Ayano Kondo ist ein Mitarbeiter von Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Danksagungen

Wir danken die Mitgliedern des Division of Genome Science and Laboratory für Systembiologie und Medizin, RCAST, The University of Tokyo. Wir danken vor allem Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSMB, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida und Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) für hilfreiche Gespräche und Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (A) (26710005, T.O.), Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (26116711 und 16 H 01567, T.O.) und Beihilfe für anspruchsvolle
Explorative Forschung (16K 14605, T.O.) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan, der Takeda Science Foundation (T.O.), Kobayashi Stiftung Krebsforschung (T.O.) und das Projekt für die Krebsforschung und Therapeutischen Evolution (P-erstellen) und die praktische Forschung für Innovative Krebsbekämpfung aus Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED (T.O.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ReagenzienDulbecco's
Modifiziertes Eagle Medium" Nissui" 2Nissui05919
Fötales RinderserumThermo Fisher10438
NaHCO3Wako191-01305
L-GlutaminlösungThermo Fisher25030-081
(stabilisiert)Nacalai09367-34
0,5 g/l-Tripsin/0,53 mmol/l-EDTA-Lösung, mit PhenolrotNacalai32778-05
0,5%-Trypanblau-FleckenlösungNacalai29853-34
MilchsäurelösungSigma-Aldrich252476
SalzsäurelösungSigma-AldrichH9892
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134
SuperScript IV Erststrang-SynthesesystemThermo Fisher18091
Power SYBR Green PCR Master MixAngewandte Biosysteme4368702 
Name<>UnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
<>Zelllinien
PANC-1ATCCCRL-1469
AsPC-1ATCCCRL-1682
KMS-6JCRB Zellbank
TIGJCRB Cell Bank
MRC9ATCCCCL-212
HUVECATCCCRL-1730
Name<strong>CompanyKatalognummer>
Ausrüstung
NanoDrop One Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer mit Wi-FiThermo FisherND-ONE-W
QuantStudio 5 Echtzeit-PCR-SystemThermo FisherCRL-1682
Penicillin-Streptomycin-Mischlösung JCRB0432

Referenzen

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